Exploración de Análisis Asistido por Principio Activo Asistido por Ordenador y Validación del Medicamento para el Dong en Fiebre y Tos

Resumen

Aquí, construimos una red multidimensional de "enfermedad-vía-componente-objetivo", integrando cribado de farmacología en red, acoplamiento molecular y validación de modelos murinos inducidos por LPS. Al establecer parámetros clave claros, permite la identificación eficiente de los componentes activos de la medicina étnica Tong, Lengyuxiao Tang, y la verificación de un proceso repetible.

Resumen

Para examinar y verificar sistemáticamente los componentes activos en la medicina étnica Dong Lengyuxiao Tang (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. y Zingiber officinale Roscoe) para tratar fiebre y tos, este esquema estableció un proceso metodológico que integra la predicción de farmacología en red y la verificación experimental. En primer lugar, utilizando la base de datos y plataforma de análisis de sistemas de medicina tradicional china (TCMSP), con una biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y similitud de fármaco (DL) ≥ 0,18 como criterios, se examinaron los componentes activos clave de LYXT y se recogieron los objetivos relacionados con fiebre y tos de múltiples bases de datos de enfermedades. Posteriormente, se construyó la red de interacción "componente-objetivo-enfermedad" y, mediante análisis topológicos y la ontología génica (GO) y el enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), se identificaron los objetivos de acción principales (CYP3A4, POR) y las vías clave de señalización (vía MAPK). Se utilizó tecnología de acoplamiento molecular para verificar la capacidad de unión de componentes clave a objetivos centrales. Finalmente, se estableció un modelo murino de bronquitis crónica mediante la instillación intranasal de lipopolisacáridos (LPS), y se verificó la eficacia antiinflamatoria in vivo de los principales componentes activos previstos. Los resultados mostraron que componentes como el caroteno β y el saparenol, evaluados por farmacología de redes, mostraron distintos grados de efectos antiinflamatorios en experimentos con animales, y sus mecanismos pueden implicar la inhibición de la vía de señalización MAPK/p38. Este esquema proporciona un ejemplo repetible para la investigación de cribado y mecanismos de componentes activos en las medicinas étnicas tradicionales.

Introducción

La medicina Dong es un sistema etnomédico dentro del marco de la Medicina Tradicional China (MTC), practicado por el grupo étnico Dong en Guizhou, Hunan y Guangxi. Representa su conocimiento empírico acumulado, desarrollado a lo largo de generaciones. Este sistema integra la medicina herbal, la acupuntura, la colocación ósea, el masaje, la terapia dietética y prácticas espirituales. Sus características distintivas provienen del aislamiento geográfico histórico del grupo y de la tradición oral, que fomentó una farmacopea única basada en la práctica, adaptada al entorno local y a las creencias culturales.

La fiebre persistente, una condición que se desarrolla cuando el cuerpo no puede controlar su temperatura, es un signo de que el cuerpo es disfuncional y una función vital de autoprotección en las células^humanas. Existen muchos métodos diferentes para el tratamiento de la medicina térmica de la nacionalidad Dong. Entre ellas, la fiebre se clasifica en fiebre interna y fiebre externa. Fiebre interna se refiere al calor causado por enfermedades internas, y fiebre externa al calor generado por el frío o el trauma². La fiebre exógena suele afectar a la función^{gastrointestinal 3}. Los médicos nacionales de Dong utilizan terapia antipirética para el frío para tratar la fiebre. Entre las diversas recetas de medicamentos Dong, Lengyuxiao Tang (LYXT) es una decocción estándar utilizada para la fiebre y el dolor, que comprende Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. y Zingiber officinale Roscoe, que se machacan y mezclan constantemente con^{agua 4}. Se utiliza principalmente para la fiebre y el dolor de cabeza causados por un resfriado.

Sin embargo, los componentes activos de LYXT y sus mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo poco comprendidos. Para abordar esta brecha, el presente estudio empleó un enfoque de farmacología en redes para predecir los posibles ingredientes activos y objetivos. Para validar estas predicciones, se seleccionó un modelo murino bien establecido inducido por lipopolisacáridos (LPS) de inflamación pulmonar, ya que imita las respuestas inflamatorias clave asociadas a fiebre y tos, incluyendo la infiltración leucocítica y la producción de citocinas proinflamatorias.

