Un dispositivo milifluido de cultivo continuo para el estudio de Escherichia coli bajo condiciones de nutrientes bajos y fluctuantes

Resumen

Presentamos un protocolo para el dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD), que permite el cultivo de poblaciones bacterianas bajo condiciones constantes de bajas concentraciones de nutrientes (hasta cientos de concentraciones nanomolares) o fluctuaciones temporales de nutrientes en una escala temporal de tiempo.

Resumen

Los hábitats microbianos en la naturaleza suelen caracterizarse por bajas concentraciones de nutrientes mixtos, heterogeneidad espacial y fluctuaciones temporales. Sin embargo, los métodos tradicionales de cultivo en laboratorio no logran replicar estas condiciones. Los cultivos en lotes no pueden sostener el crecimiento en ambientes bajos en nutrientes, mientras que los quimostatos mantienen un crecimiento estable con un único nutriente limitante, pero son difíciles de implementar cuando el objetivo es mantener concentraciones bajas definidas de mezclas nutritivas o introducir fluctuaciones rápidas. Los sistemas microfluídicos generan ambientes dinámicos pero proporcionan biomasa insuficiente para análisis ómicos a nivel poblacional. Para abordar estas limitaciones, presentamos el dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD), una plataforma versátil para estudiar las respuestas microbianas a condiciones nutritivas estables y fluctuantes. El MCCD alberga poblaciones bacterianas dentro de un filtro Sterivex (membrana filtrante porosa de fluoruro de polivinilideno [PVDF] de 0,45 μm), donde un flujo continuo de medio mantiene condiciones de cultivo estables y previene el agotamiento de nutrientes. Un sistema de válvula solenoide de tres vías, controlado mediante software personalizado de Matlab, permite fluctuaciones precisas de nutrientes a escala de minutos. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para operar el MCCD en dos modos: (1) condiciones constantes de bajas nutrientes y (2) condiciones de nutrientes fluctuantes. Usando este sistema, Escherichia coli creció exponencialmente en una mezcla de aminoácidos y nucleobases presentes en decenas o cientos de concentraciones nanomolares, alcanzando concentraciones celulares del orden de 10,9 células/mL. Al recrear características clave de hábitats microbianos naturales, el MCCD permite el estudio del crecimiento y la fisiología bacteriana bajo condiciones controladas pero ecológicamente relevantes en E. coli y otras especies microbianas.

Introducción

Las bacterias en hábitats naturales se encuentran con un paisaje de nutrientes que a menudo varía tanto en composición como en concentración y puede fluctuar a lo largo de un amplio rango de escalas^{temporales 1, 2, 3, 4}. En entornos como el océano⁵, el suelo³ y el^{intestino 6}, el crecimiento microbiano suele estar limitado por uno o más nutrientes esenciales, y la disponibilidad de nutrientes puede cambiar debido a procesos físicos, químicos y^{biológicos 4}. Estas mezclas de nutrientes y sus fluctuaciones impulsan estrategias microbianas para la supervivencia y el crecimiento, moldeando las respuestas a través de diferentes niveles de organización biológica⁴.

Las adaptaciones microbianas a la dinámica de nutrientes ocurren a nivel de comunidad, población y célula única. A nivel comunitario, las fluctuaciones pueden promover la coexistencia de^{especies 7}, coordinar la composición de la comunidad y la actividad metabólica con la variación temporal⁸, y crear oportunidades para que nuevas especies colonicen⁹. A nivel poblacional, los cambios en las condiciones de los nutrientes pueden acelerar la evolución seleccionando para cambios genéticos¹⁰ o inducir variabilidad fenotípica, incluyendo estrategias de cobertura^{de apuestas 11}, que mejoran la supervivencia bajo condiciones impredecibles. A nivel unicelular, las bacterias ajustan su fisiología en respuesta al entorno nutritivo^12,13. Un ejemplo recientemente reportado es una fisiología específica que otorga a las bacterias una ventaja de crecimiento bajo condiciones^{fluctuantes 14}. Dado que las bacterias frecuentemente se encuentran con limitaciones de nutrientes, estudiar cómo responden a condiciones de nutrientes bajos y variables —tanto como células individuales como dentro de poblaciones o comunidades— es esencial para comprender su comportamiento en sus entornos naturales.

Los quimiostratos son muy adecuados para estudiar el crecimiento bajo la limitación de un solo nutriente, pero son difíciles de usar cuando el objetivo es controlar las concentraciones de múltiples nutrientes en mezclas de baja concentración. Los quimiostatos han sido herramientas valiosas para estudiar la adaptación bacteriana a la limitación de nutrientes, proporcionando un entorno bien controlado y estable. Sin embargo, su funcionamiento los restringe inherentemente a condiciones en las que el crecimiento está limitado por un único elemento esencial de nutrientes. En un quimiostato, la tasa de dilución se ajusta para que el crecimiento celular equilibre el suministro de un nutriente limitante, fijando así la tasa de crecimiento en lugar de las concentraciones individuales^{de nutrientes 15}. Este marco no se generaliza fácilmente a ambientes que contienen mezclas de nutrientes sustituibles —como múltiples fuentes de carbono— porque la tasa de dilución controla solo la tasa global de crecimiento, no las concentraciones de cada componente en el^{medio 16,17}. Como resultado, las concentraciones de nutrientes individuales y sus patrones de coutilización surgen de la utilización microbiana en lugar de ser prescritas^{externamente 16,17}.

