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Artículo de método

Secuenciación multi-locus para tipificación de deformación de Toxoplasma gondii

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DOI:

10.3791/70645

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26 de mayo de 2026

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1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para identificar y genotipar rápidamente cepas de Toxoplasma gondii utilizando la secuenciación nanopore portátil de marcadores genéticos seleccionados, permitiendo la identificación escalable y dirigida de cepas en aislados mantenidos en laboratorio, con posible aplicación futura en entornos de vigilancia.

Resumen

Toxoplasma gondii es un parásito apicomplejo distribuido globalmente caracterizado por una considerable diversidad genética, lo que requiere enfoques moleculares precisos para la discriminación de cepas. El objetivo de este protocolo es establecer un flujo de trabajo reproducible para la genotipificación multilocus dirigida de aislados cultivados de T. gondii . El procedimiento implica propagación in vitro de cepas representativas de Tipo I (RH) y Tipo II (ME49), extracción de ADN genómico, amplificación específica de locus de los genes SAG2 y SAG3 , y análisis basados en secuenciación para detectar polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) y eventos de inserción/deleción (INDEL). Los datos de secuenciación se procesan para generar secuencias de consenso de alta confianza y para realizar alineaciones comparativas para la identificación de polimorfismos específicos de la cepa. La aplicación de este flujo de trabajo a cepas arquetípicas demostró alta eficiencia de mapeo, profundidad de lectura consistente entre loci objetivo y recuperación precisa de tamaños esperados de amplicones, confirmando la detección fiable de la variación genética a nivel de locus. Aunque la asignación completa de genotipos requiere la inclusión de marcadores estandarizados adicionales, este protocolo proporciona un marco escalable y reproducible para la caracterización genética dirigida de aislados de T. gondii mantenidos en laboratorio y soporta un análisis consistente de secuencias multi-locus.

Introducción

Toxoplasma gondii es un parásito apicomplejo distribuido globalmente y una importante amenaza zoonótica transmitida por alimentos y agua, capaz de infectar prácticamente a todos los animales de sangre caliente, siendo los felinos los huéspedesdefinitivos 1. La infección en humanos y animales suele producirse por la ingestión de quistes tisulares o ooquistos esporulados, y la capacidad del parásito para alternar entre las etapas de taquizoíta y bradizoita permite una persistencia a largo plazo en los tejidos neurales y musculares, contribuyendo tanto a la transmisión por la carne como a la ambiental 2,3.

Aunque en Europa y Norteamérica predominan tres linajes clonales (Tipos I, II y III), se ha documentado una amplia diversidad genética, incluyendo cepas atípicas y recombinantes, a nivel global, especialmente en regiones con ricos reservorios de faunasilvestre 4. Por tanto, una discriminación precisa de cepas es esencial para esclarecer la dinámica de transmisión, investigar brotes y comprender la epidemiología regional. Los enfoques tradicionales de genotipado como PCR-RFLP, la tipificación de secuencias multilocus basada en Sanger (MLST) y el análisis de microsatélites han contribuido sustancialmente a nuestra comprensión de la estructura poblacional de T. gondii , pero están limitados en resolución, rendimiento y capacidad para detectar variaciones intra-genotipos. Estos enfoques suelen requerir múltiples reacciones separadas y pueden no detectar inserciones, eliminaciones o haplotipos complejos dentro de loci1 polimórficos. La secuenciación de nueva generación (NGS) de lectura corta ha mejorado la detección de variantes raras, pero sigue limitada para identificar cambios estructuralescomplejos 4.

Las plataformas de secuenciación de lectura larga, especialmente Oxford Nanopore Technologies, ofrecen ahora la capacidad de generar lecturas continuas de alta precisión adecuadas para resolver variantes estructurales y loci5 altamente polimórficos. Su portabilidad, capacidad de análisis en tiempo real y compatibilidad con flujos de trabajo basados en amplicones los convierten en herramientas prometedoras para aplicaciones de campo e investigaciones debrotes 6. A pesar de estas ventajas, los flujos de trabajo estandarizados de lectura larga multi-locus para la genotipado rutinario de T. gondii siguen siendo limitados.

Para cubrir esta brecha, establecimos un flujo de trabajo escalable de secuenciación de amplicones de lectura larga dirigido a dos loci polimórficos (Figura 1). Combinado con una canalización de pulido por consenso y llamada de variantes, este enfoque permite una detección precisa de SNPs e INDELs, apoyando la discriminación a nivel de deformación. El protocolo es adecuado para laboratorios equipados para amplificación por PCR y secuenciación de lectura larga, y ha sido validado utilizando aislados cultivados. Aunque la adaptación a muestras clínicas o ambientales primarias puede ser factible, tales aplicaciones requieren optimización y validación adicionales. En conjunto, este flujo de trabajo proporciona un marco estructurado para la caracterización molecular dirigida y puede apoyar investigaciones epidemiológicas.

