Aislamiento de células individuales de embriones tempranos de Xenopus y clasificación por tamaño

Resumen

Describimos un método para aislar células individuales de embriones tempranos de Xenopus laevis y clasificarlas por tamaño celular.

Resumen

La embriogénesis temprana requiere una disminución exponencial del tamaño celular, mientras que el embrión permanece constante en tamaño en las primeras etapas del desarrollo. La importancia funcional y los mecanismos por los que el tamaño celular influye en el desarrollo embrionario siguen estando en gran medida poco estudiados. El embrión temprano de Xenopus proporciona un sistema único para cubrir estas grandes lagunas. En comparación con otros organismos modelo, el embrión temprano de Xenopus es extremadamente grande y contiene un gradiente de tamaño celular, desde células pequeñas en el polo animal hasta células grandes en el polo vegetal, a lo largo de todo el embrión en etapas alrededor de la transición a la mitad de la blástula. Aquí describimos un protocolo para disociar células individuales de embriones tempranos de Xenopus y clasificarlas por tamaño utilizando coladores celulares con poros de malla variables. Según lo determinado por imágenes y mediciones de tamaño, las células clasificadas están dentro del rango de tamaño esperado y pueden usarse para análisis o secuenciación de células vivas, o fijarlas para imagen. Este sistema arrojará nueva luz sobre cómo revelar mecanismos regulatorios dependientes del tamaño durante el desarrollo inicial.

Introducción

El cambio en el tamaño celular es una característica común en la embriogénesis temprana, cuando el óvulo fertilizado sufre múltiples rondas de escisión, generando un número creciente de células. Aunque se sabe mucho sobre el papel del tamaño celular como parámetro principal que controla las funciones^{celulares 1,2,3}, cómo el tamaño celular afecta al desarrollo temprano es menos conocido. Trabajos recientes en varios sistemas embrionarios modelo sugieren que el tamaño celular regula la activación del genoma cigótico (ZGA⁾⁴ y la especificación de destino celular⁵, apoyando un papel importante del tamaño celular en las decisiones de desarrollo ^6,7.

El embrión temprano de Xenopus es un modelo importante para estudiar la toma de decisiones del desarrollo regulada por el tamaño celular. Dado que el embrión temprano de Xenopus es grande (~1,2 mm de diámetro), es fácil manipular su tamaño físicamente, lo que lo hace útil para evaluar las consecuencias directas del cambio de tamaño celular. Por ejemplo, se pueden generar mini embriones de tamaños variados mediante la constricción de embriones de célula 1 usando los lazos^{pilosos 4,8}, demostrando la ZGA dependiente^{de la dosis 4}. Además, el embrión temprano de Xenopus contiene un gradiente de tamaños celulares a lo largo del eje animal-vegetal, con las células más pequeñas en el polo animal y las más grandes en el polo vegetal, demostrando una diferencia de más de 100 veces en el volumen⁴. Es importante destacar que, al visualizar y cuantificar directamente los transcritos nacientes en células individuales de embriones de montaje completo, identificamos un umbral de tamaño celular que regula^{ZGA 4}. Además, el aislamiento de células individuales de embriones tempranos de Xenopus y su clasificación por tamaño confirmaron la importancia del umbral de tamaño celular^{ZGA 4}.

Aquí describimos los procedimientos detallados para aislar células individuales de embriones tempranos de Xenopus laevis y clasificarlas por tamaño. Los embriones tempranos de Xenopus pueden disociarse en células individuales incubándolas en un medio libre de Ca²⁺, Mg²⁺ (CMFM^)9, y estas células individuales pueden clasificarse además usando coladores celulares con diferentes tamaños de poro de malla. Las células clasificadas pueden purificarse y utilizarse en diversas aplicaciones, incluyendo el análisis de células vivas, la secuenciación o los ensayos de imagen.

Protocolo

El trabajo con animales aquí descrito ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Carolina del Sur.

1. Preparación de la solución

NOTA: Antes de iniciar el protocolo, prepare las siguientes soluciones.

1. Prepara 20× MMR: mezcla 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM_{MgCl 2} y 40 mM_{CaCl 2}. Ajusta el pH a 7,8 con NaOH. Autoclave y guarda a temperatura ambiente.
2. Preparar medium libre Ca²⁺, Mg²⁺ (CMFM): Mezcla 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM_{Na 2HPO 4}, 0,9 mM KH₂PO₄, 2,4 mM_{NaHCO 3} y 1,0 mM EDTA. Ajusta el pH a 7,4, si es necesario. Autoclave y guarda a temperatura ambiente.
3. Prepara un gel de agarosa al 1,5% en una placa de Petri de 60 mm: Añade 0,75 g de agarosa a 50 mL de CMFM. Calienta para disolver la agarosa en un microondas. Añade entre 5 y 10 mL de gel de agarosa para cubrir una capa fina en una placa de Petri de 60 mm.
4. Prepara un medio con gradiente de densidad (wt/vol)/CMFM: Añade lentamente 15 g de medio gradiente de densidad a 100 mL de CMFM. Para facilitar la disolución, calienta y remueve en una placa hasta que el medio de gradiente de densidad se disuelva por completo. Mantén la solución a 4 °C hasta la utilización.
5. Preparar 4% de PFA/1× MEM: Mezclar 1 vial (10 mL) de stock de paraformidído al 16% y 4 mL de 10× de MEM (1000 mM de pH 7,4, 20 mM de EGTA y 10 mM de_{MgSO 4}). Añade agua ultrapura a 40 mL.
   NOTA: Para obtener embriones de Xenopus , sigue un protocolo estándar para realizar la fertilización in vitro (FIV) (por ejemplo, véase Sive et al., 2007)¹⁰. El embrión debería estar en 0,1× MMR listo para su uso.