Además, aunque las fluctuaciones de nutrientes pueden inducirse en los quimostós, las fluctuaciones rápidas o desplazamientos individuales en la escala de minutos son difíciles de lograr debido a los volúmenes de cultivo que suelen ser elevados. Los dispositivos microfluídicos han surgido como herramientas poderosas para crear entornos nutritivos precisos de baja concentración^{y fluctuación 14}. Cuando se combinan con microscopía de vídeo, permiten medir el crecimiento de células individuales. Aunque los sistemas microfluídicos permiten cuantificar la expresión de proteínas seleccionadas mediante reporteros fluorescentes, a diferencia de los quimotistas, los dispositivos microfluídicos típicos son demasiado pequeños para producir la biomasa necesaria para análisis ómicos, por ejemplo, para estudiar el proteoma de una población bacteriana. Para cerrar esta brecha, desarrollamos el dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD).

El MCCD permite el crecimiento bacteriano bajo condiciones controladas de nutrientes, incluyendo condiciones constantes de baja disminución de nutrientes con poca o ninguna depleción, así como condiciones fluctuantes de nutrientes, utilizando un sistema de cultivo de flujo continuo capaz de generar suficiente biomasa para análisis posteriores. El MCCD utiliza un filtro PVDF de 0,45 μm como recipiente de cultivo, en el que el medio se repone continuamente mediante una bomba peristáltica que suministra medio fresco desde un yacimiento (Figura 1A). La membrana porosa del filtro retiene bacterias mientras permite un flujo prescrito de nutrientes, lo que previene la disminución de nutrientes incluso en concentraciones bajas (de cientos de nanomolares a micromolares). Como la biomasa se retiene mientras el medio fresco fluye continuamente a través del dispositivo, el MCCD comparte similitudes con los retentostatos¹⁸, en los que las células se retienen mientras se renueva el medio. Sin embargo, el MCCD se diferencia de los retentostatos clásicos por su arquitectura y modo de administración de nutrientes. El retentostato suele funcionar como un reactor a granel agitado, donde las células se suspenden en un volumen de cultivo bien mezclado. Bajo tales condiciones, la disponibilidad de nutrientes depende del equilibrio entre mezcla, difusión y absorción celular, y puede surgir agotamiento o gradientes locales, especialmente en bajas concentraciones de nutrientes y altas densidades celulares. En contraste, en la MCCD, las células se ensamblan directamente sobre la membrana dentro del cartucho de Sterivex de pequeño volumen, formando capas de solo unas pocas células de grosor que están expuestas continuamente al medio fluido. No se impone ninguna mezcla activa dentro del cartucho; en su lugar, el medio se homogeneiza aguas arriba y se suministra mediante flujo continuo. Los nutrientes se suministran mediante transporte convectivo a través de las capas celulares delgadas y, dado que la distancia de difusión es pequeña y el caudal es alto, los gradientes locales de nutrientes se minimizan. Como resultado, las condiciones nutricionales experimentadas por la población están determinadas principalmente por la composición del medio entrante, lo que permite condiciones de baja concentración en nutrientes más consistentes y bien definidas que las que se pueden garantizar en sistemas de retención agitados.

Figura 1: El dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD) para cultivo bacteriano bajo condiciones de baja concentración o fluctuaciones de nutrientes. (A) Esquema del MCCD para condiciones constantes de nutrientes. Una bomba peristáltica impulsa el flujo de medio fresco desde un yacimiento a través de un filtro PVDF de 0,45 μm que contiene células bacterianas. La membrana porosa del filtro retiene las bacterias mientras permite que el medio pase. El flujo continuo del medio mantiene condiciones constantes de nutrientes dentro del filtro, incluso con concentraciones muy bajas. (B) Esquema del MCCD para condiciones fluctuantes de nutrientes. Una válvula solenoide de tres vías controlada por software, aguas arriba de la bomba peristáltica, alterna la entrada del medio entre dos depósitos (por ejemplo, alta concentración de nutrientes, C_Alta, y baja concentración de nutrientes, C_Bajo). El software controla la posición del émbolo de la válvula para determinar la fuente activa de entrada. (C) Ensamblaje fluídico para condiciones constantes de nutrientes. Una tapa con tres tubos de silicona que la atraviesan sella la botella que contiene un medio fresco. Un tubo se conecta a un filtro de ventilación para la aireación, mientras que los otros dos llevan el medio a los filtros. Conexiones Luer Barb-to-Male conectan estos tubos a la tubería peristáltica y conectan cada tubo peristáltico a una válvula de retención unidireccional, que sirve como punto de entrada al filtro. La salida del filtro también está equipada con una válvula antirretorno unidireccional. La imagen muestra dos muestras, cada una contenida en un filtro. (D) Ensamblaje fluídico para condiciones fluctuantes de nutrientes. La plataforma metálica alberga el microcontrolador y los componentes electrónicos que controlan dos válvulas solenoides mediante software personalizado MATLAB. Conexiones roscadas a Barb conectan tanto las entradas como las salidas de las válvulas solenoides a la tubería. Cada válvula tiene dos entradas para los dos medios alternativos, aquí un medio de alta concentración de nutrientes, C_Alto, tubos etiquetados en rojo, y un medio de baja concentración de nutrientes, C_Bajo, con etiqueta azul. Los medios se encuentran dentro de botellas tapadas con un filtro de ventilación, como en (C). Las salidas de las válvulas solenoides se conectan a los filtros mediante tubería peristáltica, como en el conjunto de estado estacionario (C). La imagen muestra dos muestras, cada una contenida en un filtro. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Además, la incorporación de una válvula solenoide de tres vías controlada por software aguas arriba del filtro Sterivex permite al usuario cambiar el flujo del medio entre dos medios contenidos en diferentes depósitos (Figura 1B). Como resultado, el dispositivo puede utilizarse para estudiar la respuesta de las bacterias a un entorno estable en una condición nutritiva constante (incluida baja concentración) o a fluctuaciones nutricionales, con escalas de tiempo de fluctuación de varios minutos o más.