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Protocolo

Este estudio utilizó cepas de parásitos de laboratorio establecidas y líneas celulares de fibroblastos humanos obtenidas comercialmente. No participó directamente en humanos ni animales.

NOTA: Salvo que se especifique lo contrario, los buffers y reactivos utilizados en este protocolo se suministran dentro de los kits comerciales listados en la Tabla de Materiales.

1. Selección de biomarcadores

  1. Descarga las secuencias genómicas de SAG2 y SAG3 en formato FASTA desde la base de datos genómica ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. Realiza alineamientos de secuencias por parejas usando EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Selecciona regiones de amplicones ≤1.600 pares de bases (pb) para minimizar el tiempo de secuenciación y asegurar una amplificación eficiente por PCR.
  4. Asegúrate de que cada región contenga SNPs informativos o polimorfismos INDEL para la diferenciación de cepas.

2. Cultivo y extracción de taquizoítas de Toxoplasma gondii

  1. Mantenimiento de cultivos celulares hospedadores
    1. Obtén fibroblastos del prepucio humano (HFFs) de una fuente comercial certificada y cultivalos en un medio de crecimiento completo compuesto por el Medio Águila Modificado de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina-estreptomicina.
    2. Incubar cultivos a 37 °C con un 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.
  2. Mantenimiento y expansión de líneas parasitarias.
    1. Infectar monocapas de fibroblastos en una confluencia del 80–90% usando taquizoítos con una multiplicidad de infección de 1–3 parásitos por célula huésped. Para un matraz de T25 que contenga aproximadamente 1 ×10 6 fibroblastos, añadir 1–3 × 106 taquizoitas.
    2. Examina los cultivos diariamente usando un microscopio de luz invertida con un aumento del 20× o 40×. Identificar la lisis de la célula huésped observando la disrupción generalizada de una monocapa.
      NOTA: No utilice cultivos de fibroblastos más allá del pasaje 20 para evitar artefactos relacionados con el cultivo.
    3. Extracción de taquizoítas.
      1. Recoge cultivos cuando la lisis de la célula huésped sea visible ≥90%.
      2. Centrifugar a 1.300 × g durante 10 minutos a 4 °C.
      3. Resuspende el pellet en 10 mL de solución fisiológica estéril protegida con fosfato mediante pipeteo suave, y centrifuga de nuevo a 1.300 × g durante 10 minutos a 4 °C. Repite una vez más.

3. Extracción de ADN genómico y generación de amplicones

  1. Extraer ADN genómico utilizando un kit de purificación genómica de ADN basado en columna desílice 7. ADN de eluto en un tampón de elución de 50 μL.
  2. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro de microvolumen.
  3. Almacenar ADN a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o a −20 °C para almacenamiento a largo plazo.
  4. Prepara las reacciones PCR utilizando una mezcla maestra de ADN polimerasa de alta fidelidad, cebadores específicos para el locus (Tabla suplementaria 1) y agua libre de nucleasa.
  5. Realizar amplificación por PCR utilizando un ciclador térmico calibrado bajo las siguientes condiciones de ciclo: (a) desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s, (b) 35 ciclos a 98 °C durante 10 s; recocido específico del locus: 60 °C para SAG2, 68 °C para SAG3, 30 s; 72 °C durante 20 s, (c) Extensión final: 72 °C durante 2 minutos.
  6. Verifica los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%.
  7. Purificar los productos de PCR utilizando un sistema de PCR basado en columna y un sistema de extracción por gel según las instrucciones delfabricante 8. ADN de eluto en 15–20 μL de tampón de elución.
    NOTA: La eficiencia y el rendimiento de la PCR pueden verse reducidos por baja calidad de plantilla de ADN, concentración o condiciones de reacción subóptimas. Si el rendimiento del amplicón es bajo, se verifica la integridad de la plantilla de ADN usando electroforesis en gel de agarosa y la concentración y pureza con un espectrofotómetro. Las temperaturas de recocido por PCR y las concentraciones de cebadores también deben optimizarse para los pares de cebadores utilizados, y el número del ciclo de PCR debe incrementarse según sea necesario.