En el proceso de descubrimiento de fármacos, varios estudios han revelado que los compuestos pueden interactuar con múltiples proteínas objetivo. Por tanto, el paradigma de "un fármaco, un blanco biológico" está cambiando hacia un paradigma de farmacología de sistemas. Un compuesto que interactúa con varias proteínas biológicas objetivo de virus o bacterias puede proporcionar efectos farmacológicos^{útiles 5}. El análisis de farmacología en redes es una forma factible y eficaz de mitigar el costoso y largo proceso de descubrimiento de fármacos. Puede ayudarnos a comprender mejor las interacciones entre fármacos, predecir los mecanismos que causan la enfermedad, sugerir miembros alternativos de fármacos para los efectos farmacológicos previstos sin efectos secundarios y predecir las bioactividades de la medicina tradicional. Se han aplicado con éxito enfoques quimioinformáticos, acoplamiento molecular y modelado basado en datos para predecir bioactividades y analizar mecanismos. Estos métodos facilitan el rápido descubrimiento de compuestos antivirales y antibacterianos con potencial clínico, y también se utilizan para explicar la eficacia y los efectos adversos de^{los fármacos 6}. Por ejemplo, el mesilato de imatinib, una molécula pequeña, es un inhibidor del agente causal en la leucemia mieloide crónica, la proteína de fusión Bcr-Abl, pero también bloquea la actividad de varias tirosinas quinasas como Abl, Kit y PDGFR⁷. Por lo tanto, la investigación en la identificación de fármacos y sus objetivos sigue siendo crucial para tratar potencialmente enfermedades, lo que nos ayuda a entender los mecanismos por los cuales los compuestos farmacéuticos actúan para tratar enfermedades a nivel molecular. Los enfoques de modelado computacional y análisis de redes pueden detectar con precisión fármacos y objetivos potenciales, y el análisis multiplicativo de interacciones puede proporcionar una base teórica y una guía práctica para la verificación experimental. En este artículo, utilizando la herramienta de búsqueda para el retrival de genes/proteínas interactuantes (STRING), la base de datos de anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID), y otras bases de datos, combinadas con el análisis de ontologías genéticas dinámicas (GO) y análisis de vías, se recopilaron datos sobre los principios activos y proteínas de acción relacionadas del medicamento Dong LYXT para fiebre y tos, y se exploró el mecanismo del tratamiento combinado de los ingredientes activos. que puede proporcionar una referencia teórica específica para investigaciones posteriores sobre el medicamento Dong LYXT, proporciona una estrategia reproducible para explorar los mecanismos farmacológicos de las fórmulas etnomedicinales y ofrece perspectivas sobre el desarrollo de nuevos agentes antiinflamatorios.

Protocolo

El programa de experimentación animal ha sido revisado por el Comité de Ética Experimental de Animales de la Universidad de Lanzhou (D2024-292). Se ajusta a los principios de protección animal, bienestar animal y ética, así como a las disposiciones relevantes de la ética nacional experimental animal.