Este protocolo describe el ensamblaje y funcionamiento del MCCD para estudiar bacterias tanto bajo como en condiciones de nutrientes fluctuantes. Por ejemplo, este protocolo ofrece una guía paso a paso para realizar un experimento de crecimiento utilizando Escherichia coli NCM3722 en dos modos operativos del MCCD: condiciones constantes de bajas nutrientes y condiciones fluctuantes de nutrientes. El sistema MCCD puede adaptarse fácilmente a otras condiciones nutricionales y especies microbianas, lo que lo convierte en una plataforma versátil para estudiar la fisiología bacteriana en entornos nutritivos típicos de los que se encuentran en la naturaleza.

Protocolo

1. Crecimiento bacteriano en condiciones constantes de nutrientes

NOTA: Este protocolo describe el procedimiento para realizar una curva de crecimiento de E. coli NCM3722 en una condición muy diluida de medio definido rico ("RDM bajo"). Esta curva de crecimiento dura 12 horas, con una muestra recogida cada 2 horas (un total de 6 puntos temporales). El principio clave de este protocolo es que cada punto temporal corresponde a un único filtro Sterivex (de ahora en adelante denominado filtro PVDF de 0,45 μm). Para recoger una muestra, se extrae el cultivo dentro del filtro centrifugándolo boca abajo, se cuantifica el número de celdas y se descarta el filtro. Cada filtro PVDF de 0,45 μm produce solo una muestra. La preparación del experimento requiere definir tres parámetros clave del experimento: el caudal de la bomba peristáltica, la duración del experimento y el número deseado de muestras (es decir, el número de filtros PVDF de 0,45 μm). Ajusta el caudal inicial a 2 mL/min. Ajusta este parámetro según sea necesario (por ejemplo, aumentar el caudal para mantener el suministro de un nutriente muy diluido).

1. Preparación del medio y materiales
   NOTA: Dado que cada filtro corresponde a una única muestra de punto temporal, el tiempo experimental de ejecución de cada filtro PVDF de 0,45 μm varía según su tiempo de recogida (por ejemplo, 2 h para el primer punto, 4 h para el segundo, y así sucesivamente).
   1. Estima el volumen de medios de cultivo requerido usando la fórmula
      ,
      donde n es el número de muestras (filtros PVDF de 0,45 μm), Q es el caudal (en mL/min) y t_i es el tiempo de ejecución experimental (en minutos) para cada muestra.
   2. Multiplica por 1,2 para incluir un 20% adicional de volumen que tenga en cuenta la variación en el caudal. Para este ejemplo, calcula
      
