Este protocolo describe un método robusto y reproducible para fabricar fantasmas anisotrópicos de alcohol polivinílico (PVA), herramientas esenciales para validar técnicas de elastografía ultrasonética dirigidas a tejidos blandos anisotrópicos mecánicamente (por ejemplo, músculo esquelético).
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Artículo de método
Fabricación fantasma de alcohol polivinílico anisotrópico para elastografía por ultrasonido: procedimientos y controles de calidad
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Resumen
Resumen
Los fantasmas de alcohol polivinílico (PVA) suelen ser isotrópicos y se utilizan ampliamente para validar técnicas de elastografía por ultrasonido para la evaluación de tejidos blandos. Sin embargo, algunos tejidos blandos biológicos (por ejemplo, el músculo esquelético) presentan una anisotropía mecánica distinta, lo que requiere el uso de fantasmas PVA anisotrópicos para la rigurosa prueba de métodos de elastografía dirigidos a estos tejidos. Aunque estudios previos han señalado que los fantasmas anisotrópicos de PVA internos pueden fabricarse mediante ciclos de congelación/descongelación integrada en estiramiento (FTC), detalles técnicos críticos (por ejemplo, proceso de fabricación, control de calidad) siguen siendo insuficientemente documentados. Este trabajo presenta un protocolo visualmente detallado y reproducible para fabricar fantasmas anisotrópicos de PVA, centrándose en materiales clave, procesos escalonados y controles de calidad para inducir una anisotropía estable y uniforme. Los materiales clave incluyen el PVA como matriz fantasma, el sorbato de potasio como conservante, las partículas de grafito como dispersores acústicos y el agua pura (o agua desionizada) como disolvente. El proceso de fabricación consta de tres etapas principales: 1) Preparación de una solución homogénea basada en PVA mediante condiciones térmicas controladas para asegurar la disolución completa del PVA; 2) Solidificación mediante FTC: la solución enfriada se vierte en moldes impresos en 3D, seguida de FTCs libres de estiramiento para formar una estructura preliminar; 3) Inducir anisotropía mediante FTCs estiradas: se realizan FTC adicionales bajo estiramiento controlado para inducir anisotropía direccional. Las medidas de control de calidad (por ejemplo, evitar burbujas de aire durante la disolución del PVA) se describen en detalle. Tras la fabricación, se emplean imágenes de ondas de corte por ultrasonido (SWI) y pruebas de tracción uniaxial para confirmar la anisotropía mecánica del fantasma. Este artículo ofrece un enfoque estandarizado para fabricar fantasmas que imitan tejidos anisotrópicos para validar técnicas de elastografía por ultrasonido con mayor precisión y consistencia.
Introducción
Ciertos tejidos blandos biológicos (por ejemplo, el músculo esquelético) presentan anisotropía mecánica macroscópica, que se origina en su arquitectura microestructuralalineada 1. Específicamente, los tejidos conectivos organizan las fibras musculares en una estructura jerárquica: el endomisio rodea fibras individuales, el perimisio agrupa las fibras en fascículos y el epimisio encapsula todo el músculo, apoyando la transmisión de la fuerza y el suministrode nutrientes 2. Las técnicas de elastografía basadas en ultrasonidos, como la imagen por onda cortante (SWI), se utilizan ampliamente para la evaluación muscular 3,4. Sin embargo, las propiedades anisotrópicas del músculo teóricamente resultan en la propagación de ondas de corte dependiente de ladirección 5, lo que complica la cuantificación de la rigidezmuscular 6. Los fantasmas que imitan tejidos mecánicamente anisotrópicos son esenciales para avanzar en la elastografía por ultrasonido en la evaluación muscular.
El alcohol polivinílico (PVA) es un material ideal para estos fantasmas, ya que mantener la estiración mecánica durante los ciclos de congelación/deshielo (FTCs) alinea las cadenas moleculares del PVA, induciendo así anisotropíamecánica 7,8. Los enfoques convencionales que utilizan cuboides simples de PVA bajo estiramiento suelen provocar una deformación inhomogénea debido al deslizamiento superficial, comprometiendo así la reproducibilidad. Esta limitación puede abordarse empleando una geometría fantasma optimizada con anillos de sujeción en los extremos, lo que garantiza un estiramiento fiable y una distribución uniforme de la deformación9, mejorando notablemente la calidad de los fantasmas PVA anisotrópicos. En este estudio, ofrecemos una demostración visual detallada de la fabricación de estos fantasmas anisotrópicos de PVA y validamos su anisotropía mecánica mediante ensayos de tracción SWI y uniaxiales.
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Protocolo
NOTA: Los siguientes pasos se ilustran en la Figura 1.