2. Disociar embriones tempranos en células individuales

1. Añade ~15 mL de CMFM a una nueva placa de Petri de 60 mm recubierta con gel de agarosa al 1,5%. Utiliza una pipeta de transferencia de plástico para transferir entre 10 y 100 embriones (según las necesidades experimentales) al recipiente. Pon el plato bajo un estereomicroscopio.
2. Utiliza pinzas con ambas manos para retirar cuidadosamente la membrana de vitelina, sujetándola en la superficie de los embriones con una pinza y pelándola con la otra. Evita dañar los embriones durante el proceso.
3. Incuba los embriones desvitelados en el CMFM durante ~1 hora a temperatura ambiente. Sacude el plato muy suavemente cada 5 minutos para facilitar la disociación de las células. Revisa regularmente hasta que no se vean montones de blastómeros (Figura 1).

3. Ordenar las células disociadas por tamaño

1. Durante la disociación de los blastómeros, sumergir los teñidores celulares (40 μm, 70 μm y 100 μm) en placas de Petri individuales llenas de CMFM (Figura 2). Coloca los platos en el orden de izquierda a derecha según se indique. También incluye dos platos más llenos de CMFM entre los grupos para un lavado breve de los teñidos de celda durante cada clasificación.
2. Gira suavemente el plato que contiene los blastómeros aislados para enriquecerlos en el centro del plato. Transfiere cuidadosamente los blastómeros al tintidor de 40 μm en CMFM.
3. Sacude suavemente el colador varias veces para que los blastómeros < 40 μm se asienten a través del colador. Luego mueve rápidamente el colador de 40 μm al plato relleno de CMFM para un lavado breve. Transfiere cuidadosamente los blastómeros del colador de 40 μm, que están > 40 μm, al colador de 70 μm.
4. Repite los pasos hasta que los blastómeros estén clasificados en el colador de 100 μm.
5. Remueve suavemente cada plato con blastómeros para enriquecerlos en el centro del plato. Transfiera cuidadosamente los blastómeros (~4 mL) a la parte superior de 0,5 mL de medio con gradiente de densidad al 15% en un tubo de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (Figura 3). Evita mezclar.
6. Deja reposar el tubo 10 minutos. Los blastómeros intactos se depositarán en el fondo por gravedad, separándose de los glóbulos vitelinos de los blastómeros reventados durante la clasificación y transferencia (Figura 3).
7. Dependiendo del propósito de los experimentos posteriores, proceder con el análisis de células vivas, congelar los blastómeros en nitrógeno líquido para trabajar con ARN o fijar los blastómeros para la inmunotinción (Figura 3).

Resultados

Los embriones de Xenopus laevis (n = 50) en la etapa 9 fueron incubados en el medio CMFM para disociarse en blastómeros individuales siguiendo este protocolo (véase un ejemplo en la Figura 1). Los blastómeros individuales disociados se clasificaron secuencialmente utilizando los coladores celulares de 40 μm, 70 μm y 100 μm como se describió anteriormente. La mezcla de control sin clasificar y los blastómeros individuales clasificados fueron fijados ...

Discusión

El tamaño celular es fundamentalmente importante para las funciones^{celulares 3}, y su impacto en el desarrollo temprano requiere un mayor escrutinio en sistemas embrionarios modelo. Aquí hemos descrito los detalles para aislar células individuales de embriones tempranos de Xenopus laevis y clasificar las células por tamaño usando coladores celulares, potencialmente aplicables para estudios de tamaño celular. Este método nos ha permitido proporcionar eviden...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16% Paraformaldehído (PFA)	EMS	15710-S	Para crear la solución fijadora
Placas de Petri desechables de 60 mm	VWR	25384-092	Para incubar embriones
Estereoscópicos Zoom ACCU-SCOPE 3075	VWR	470351-130	Para visualizar embriones
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9414	Para recubrir placas de Petri
Colador celular, 100 y micro; m	VWR	76327-102	Para ordenar celdas por tamaño
Filtro celular, 40 y micro; m	VWR	76327-098	Para ordenar celdas por tamaño
Filtro celular, 70 y micro; m	VWR	76327-100	Para ordenar celdas por tamaño
Pipetas de transferencia desechables	VWR	414004-035	Para transferir embriones
Pinza Dumont, Estilo 5	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72701-D	Para eliminar la membrana vitelina
Placa de Petri de vidrio, 60 y más veces; 15 mm	VWR	75845-542	Para incubar embriones