4. Preparación de la biblioteca para secuenciación de lecturas largas

  1. Reparación final y dA-tailing
    1. Descongela todos los reactivos y mezcla bien en vórtice. Diluir la muestra de control de ADN con 10,5 μL de tampón de elución solo durante el primer uso y mantenla en hielo.
      NOTA: Siempre haz las perlas magnéticas de vórtice bien antes de cada uso.
      PRECAUCIÓN: No pongas en vórtice la mezcla enzimática End-Prep; Mezcla suavemente pipeteando.
    2. Pipetear 200 fmol (~130 ng para un fragmento de 1 kb) de cada muestra de ADN en tubos PCR de 0,2 mL y ajustar el volumen a 11,5 μL con agua sin nucleasa.
    3. Añade 1 μL de muestra de control de ADN diluido por tubo y mezcla pipeteando entre 10 y 20 veces.
    4. Prepara una mezcla maestra de preparación final por muestra que contenga 1,75 μL de tampón de reacción y 0,75 μL de mezcla enzimática (incluyendo un 5% de exceso).
    5. Añade 2,5 μL de mezcla master a cada muestra, mezcla suavemente y reduce el centrifugado brevemente.
    6. Incubar en un ciclador térmico a 20 °C durante 5 minutos, seguido de 65 °C durante 5 minutos.
  2. Purificación del ADN preparado por extremos
    1. Transfiere la reacción de 15 μL a un tubo microcentrífuga de baja unión al ADN de 1,5 mL.
    2. Añade 15 μL de perlas magnéticas resuspendidas, mezcla suavemente y centrifuga brevemente.
    3. Incuba muestras en un mezclador rotador durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Prepara un 80% de etanol fresco para lavar.
    5. Coloca los tubos en una rejilla magnética hasta que las perlas se compriman y retira el sobrenadante con cuidado.
    6. Lava las perlas dos veces con 200 μL de etanol al 80%.
      NOTA: Deja que las cuentas se formen completamente en pellets y luego retira cuidadosamente el etanol.
    7. Secar cuentas al aire durante ~30 s; Evita que se sequen en exceso para evitar que se agrieten.
    8. Suspender las perlas en agua libre de nucleasa de 10 μL e incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    9. Coloque los tubos sobre una rejilla magnética y transfiera 10 μL de eluato a un tubo de microcentrífuga limpio y de baja unión a ADN.
    10. Mide la concentración de ADN usando 1 μL en un espectrofotómetro.
  3. Código de barras nativo
    1. Mezcla maestra de Blunt/TA Ligasa, EDTA, búfer de fragmentos cortos (SFB) y códigos de barras nativos (NB01–NB24).
    2. Asigna códigos de barras individuales a las muestras 1–24.
    3. Ensambla la reacción del código de barras con ADN preparado al extremo de 7,5 μL, código de barras nativo de 2,5 μL y mezcla maestra Ligasa Blunt/TA de 10 μL
    4. Mezcla bien pipeteando entre 10 y 20 veces.
    5. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente y terminar la reacción con 4 μL de EDTA, mezclar bien pipeteando y centrifugar brevemente.
    6. Agrupa muestras con código de barras en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL con bajo ADN. Añadir perlas magnéticas al 0,4× del volumen total de muestras agrupadas (por ejemplo, añadir 230 μL de perlas a 575 μL de ADN agrupado). Mezcla bien pipeteando y luego incuba en un batidor rotador a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    7. Lava las perlas con 700 μL de Short Fragment Buffer (SFB). Gira las perlas para que las vuelvan a suspender, centrifuga hacia abajo, luego devuelves la muestra al soporte magnético y deja que las perlas se formen en pellet. Retira el buffer con una pipeta y luego desétalo.
    8. Repite el paso anterior.
    9. Centrifuga y vuelve a colocar el tubo en el soporte magnético. Elimina cualquier tampón residual.
    10. Retira el tubo del soporte magnético y vuelve a suspender el pellet en 35 μL de agua libre de nucleasa haciendo un suave golpeteo.
    11. Incubar a 37 °C durante 10 minutos con mezcla intermitente, luego transferir el eluato a un tubo microcentrífuga limpio de baja unión al ADN.
  4. Ligación de adaptadores y limpieza de la biblioteca
    1. Ensamblar la reacción de ligación con ADN agrupado con código de barras de 30 μL, adaptador nativo de 5 μL, búfer de ligadura de 10 μL (5×) y ligasa de ADN T4 de 5 μL.
    2. Mezcla bien la reacción pipeteando suavemente y girando brevemente hacia abajo. Incuba la reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    3. Añade 20 μL de perlas magnéticas resuspendidas a la reacción y mezcle pipeteando. Incuba en una batidora rotadora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    4. Centrifuga la muestra y la pastilla en el soporte magnético. Mantén el tubo en el imán y quita la pipeta del sobrenadante.
    5. Lava las perlas añadiendo un Short Fragment Buffer (SFB) de 125 μL. Gira las cuentas para que las vuelvan a suspender, gira hacia abajo, luego devuelves el tubo al soporte magnético y deja que las cuentas se replieguen en pellet. Retira el sobrenadante usando una pipeta y luego desétalo.
    6. Repite el paso anterior.
    7. Centrifuga y vuelve a colocar el tubo sobre el imán. Elimina cualquier sobrenadante residual. Retira el tubo del soporte magnético y vuelve a suspender el perdigón en un Buffer de Elución (EB) de 15 μL.
    8. Centrifuga y incuba durante 10 minutos a 37°C. Agita la muestra cada 2 minutos con un suave movimiento durante 10 segundos para fomentar la elución del ADN.
    9. Pelleta las cuentas sobre un imán hasta que el eluado esté claro e incoloro, durante al menos 1 minuto.
    10. Retirar y conservar 15 μL de eluado que contiene la biblioteca de ADN en un tubo microcentrífuga limpio de 1,5 mL de baja unión al ADN.
    11. Cuantifica la biblioteca final usando un espectrofotómetro.