   3. Redondea el volumen calculado hacia arriba (por ejemplo, preparar 6.200 mL en este ejemplo).
   4. Prepara material para la esterilización (véase la Tabla 1).
      NOTA: Prepara y esterilizara los materiales el día anterior al experimento para garantizar su preparación y minimizar los retrasos. Autoclave de estos materiales, excepto las válvulas Luer unidireccionales; Esteriliza las válvulas con etanol al 70%.
      1. Conecta ambos extremos de seis tubos peristálticos de silicona a conexiones de plástico "Male Luer to Barb" insertando el extremo Barb del ración en el tubo. Cubre los extremos de Luer macho con papel de aluminio para evitar contaminaciones.
         NOTA: Se preparan seis tubos peristálticos porque el experimento utiliza seis filtros PVDF de 0,45 μm. Posteriormente, todos los tubos se montarán en la misma cabeza de bomba peristáltica para que todos los filtros reciban un flujo idéntico.
      2. Coloca el tubo dentro de un recipiente cerrado y esterilizable.
      3. Coloca los filtros de ventilación dentro de un recipiente cerrado y esterilizable.
      4. Coloca los tapones de botella en tubo con tubos de silicona que pasan a través de los tapones dentro de un recipiente cerrado y esterilizable.
         NOTA: Las tapas de botella con tubos utilizadas en este protocolo están equipadas con tres tubos que atraviesan las tapas: dos tubos de igual diámetro para suministrar el medio a los filtros PVDF de 0,45 μm, y un tercer tubo de diámetro más ancho. Estos tubos están bien sujetos a las tapas y no pueden retirarse.
      5. Sumerge 12 válvulas antirreloj Luer unidireccionales en una solución de etanol al 70% y déjalas esterilizar toda la noche.
         NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Los materiales esterilizados pueden almacenarse sumergidos y sellarse a temperatura ambiente hasta 24 horas antes del experimento. Antes de usarlas, retira las válvulas del etanol y enjuágalas con agua estéril ultrapura para eliminar el etanol residual. Alternativamente, las válvulas de retención pueden imprimirse en 3D utilizando materiales autoclavables para permitir la esterilización mediante autoclave en lugar de tratamiento con etanol.
   5. Autoclave el tubo peristáltico, los filtros de ventilación, las tapas de botella, el cilindro graduado y las botellas utilizando configuraciones estándar de laboratorio de laboratorio.
   6. Prepare 6.200 mL de medio definido de baja riqueza (RDM; véase Tabla de Materiales) mezclando los reactivos listados en la Tabla 2.
      NOTA: Prepara el medio el día del experimento, durante el periodo de espera aproximado de 5 horas tras iniciar el precultivo (véase el paso 1.2.1). Esto preserva la frescura media y minimiza el riesgo de contaminación.
2. Preparación de un precultivo bacteriano
   NOTA: Utiliza una pre-cultura en la fase exponencial para iniciar el experimento. Durante esta fase, las bacterias crecen a un ritmo constante, sintetizando constituyentes celulares de forma equilibrada y dividiéndose a una masa celular definida. Utilizar células de fase exponencial para minimizar la variabilidad y estandarizar el estado fisiológico inicial.
   1. El día antes del experimento, prepare un cultivo nocturno (ON) de la siguiente manera: Inocular 3 mL de RDM completo con un stock congelado de glicerol de E. coli NCM3722 en un tubo de cultivo estéril de 15 mL. Incubar el cultivo durante la noche (~16 h) a 37 °C con agitación a 200 rpm en una incubadora agitada.
      NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Una vez que la cultura ON está en la incubadora, no se siguen más pasos ese día. Reanuda el protocolo al día siguiente procediendo al paso 1.2.2.
   2. El día del experimento, preparar el precultivo de la siguiente manera: añadir 6 μL de cultivo de ON a 6 mL de RDM completo. Divídelos a partes iguales en dos tubos de cultivo de 15 mL y etiqueta los tubos como A y B. Incubar ambos tubos a 37 °C con agitación a 200 rpm.
      NOTA: El precultivo suele requerir aproximadamente 5 horas para alcanzar la fase exponencial (ED₆₀₀ ≈ 0,5). Utiliza este periodo para preparar el medio fresco (véase el paso 1.1.6). No continúes con el paso 1.2.3 hasta que el OD₆₀₀ alcance aproximadamente 0.5.
   3. Monitorizar la densidad óptica (OD) a 600 nm usando el tubo B. Proceder con el experimento cuando el OD₆₀₀ alcance aproximadamente 0,5, lo que indica un crecimiento exponencial en la RDM completa para la NCM3722 de E. coli (véase la sección 1.4).
      NOTA: Inicie el experimento con células de fase exponencial para mejorar la reproducibilidad y estandarizar las condiciones iniciales.
3. Preparación de un experimento en el MCCD con condiciones nutricionales constantes
   NOTA: Realizar los pasos 1.3.1 a 1.3.5 dentro de un armario de bioseguridad estéril inmediatamente después de que el precultivo comience a crecer.
   1. Asigna el volumen medio total a cada botella.
      NOTA: Usa las botellas como depósitos de medio. Utiliza tapones de botella equipados con dos tubos de entrega media, cada uno suministrando medio a un filtro PVDF de 0,45 μm. Asigna el volumen total del medio (preparado en el paso 1.1.6) entre las botellas en función de la cantidad requerida por cada muestra temporal (es decir, cada filtro PVDF de 0,45 μm) a lo largo del experimento.
      1. Utilice la fórmula proporcionada en el paso 1.1.1 para determinar el volumen de medio necesario para cada filtro PVDF de 0,45 μm. Por ejemplo, usando los siguientes términos:
         