1. 3D impresión de molde fantasma
- Utilizando software de modelado 3D, diseña la geometría fantasma para incorporar dos anillos de sujeción (uno en cada extremo) para mantener la estiración, con una región central efectiva de 35 mm × 60 mm × 5 mm (longitud × ancho × altura) para asegurar una inducción uniforme de anisotropía.
- Imprime el molde usando una impresora 3D.
NOTA: Los anillos de sujeción evitan el deslizamiento durante el estiramiento, asegurando una distribución constante de la deformación. Todos los archivos de impresión 3D (.stl) se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
2. Preparación de la solución PVA
- Pesa polvo de PVA (10 en peso), sorbato de potasio (1 en peso) y partículas de grafito (1 en peso, ~6,5 μm de diámetro), y mide el volumen correspondiente de agua pura (se recomienda agua desionizada) para preparar un volumen lotado de ~200 mL.
- Combina polvo de PVA y agua pura en un vaso de precipitados, coloca el vaso sobre un agitador magnético equipado con una barra agitadora, cubre el vaso con papel de aluminio y remueve a ~600 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta que el PVA esté completamente dispersado.
- Transfiere el vaso a un baño maria a 80 °C y continúe calentando hasta que el PVA esté completamente disuelto (lo que demuestra una solución clara y sin partículas).
NOTA: Lleva guantes resistentes al calor y equipo de protección ocular durante el calentamiento para evitar quemaduras térmicas. Asegúrate de que no queden partículas de PVA sin disuelta, ya que comprometerán la homogeneidad fantasma.
3. Adición de aditivos y colado
- Enfría la solución a ~40 °C mientras sigues removiendo a ~600 rpm en el agitador magnético.
- Retirar el papel de aluminio, añadir sorbato de potasio y partículas de grafito, volver a cubrir con papel de aluminio y remover a ~600 rpm hasta que los aditivos estén uniformemente dispersos (confirmar visualmente la distribución homogénea).
- (Opcional) Desgasifica la solución PVA para eliminar las burbujas de aire residuales. Coloque el vaso que contiene la solución mezclada en una cámara de vacío y aplique un vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar las burbujas de aire de la solución de PVA.
- Funde la solución en el molde impreso en 3D y monta el molde usando tornillos.
NOTA: Evita introducir burbujas de aire durante el lanzamiento. Golpea suavemente el molde si es necesario para eliminar las burbujas de aire atrapadas dentro de la solución.
4. FTC inicial para solidificación de PVA
- Coloca el moho en un congelador a −20 °C durante 12 horas.
- Retira el moho del congelador y descongela a temperatura ambiente (20 °C) durante 12 horas.
- Desenrolla cuidadosamente el fantasma para evitar daños.
NOTA: Este paso forma un fantasma base isotrópico, proporcionando una base estable para la inducción posterior de anisotropía.
5. Inducir anisotropía mediante FTC estirados
- Coloca el phantom sobre el dispositivo de estiramiento hecho a medida, estíralo gradualmente hasta el 180% de su longitud efectiva (80% de tensión de tracción), mide manualmente la distancia de estiramiento y bloquea el dispositivo para evitar la retracción.
- Transfiere todo el dispositivo de estiramiento (con el phantom asegurado) a un congelador a −20 °C durante 12 horas, seguido de descongelarlo a temperatura ambiente (20 °C) durante 12 horas.
- Repite este ciclo FTC una vez más bajo estiramientos sostenidos.
NOTA: El dispositivo de estiramiento personalizado está compuesto por una etapa lineal bidireccional de rosca opuesta disponible comercialmente, ensamblada con dos monturas de sujeción fantasma impresas en 3D, para las cuales los archivos STL se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. Lleva guantes aislantes protectores contra el frío para evitar congelaciones al retirar el dispositivo de estiramiento del congelador de −20 °C. El estiramiento sostenido durante las FTC alinea las cadenas moleculares del PVA unidireccionalmente. Total de FTC empleadas en este estudio: un ciclo sin estiramiento + dos ciclos estirados (80% de tensión por tracción).
6. Lanzamiento final y almacenamiento
- Tras el último paso de descongelación FTC, suelta suavemente el dispositivo de estiramiento para evitar daños inducidos por el retroceso.
- Quita el fantasma del dispositivo de estiramiento. El fantasma anisotrópico del PVA está ahora completo.
- Guarda el phantom sumergido en agua dentro de un recipiente de plástico sellado a 4 °C.
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Resultados
La Figura 2A presenta un esquema de todo el proceso de fabricación, incluyendo la preparación de la solución de PVA, el moldeo, el FTC inicial sin estiramiento, el desmoldeo y los posteriores FTC estirados. Utilizando el protocolo propuesto, fabricamos dos fantasmas anisotrópicos de PVA para pruebas de SWI y de tracción uniaxial, respectivamente. La SWI se realizó utilizando un sistema de ultrasonido de investigación equipado con una sonda L7-4 (frecuencia c...