5. Preparación de células de flujo y secuenciación de nanoporos

  1. Preparación de la celda de flujo
    1. Inspecciona la celda de flujo y confirma ≥80 poros activos.
    2. Prepara la mezcla de cebado combinando 117 μL de solución de enjuague con 3 μL de solución de anclaje en un tubo de microcentrífuga para un volumen total de 120 μL. Mezcla suavemente pipeteando para evitar la introducción de burbujas de aire. Carga lentamente toda la mezcla de cebado de 120 μL en el puerto de cebado de la celda de flujo, asegurando que no se introduzcan burbujas de aire durante la carga.
  2. Carga y secuenciación de bibliotecas
    1. Prepara la mezcla de secuenciación combinando 15 μL de Buffer de Secuenciación (SB), 10 μL de perlas de biblioteca (LIB) y 5 μL de biblioteca de ADN. Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo 3–5 veces para evitar que se formen burbujas. La mezcla de secuenciación resultante de 30 μL está lista para cargar o puede ajustarse a 45 μL si es necesario.
    2. Carga lentamente 30–45 μL de la mezcla de secuenciación en el puerto de la celda de flujo dispensando la solución en dirección a gota.
      PRECAUCIÓN: Evita introducir burbujas de aire y no permitas que la punta de la pipeta toque la membrana. Cierra bien el puerto de carga después de dispensar.
    3. Empieza a secuenciar con la llamada de base en tiempo real activada y monitoriza la actividad de los poros.
    4. Continuar la secuenciación hasta alcanzar una cobertura del ≥500× por amplicón (recomendada ≥1000×), para asegurar una profundidad de lectura suficiente para una llamada de base precisa, generación fiable de secuencias por consenso y detección segura de variantes de baja frecuencia.
      NOTA: Si es evidente una baja cobertura de secuenciación, asegure una entrada de amplicón de alta calidad a la concentración requerida, suficientes poros de celda de flujo activo y extienda la secuenciación para alcanzar la cobertura recomendada.