         Los volúmenes medios totales necesarios para cada momento, en orden cronológico, son 288, 576, 864, 1152, 1440 y 1728 mL.
      2. Distribuye los volúmenes medios calculados entre botellas, agrupando los volúmenes necesarios para dos puntos temporales en una sola botella. Por ejemplo: ~900 mL en una botella de 1 L (para los puntos de tiempo 1 y 2), ~2.100 mL en una botella de 2,5 L (para los puntos de tiempo 3 y 4), ~3200 mL del medio en una botella de 4 L (para los puntos de tiempo 5 y 6).
   2. Sella cada botella con los tapones tubulares (Figura 1C). Aprieta bien los tapones para evitar fugas.
   3. Conecta un filtro de ventilación de 0,2 μm al tubo de silicona más ancho que se extiende desde el tapón de la botella (Figura 1C). Esto permite un intercambio de aire estéril durante el experimento.
   4. Fije un extremo de cada tubo peristáltico (con los accesorios ya conectados; véase la sección 1.1.4 sobre preparación del material) a los tubos de silicona de menor diámetro que se extienden desde los tapones de botella tubulados (Figura 1C). Asegura conexiones seguras para mantener la esterilidad. Deja la cubierta de papel de aluminio en el conector de bloqueo de Luer macho libre en su lugar hasta que comience el experimento para evitar la contaminación.
   5. Coloca las botellas con su tubo ensamblado y la bomba peristáltica en una incubadora a 37 °C. Fija el tubo en los canales de la cabeza de la bomba peristáltica.
      NOTA: Todos los tubos peristálticos están montados en la misma cabeza de bomba de una sola bomba peristáltica, de modo que todos los filtros PVDF de 0,45 μm reciben medio de la misma bomba. El uso de una sola bomba garantiza que el caudal sea idéntico entre filtros y evita la variabilidad que podría surgir por diferencias entre bombas.
4. Protocolo de un experimento en el MCCD con condiciones nutricionales constantes
   1. Diluir el precultivo (OD = 0,5) 1:10 añadiendo 600 μL de precultivo a 5,4 mL de RDM bajo fresco.
   2. Utilizando una pipeta de 1 mL, introduce 1 mL del precultivo diluido en cada uno de los seis filtros PVDF de 0,45 μm.
   3. Enjuaga las válvulas de retención unidireccionales con agua ultrapura autoclavada y coloca una en cada extremo de cada filtro PVDF de 0,45 μm.
   4. Retira las cubiertas de papel de aluminio de los accesorios peristálticos.
   5. Conecte cada uno de los seis filtros PVDF de 0,45 μm a un conector Luer macho en el tubo peristáltico (Figura 1C).
   6. Ajusta el caudal a 2 mL/min en la bomba peristáltica y comienza el flujo. Define este momento como el tiempo 0.
   7. Coloque un receptáculo de residuos debajo de los filtros PVDF de 0,45 μm para recoger el flujo de salida.
      NOTA: La Figura 2A muestra el ensamblaje completo del experimento dentro de la caja incubadora.
5. Recogida de muestras
   1. Tras 2 horas, desenchufa uno de los dos filtros PVDF de 0,45 μm conectados a la botella de 1 L.
   2. Desatornilla las válvulas antirretorno unidireccionales y coloca el filtro PVDF de 0,45 μm en un tubo centrífugo de 50 mL con la entrada orientada hacia abajo.
   3. Centrifuga el tubo de la centrífuga que contiene el filtro PVDF de 0,45 μm a 2.000 × g durante 2 minutos.
   4. Usando un cortapes, aplica una presión suave sobre la carcasa de plástico en el extremo más cercano a la salida para abrir el filtro PVDF de 0,45 μm.
      NOTA: Desinfecta el cortador antes de usarlo (por ejemplo, limpiando con etanol al 70%) para evitar contaminaciones al abrir el filtro PVDF de 0,45 μm.
   5. Libera el cilindro interior que contiene la membrana porosa y descarta la sección del filtro que sostiene la membrana.
   6. Enjuaga las paredes internas de la carcasa del filtro PVDF de 0,45 μm (las perpendiculares a la dirección de flujo) con el medio de cultivo recogido en el tubo de la centrífuga.
      NOTA: Este paso garantiza que se recojan las celdas atrapadas en las paredes durante la centrifugación.
   7. Mide el volumen total recogido utilizando una pipeta serológica de 5 mL.
   8. En los siguientes momentos (4 h, 6 h, 8 h, 10 h y 12 h), desconecta los correspondientes filtros PVDF de 0,45 μm y repite los pasos 1.5.2–1.5.6. Sigue este orden específico:
      1. A las 4 horas, desconecta el segundo filtro PVDF de 0,45 μm conectado a la botella de 1 L.
      2. A las 6 h y 8 h, desenchufa los filtros PVDF de 0,45 μm conectados a la botella de 2,5 L.
      3. A las 10 h y 12 h, desconecta los filtros PVDF de 0,45 μm conectados a la botella de 4 L.
         NOTA: Siga este orden para coincidir los puntos de tiempo de muestreo con los volúmenes medios distribuidos en el paso 1.3.1.
6. Análisis posteriores
   1. Toma tres alicotas de 100 μL de cada muestra y fijala con glutaraldehído hasta una concentración final del 1,5%.
      PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico, un irritante fuerte y un posible sensibilizador. Maneja el mango dentro de una campana extractora química mientras llevas el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad). Evita el contacto con la piel e inhalación. Eliminar los residuos que contienen glutaraldehído según la normativa institucional sobre residuos químicos peligrosos.
   2. Utiliza las muestras fijas para contar el número de células por microlitro con citometría de flujo después de marcar con un colorante fluorescente de ADN.
      PRECAUCIÓN: Los tintes fluorescentes de ADN pueden ser mutagenicos. Llevar guantes y desechar los residuos que contengan tintes según las normativas de bioseguridad institucional.
      NOTA: Como alternativa a la tinción de ADN y la citometría de flujo, las densidades celulares pueden estimarse recubriendo un pequeño volumen de la muestra sobre placas de agar de medio rico (por ejemplo, LB agar) y contando unidades formadoras de colonias (UFC).
   3. Multiplica el número de celdas por microlitro por el volumen total medido en el paso 1.5.7 para calcular el número total de celdas contenidas dentro del filtro PVDF de 0,45 μm.
   4. Centrifugar el volumen restante en tubos microcentrífugas de 1,5 mL a 10.000 × g durante 4 minutos.
   5. Quita el sobrenadante.
   6. Almacena los pellets de células a -80 °C para análisis futuros (por ejemplo, transcriptómica).