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Discusión
El éxito de este protocolo depende de lograr una disolución completa y uniforme del PVA y de mantener un estiramiento sostenido durante las FTC, dos pasos críticos para inducir una anisotropía mecánica estable y homogénea. La receta utilizada aquí (es decir, concentración de PVA, número FTC y tensión de tracción aplicada) fue seleccionada para fabricar fantasmas anisotrópicos de PVA con rigidez dentro del rango fisiológico del tejido muscular. Cabe destacar que la rigidez y la relación a...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Nº 1254038). Los autores quieren agradecer a la profesora Wei-Ning Lee, de la Universidad de Hong Kong, por su ayuda con la prueba de imagen de onda cortante por ultrasonidos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Balance analítico | OHAUS | AX224 | Balance analítico con calibración interna, capacidad 220 g, legibilidad 0,1 mg |
| Etapa lineal bidireccional, de hilo opuesto | Taobao | N/A | Rango de recorrido de 250 mm por hilo, utilizado para construir el dispositivo de estiramiento personalizado |
| Impresora 3D FDM | Laboratorio Bambu | X1 Carbon | Usado para imprimir el molde fantasma, así como los soportes de sujeción fantasma para el dispositivo de estiramiento personalizado |
| FreeCAD | Comunidad de código abierto de FreeCAD | N/A | Versión 0.22.0, utilizada para diseñar el molde fantasma y los soportes de sujeción fantasma del dispositivo de estiramiento personalizado |
| Partículas de grafito | MREDA | M151649 | Partículas de grafito, 99,95% de pureza, malla 2000 (~6,5 um), usadas como dispersores acústicos, 1% en peso |
| Barra de agitación magnética | Corning | 401435 | Barra magnética recubierta de PTFE, 1 x 3/8 de pulgada, para agitar solución PVA |
| Agitador magnético | IKA | 25005927 | Control básico de seguridad RCT agitador magnético con función de calentamiento |
| Alcohol polivinílico | MACKLIN | P81584 | Alcohol polivinílico, Mw 89000-98000, 95% hidrolizado, usado como matriz fantasma, 10% en peso |
| Sorbato de potasio | Sigma-Aldrich | 85520 | Sorbato de potasio, ≥ 99,0% de pureza, usado como conservante, 1% en peso |
| Etapa de rotación | Newport | URS50BPP | Utilizado para girar la sonda de ultrasonido en pruebas de imagen por onda cortante para múltiples ángulos de sonda (0° :2° :90°) |
| Máquina universal de pruebas de una sola columna | Instron | Modelo 5944 | Utilizado para ensayos de tracción uniaxial, sensor de fuerza de 50 N |
| Sistema de Ultrasonidos de Investigación | Verasonics | Vantage 256 | Utilizada para realizar pruebas de imagen de onda cortante, sonda L7-4 (frecuencia central: 5,2 MHz) |
| Baños María | LÍQUEN | HH-2 | Pantalla digital de baño de agua a temperatura constante, 2 orificios de una sola fila, para calentar y disolver la solución de PVA |
Referencias
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- Sherwood, L. . Fundamentals of human physiology. , (2011).
- Stiver, M. L., Mirjalili, S. A., Agur, A. M. Measuring shear wave velocity in adult skeletal muscle with ultrasound 2-D shear wave elastography: a scoping review. Ultrasound Med Biol. 49 (6), 1353-1362 (2023).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Wang, M., Byram, B., Palmeri, M., Rouze, N., Nightingale, K. Imaging transverse isotropic properties of muscle by monitoring acoustic radiation force induced shear waves using a 2-D matrix ultrasound array. IEEE Trans Med Imaging. 32 (9), 1671-1684 (2013).
- Gennisson, J. L., et al. Viscoelastic and anisotropic mechanical properties of in vivo muscle tissue assessed by supersonic shear imaging. Ultrasound Med Biol. 36 (5), 789-801 (2010).
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- Millon, L., Mohammadi, H., Wan, W. Anisotropic polyvinyl alcohol hydrogel for cardiovascular applications. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 79 (2), 305-311 (2006).
- Dong, J., Lee, W. N. A numerical-model-based optimization strategy for design and fabrication of transversely isotropic tissue-mimicking phantoms [poster]. , (2022).
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- Nitta, N., Yamakawa, M., Hachiya, H., Shiina, T. A review of physical and engineering factors potentially affecting shear wave elastography. J Med Ultrason. 48 (4), 403-414 (2021).
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Reimpresiones y permisos