6. Procesamiento de datos y análisis de variantes

  1. Llamada de bases y desmultiplexación
    1. Realizar llamadas de bases de alta precisión usando software asociado a la plataforma con ajustes de alta precisión por defecto para generar archivos FASTQ por muestra. El demultiplex lee por código de barras y solo retiene las lecturas pasando filtros de control de calidad.
  2. Mapeado de lectura y procesamiento BAM
    1. Descargue el ensamblaje genómico de referencia Toxoplasma gondii GCF_000006565.2 (TGA4) de la base de datos genómica del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Extraer el cromosoma VIII (NC_031476.1) para el análisis de SAG2 y el cromosoma XII (NC_031480.1) para el análisis de SAG3 . Indexa las secuencias de referencia usando SAMtools y genera un índice de alineación usando un generador de índices de alineación de lectura larga.
    2. Map se traduce en el genoma de referencia indexado usando un algoritmo de alineación de lectura larga optimizado para datos de secuenciación nanopore (por ejemplo, preset para mapeo de lectura larga; -ax map-ont).
    3. Convierte la salida de alineación a formato BAM, ordena e indexa archivos BAM usando SAMtools. Añade información de grupo de lectura a cada archivo BAM usando herramientas Picard. Calcula la cobertura media por locus usando estadísticas de profundidad y genera estadísticas de mapeo usando métricas flagstat.
  3. Generación de secuencias por consenso
    1. Genera secuencias de consenso por amplicón utilizando un algoritmo de pulido por consenso basado en redes neuronales con parámetros por defecto. Exportar secuencias de consenso en formato FASTA para análisis posteriores.
    2. Realizar alineamientos basados en referencias y análisis comparativos de secuencias utilizando bases de datos genómicas disponibles públicamente. Visualiza alineamientos de lectura y posiciones polimórficas usando software de visualización genómica.
  4. Llamada variante
    1. Realizar la detección de variantes utilizando un algoritmo de llamada de variantes basado en consenso. Separar polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) y eventos de inserción/deleción (INDELs) utilizando herramientas de selección de variantes (Archivo Suplementario 1).
    2. Aplica umbrales de filtrado de calidad. Para SNPs, variantes de filtro con, por ejemplo, QD < 2.0, FS > 60.0 o MQ < 40.0. Para INDELs, variantes de filtro con, por ejemplo, QD < 2.0 o FS > 200.0.
    3. Comprime e indexa archivos VCF filtrados usando herramientas estándar de procesamiento VCF. Genera estadísticas variantes usando utilidades de resumen VCF.
  5. Asignación de genotipos
    1. Extraer variantes específicas del locus de las regiones SAG2 y SAG3 y comparar perfiles polimórficos con secuencias de cepas de referencia para asignar genotipos de T. gondii .

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Resultados

El ADN genómico de Toxoplasma gondii fue amplificado con éxito por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) dirigida a dos marcadores genéticos: SAG2 y SAG3 (Figura 2). Tras la purificación, los productos de PCR produjeron bandas distintas de los tamaños esperados en la electroforesis en gel de agarosa, correspondientes a 639 pbbs (SAG2) y 1158 pbbs (SAG3). La claridad y consistencia de estas bandas confirmaron l...

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Discusión

Este estudio demuestra la utilidad de la secuenciación Oxford Nanopore de lectura larga combinada con un enfoque multi-locus dirigido para un genotipado rápido y fiable de Toxoplasma gondii. Al centrarnos en dos loci de antígenos superficiales bien caracterizados, SAG2 y SAG3, establecemos una prueba de concepto para la secuenciación multilocus basada en Oxford Nanopore mediante análisis comparativos de las cepas RH (Tipo I) y ME49 (Tipo II), demostrando la cap...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Ministerio egipcio de Educación Superior e Investigación Científica, representado por la Oficina Egipcia de Asuntos Culturales y Educativos en Londres, y el UKRI MRC (MR/X502947/1). La Figura 1 fue creada con BioRender.com

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Para electroforesis en gel
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Medio de cultivo celular
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AFlujo de trabajo Nextflow para procesar y analizar datos de secuenciación de amplicones de nanoporos; se utilizó la versión 1.2.1 para el análisis reproducible de datos de MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AFlujo de trabajo Nextflow para la alineación de lecturas de secuenciación de nanoporos a secuencias de referencia y visualización integrada utilizando IGV; se utilizó la versión 1.2.3 para el análisis reproducible de datos de MinION.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-FPara limpieza con cuentas
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Suplemento para cultivo celular
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Lavado de celda de flujo
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Confirmación de tamaño
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Fibroblastos dérmicos humanos aislados de prepucio neonatal; se utiliza para la propagación de parásitos
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Celda de flujo para secuenciación
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BSecuenciador de nanoporos; la secuenciación se realizó utilizando el software MinKNOW (v25.09.16) para el control del dispositivo y la llamada de bases en tiempo real.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ASoftware utilizado para el control del dispositivo MinION Mk1B, secuenciación en tiempo real y llamada de bases; versión 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Codificación para muestras multiplexadas
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367Ligación de ADN
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Ligación de adaptadores
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Utilizado en la ligación de ADN
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Preparación de la biblioteca
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581Grado de biología molecular
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5Purificación del producto PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Mezcla antibiótica
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Buffer de lavado
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SPolimerasa de alta precisión
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504Extracción de ADN
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Enzima de ligación de adaptadores
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102Tinte de coloración de ADN
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Carga de muestras en gel
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Para el pasaje de HFF
1× TAE or 1× TBE buffer——Buffer de funcionamiento
2× PCR premix——Mezcla lista para PCR

Referencias

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