Figura 2: Montaje experimental del MCCD. (A) Fotografía del montaje MCCD para condiciones constantes de nutrientes. El montaje se aloja en una caja incubadora para mantener una temperatura constante, con un recipiente de residuos que recoge el medio de paso. (B) Fotografía del montaje MCCD para condiciones fluctuantes de nutrientes. La botella etiquetada con cinta roja contiene un medio de alta concentración de nutrientes (C_Alto), mientras que el frasco etiquetado con cinta azul contiene un medio de baja concentración de nutrientes (C_Bajo). La plataforma metálica en el centro sostiene los componentes que controlan las fluctuaciones de nutrientes, correspondientes a los descritos en la Figura 1D. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Crecimiento bacteriano en condiciones de nutrientes fluctuantes

1. Montaje de un controlador para una válvula solenoide
   NOTA: Controla la válvula solenoide de tres vías usando un circuito de conmutación basado en microcontrolador conectado a un ordenador que ejecuta una interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada desarrollada en MATLAB.
   1. Montar el circuito de control de la válvula solenoide (Figura 3A).
      1. Conecta un pin de salida digital del microcontrolador a la base de un transistor NPN mediante una resistencia de 1 kΩ.
      2. Conecta el colector del transistor al terminal negativo de la válvula solenoide.
      3. Conecta el emisor del transistor a tierra.
      4. Conecte el terminal positivo de la válvula solenoide a una fuente de alimentación externa de corriente continua compatible con el voltaje de la válvula.
      5. Coloca un diodo sobre los terminales del solenoide. Conecta el lado rayado del diodo a la línea de alimentación positiva.
         NOTA: El diodo suprime picos de tensión generados cuando se apaga el solenoide.
   2. Conecta conexiones de plástico "roscado a la espiga de manguera" a las válvulas solenoides, asegurando que el extremo de la espiga se extienda hacia fuera.
   3. Instala MATLAB R2022b o posterior en un ordenador con conectividad USB.
   4. Instala el paquete de soporte MATLAB necesario para la comunicación serial con hardware de microcontroladores.
   5. Conecta la placa del microcontrolador al ordenador usando un cable USB para establecer la comunicación en serie.
   6. Abre la interfaz gráfica basada en MATLAB utilizada para generar condiciones nutritivas fluctuantes en el MCCD (disponible en el enlace https://github.com/juanitaLara/MCCD).
   7. Verifica la conexión entre las válvulas solenoides y la plataforma GUI de MATLAB:
      1. Abre la plataforma GUI en Matlab y haz clic en el botón Conectar (Figura 3B). Espera hasta que el mensaje conectado al controlador aparezca correctamente en la ventana de comandos.
      2. Introduce un valor para el paso de tiempo (por ejemplo, 5 s para las fases Alta y Baja) en el panel de operación automatizada .
      3. Observa las válvulas solenoides y escucha el sonido de clic que producen al cambiar entre ambos medios.
      4. Con un reloj, confirma que las válvulas solenoides cambian exactamente en el intervalo especificado (por ejemplo, cada 5 segundos).
         NOTA: Realice esta verificación antes de cada experimento para confirmar la comunicación y la correcta conmutación de válvulas. (PUNTO DE PAUSA) Tras verificar el funcionamiento de la válvula solenoide, el sistema puede permanecer ensamblado dentro de la incubadora durante varias horas antes de comenzar el experimento.
2. Preparación de medios y materiales
   NOTA: Este protocolo consiste en alternar las condiciones de nutrientes entre una RDM baja y alta con un periodo de 1 hora (30 minutos en RDM alta seguidos de 30 minutos en RDM baja). El experimento se desarrolla durante tres horas de fluctuaciones, con dos muestras recogidas: (1) a las 3 h 1 min (fase alta de GDR, inmediatamente después de cambiar de baja a alta), y (2) a 3 horas y 31 minutos (fase baja de RDM, inmediatamente después de cambiar de alta a baja).
   1. Estimar los volúmenes necesarios de medios de cultivo por fases experimentales.
      1. Primero, calcular los volúmenes necesarios para las primeras 3 horas (tres periodos completos de fluctuación):
         bajo volumen RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtros PVDF de 0,45 μm] = 432[mL]
         alto volumen RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtros PVDF de 0,45 μm] = 432[mL]
      2. Calcula el volumen necesario para la fase final de 30 minutos:
         alto volumen RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[0,45 μm filtros PVDF] = 72[mL]
      3. Redondea los volúmenes a valores convenientes (por ejemplo, 500 mL de RDM bajo y 600 mL de RDM alto).
   2. Preparar los materiales para la esterilización por autoclave (véase la Tabla 3) siguiendo los pasos 1.1.4 – 1.1.5.
      NOTA: Prepara y esteriliza los materiales el día antes del experimento para asegurar la preparación y minimizar los retrasos en el día del experimento (pasos 2.2.3 y 2.2.4). Este montaje, en comparación con los experimentos de nutrientes constantes, requiere tubos adicionales para conectar las botellas de medio directamente a la válvula solenoide (Figura 1B,D). Estos tubos requieren solo un conector "Barb a Luer macho", ya que los conectores de la válvula solenoide están preensamblados. Cubre los extremos de estos tubos con papel de aluminio antes de hacer el autoclave.
   3. Esteriliza el tubo peristáltico preparado, los filtros de ventilación, los tapones, el cilindro graduado y las botellas en un autoclave.
   4. Sumerge 4 válvulas de retención Luer unidireccionales en una solución de etanol al 70% y déjalas esterilizar toda la noche.
      NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Las válvulas antirreloj esterilizadas pueden permanecer sumergidas en etanol durante la noche y almacenarse selladas a temperatura ambiente hasta 24 horas. Antes de usarlas, enjuaga las válvulas con agua Milli-Q estéril.
   5. Limpia y esteriliza las válvulas solenoides enjuagándolas con etanol al 70% 3–5 veces, seguidas de agua ultrapura 3–5 veces.
   6. El día del experimento, durante el periodo de espera de aproximadamente 5 horas tras la preparación previa al cultivo (véase el paso 2.3), preparar 500 mL de RDM bajo y 600 mL de RDM alto mezclando los reactivos listados en la Tabla 4.
      NOTA: Preparar el material el día del experimento garantiza la frescura y minimiza los riesgos de contaminación.
3. Preparación de un precultivo bacteriano
   1. Sigue los pasos descritos en el paso 1.2.
4. Preparación de un experimento en el MCCD con condiciones de nutrientes fluctuantes
   NOTA: Realizar los pasos 2.4.1–2.4.4 dentro de un armario de bioseguridad estéril inmediatamente después de que el precultivo comience a crecer.
   1. Coloca cada medio en una botella de 1 L.
   2. Sella las botellas con los tapones preensamblados equipados con tres puertos y tubos de silicona preinstalados. Aprieta bien los tapones para evitar fugas.
   3. Conecta un filtro de ventilación de 0,2 μm al tubo ancho de silicona que se extiende desde uno de los puertos de cada tapón de botella.
   4. Conecta el "tubo de entrada" (mostrado en la Figura 1D) a los tubos de silicona que sobresalen de los tapones de botellas tubulados antes de conectarlo a las válvulas solenoides:
      1. Conecta un extremo del tubo de silicona (con solo un conector acoplado) al tubo que se extiende desde la tapa baja RDM.
      2. Deja la cubierta de papel de aluminio sobre el conector de bloqueo Luer masculino libre hasta que las botellas se lleven a la incubadora para evitar contaminaciones.
      3. Repite el paso 2.4.4.1 para la botella de alto RDM.
   5. Coloca las botellas con su "tubo de entrada" ensamblado, la bomba peristáltica y las válvulas solenoides con el controlador dentro de una incubadora ajustada a 37 °C.
   6. Conecta el "tubo de entrada" (unido en el paso 2.4.4) a las entradas de las válvulas solenoides de la siguiente manera:
      1. Conecta los dos tubos de la botella de bajo RDM a una de las dos entradas de cada válvula solenoide (tubos etiquetados con cinta azul en la Figura 1D).
      2. Conecta los dos tubos de la botella de alto RDM a una de las dos entradas de cada válvula solenoide (tubos etiquetados con cinta roja en la Figura 1D).
   7. Conecta un tubo de silicona compatible con bomba peristáltica (con solo un accesorio) a la salida de cada válvula solenoide (Figura 1D). Deja la cubierta de papel de aluminio en el conector libre del bloqueo Luer macho hasta que el experimento comience a mantener la esterilidad.
5. Protocolo de un experimento en el MCCD con condiciones de nutrientes fluctuantes
   1. Verifica la conexión entre las válvulas solenoides y el software de Matlab realizando el paso 2.1.7.
   2. Introduce los valores deseados de pasos de tiempo para las fluctuaciones en la plataforma GUI de Matlab: introduce pasos de tiempo de 1800 s en RDM alto (30 min) y 1800 s en RDM bajo (30 min).
   3. Selecciona Bajo en el menú Start para comenzar en la condición de RDM Bajo (Figura 3).
   4. Semilla los dos filtros PVDF de 0,45 μm como se describe en el paso 1.4.
   5. Empieza el experimento.
      NOTA: La Figura 2B muestra el conjunto fluídico completo de este experimento.
6. Recogida de muestras
   1. Recoge muestras como en el paso 1.5. Cosecha el primer filtro PVDF de 0,45 μm a las 3 h 1 min y el segundo a las 3 h 31 min.
      NOTA: Desconecta primero cualquiera de los filtros; ambos filtros son alimentados por el mismo medio.
7. Análisis posteriores
   1. Sigue los pasos descritos en el paso 1.6 para contar el número de células mediante citometría de flujo y para procesar y almacenar muestras para análisis posteriores (por ejemplo, transcriptómica).

Figura 3: Controlador de las válvulas solenoides para imponer fluctuaciones de nutrientes. (A) Diagrama de cableado del circuito electrónico utilizado para controlar la válvula solenoide. El circuito consta de una placa microcontroladora, un transistor utilizado como elemento de conmutación, una resistencia conectada a la base del transistor y un diodo flyback colocado sobre la válvula solenoide para proteger el circuito de picos de tensión generados durante la conmutación de válvulas. El microcontrolador controla el transistor, que a su vez conmuta la alimentación suministrada a la válvula solenoide. Adaptado con permiso de la referencia ²⁰ . (B) Tras conectar la placa microcontrolador tanto al ordenador que ejecuta la interfaz gráfica como a una fuente de alimentación con el voltaje requerido por las válvulas solenoides, la comunicación se establece haciendo clic en el botón Conectar . Las válvulas pueden operarse manualmente mediante el panel de Operación Manual , donde el usuario selecciona el medio a volar (por ejemplo, "Alto" o "Bajo"). Alternativamente, el panel de Operación Automatizada permite al usuario especificar el medio inicial y los pasos de tiempo (en segundos) para cada fase (Alto y Bajo), y comenzar la operación haciendo clic en el botón Iniciar . El Monitor en Tiempo Real muestra una función escalonada (0 = Bajo, 1 = Alto) a lo largo del tiempo, indicando qué medio fluía a través de las válvulas solenoides hacia los filtros durante los segundos anteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

En este estudio, utilizamos el MCCD para cuantificar la tasa de crecimiento de E. coli NCM3722 bajo condiciones constantes de bajos nutrientes a tres concentraciones de RDM. Estas concentraciones se derivaron de la fórmula de medio definido rico (RDM) descrita por^{Neidhardt 19}, con los suplementos de aminoácidos y nucleobases diluidos al 0,5%, 0,25% y 0,01% de la formulación original, respectivamente.

Se realizaron experimentos ...

Discusión

Los métodos de cultivo bacteriano que capturan la complejidad de nutrientes de los entornos naturales son esenciales para avanzar en el estudio de la fisiología microbiana más allá de condiciones de laboratorio simplificadas. Los ecosistemas naturales contienen mezclas de nutrientes que abarcan un amplio rango de concentraciones, que a menudo no apoyan tasas de crecimiento^máximas 1,3,4,21,22,23....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1K Ohm Resistor	BC Robotics	ELC-021	Potencia nominal: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	Voltaje inverso de CC: 50 V; Corriente rectificada media: 1 A
Tubo peristáltico de silicona curado con platino de 3 paradas	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Diámetro interior 0,8 mm; diámetro exterior 2,4 mm; compatible con la bomba peristáltica utilizada
Válvulas solenoides de 3 vías	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V CC, 1 W
Hoja de aluminio			Adecuación para autoclavado
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclave	Systec	D-200	O de una empresa diferente
Tapón de cierre con tres puertos – para botellas de 1 y 2 L	Nalgene	2162-0531	O de una empresa diferente (asegúrese de que se ajusten a las botellas seleccionadas)
Tapón de cierre con tres puertos – para botella de 4 L	Nalgene	2162-0830	O de una empresa diferente (asegúrese de que se ajusten a las botellas seleccionadas)
Medidor de densidad celular CO8000	WPA biowave		Medidor de OD
Centrífuga	Eppendorf	5804R	Centrífuga que se ajusta a tubos Falcon de 50 mL
Centrífuga	Eppendorf	5424R	Centrífuga que se ajusta a tubos eppendorf de 1,5 y 2 mL
Tubo de centrífuga cónico - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Tubo Falcon
Tubos de cultivo (14 mL, estériles)	Greiner bio-one		Tubos de cultivo
Etanol	Sigma Aldrich	493511	Diluido al 70%
Citómetro de flujo	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehído 25%	Sigma Aldrich	G5882	O de una empresa diferente
Cilindro graduado - 500 mL	Nalgene	3662-0500	O de una empresa diferente
Caja de incubador			Caja de incubador personalizada – contacte con los autores correspondientes para obtener detalles de construcción
Bomba peristáltica inteligente LabV1 de bajo caudal	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Disponible en Darwin Microfluidics
Adaptador macho Luer a rosca	Aldrich	Z277142	Adaptador macho Luer a rosca compatible con tubos de 0,8 mm de DI (ver Figura 1C)
Adaptador macho Luer a rosca	Aldrich	Z277142	Se utiliza para conectar la válvula solenoide a la "tubo de entrada" (ver Figura 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b o posterior	Software para ejecutar el software personalizado para las válvulas solenoides
Kit de medio definido MOPS EZ Rich	Teknova	M2105	Medio MOPS para Enterobacteria
Válvula de retención Luer unidireccional	Masterflex	30505-92	Evita el reflujo hacia los depósitos de medio
Cortador de tubos - 0-37 mm	KS Tools	2222051	O de una empresa diferente
Juego de pipetas	Fisher Scientific	05-403-151	O de una empresa diferente
Tubo de silicona curado con platino - 1/16 pulg	Nalgene	8060-0020	Diámetro interior 1/16 pulg (1,6 mm); se utiliza para experimentos con fluctuación de nutrientes
Tubo de silicona curado con platino - 1/8 pulg	Nalgene	8060-0030	Diámetro interior 1/8 pulg (3,2 mm); se utiliza para experimentos con fluctuación de nutrientes
Botella de copolímero de polipropileno - 1 L	Nalgene	2126-1000	O de una empresa diferente
Botella de copolímero de polipropileno - 2 L	Nalgene	2126-2000	O de una empresa diferente
Botella de copolímero de polipropileno - 4 L	Nalgene	2126-4000	O de una empresa diferente
Pipeta serológia - 5 mL	Corning	CLS4487	O de una empresa diferente
Protoboard sin soldar	BC Robotics	PROTO-001
Filtro Sterivex-HV - 0,45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
Tinte SYBR Green I para gel de ácidos nucleicos	Invitrogen	S7563	Tinte de ácidos nucleicos para recuento de células en citómetro de flujo
Transistor Darlington TIP120	BC Robotics	TRN-005
Tubos - 1,5 mL	Eppendorf	3810X	Tubos para centrifugar cultivos celulares y almacenar sedimentos
Filtro de ventilación	Millex	SLFG05000	Filtro de ventilación hidrófobo de 0,2 µm
Recipiente de residuos			La capacidad de volumen debe ser al menos el volumen total de medio que se utilizará en el experimento