1. Preparación de la base de datos y el software

1. Cribado de ingredientes activos y recogida de genes objetivo
   1. Accede a la base de datos y plataforma de análisis de farmacología del sistema MTC (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) y realiza búsquedas separadas usando los nombres latinos de cada hierba en la formulación de LYXT, a saber, Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. y Zingiber officinale Roscoe, como palabras clave para recuperar todos los compuestos químicos asociados a cada hierba.
   2. Aplicar los criterios de cribado para filtrar los compuestos recuperados de cada hierba de la siguiente manera: para Verbena officinalis L., establecer la biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30,1% y la semejanza del fármaco (DL) ≥ 0,12; para Zingiber officinale Roscoe, fijar OB ≥ 60% y DL ≥ 0,13; para Semen Farbitidis, fija OB ≥ 16,93% y DL ≥ 0,50. Luego, fusiona las listas de compuestos filtrados de las tres hierbas y elimina entradas duplicadas basadas en identificadores TCMSP únicos para generar la lista final de compuestos activos en LYXT.
   3. Exporta todas las proteínas objetivo asociadas a estos compuestos activos desde la base de datos TCMSP como una tabla que contiene identificadores de compuestos y nombres de proteínas objetivo, y luego importa esta lista de proteínas objetivo a la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Utiliza la herramienta de mapeo de identificadores UniProtKB para convertir todos los nombres de proteínas objetivo en símbolos oficiales de genes humanos con el conjunto de direcciones de mapeo del nombre de la proteína al nombre del gen, y elimina cualquier entrada que careza de un símbolo génico válido para generar la lista final de genes objetivo asociados a los componentes activos de LYXT.
2. Recogida de genes objetivo de enfermedades y análisis de solapamientos
   1. Descarga genes relacionados con fiebre y tos de la base de datos GeneCards (www.genecards.org) buscando por separado con las palabras clave "fiebre" y "tos", conserva genes con puntuación de relevancia ≥ 5 y fusiona los resultados de ambas búsquedas dentro de la base de datos.
   2. Descarga genes relacionados con fiebre y tos de la base de datos terapéutica objetivo (TTD) (db.idrblab.net/ttd) buscando por separado con las palabras clave "fiebre" y "tos", descarga todos los genes objetivo asociados y fusiona los resultados de ambas búsquedas dentro de la base de datos.
   3. Descarga genes relacionados con fiebre y tos desde la base de datos PharmGkb (www.pharmgkb.org) buscando por separado con las palabras clave "fiebre" y "tos", descarga todos los genes asociados y fusiona los resultados de ambas búsquedas dentro de la base de datos.
   4. Descarga genes relacionados con fiebre y tos de la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (www.omim.org) buscando por separado con las palabras clave "fiebre" y "tos", descarga todos los genes asociados y fusiona los resultados de ambas búsquedas dentro de la base de datos.
   5. Descarga genes relacionados con fiebre y tos de la base de datos DrugBank (go.drugbank.com)⁸ buscando por separado con las palabras clave "fiebre" y "tos", descarga todos los genes asociados y fusiona los resultados de ambas búsquedas dentro de la base de datos.
   6. Fusionar las listas génicas obtenidas de las cinco bases de datos en una única lista integral y eliminar símbolos génicos duplicados para generar la lista final de genes objetivo relacionados con la fiebre y la tos.
   7. Compare la lista de genes objetivo de la enfermedad del paso 1.2.6 con la lista de genes objetivo de componentes activos de LYXT del paso 1.1.4 para seleccionar los genes solapados que son comunes a ambas listas, y exportar esta lista de genes superpuestos como un archivo CSV.
3. Conversión de ID y análisis de sección transversal
   1. Carga la lista de genes superpuestos del paso 1.2.7 en el entorno R y accede a la web de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Sube la lista de genes superpuestos a DAVID con la especie configurada en Homo sapiens y el tipo de lista en símbolo genético, luego ejecuta la herramienta de anotación funcional para realizar el análisis de sección transversal.
   3. Convierte los IDs de símbolos de las proteínas que se intersectan en IDs de conjunto usando la función de conversión de ID génico dentro de DAVID, estableciendo la dirección de conversión del símbolo del gen al ID del conjunto.
   4. Exporta la lista de ID de conjunto convertida junto con los símbolos génicos originales como un archivo CSV para el análisis de enriquecimiento posterior.

2. Cribado de los ingredientes activos vitales y las proteínas objetivo

1. Construcción de redes de objetivos compuestos
   1. Carga la lista de genes que se intersectan del paso 1.2.7 y la lista de genes objetivo de componentes activos LYXT del paso 1.1.4 en el entorno R, y luego realiza un análisis comparativo para identificar compuestos asociados tanto con los genes objetivo como con los genes que se intersectan.
   2. Importa los datos de relación compuesto-objetivo en Cytoscape versión 3.8.1 y genera el diagrama de red "LYXT-Fiebre y objetivo de tos" para visualizar las interacciones entre los principios activos y sus objetivos asociados.
2. Adquisición de datos sobre interacción proteína-proteína
   1. Importa el archivo de identificación génica de la intersección de los objetivos de principio activo de LYXT y los objetivos de fiebre y tos obtenidos en el paso 2.1.1 en la base de datos STRING en https://stringdb.org/, selecciona Homo sapiens como especie y múltiples proteínas como método de procesamiento de datos.
   2. Filtrar las interacciones proteína-proteína estableciendo el umbral de confianza a ≥ 0,90 y aislando proteínas con correlación muy baja, luego generar un archivo TSV que contenga los datos de interacción filtrados para análisis posteriores.
3. Confirmación del análisis de intersección
   1. Utilizar el lenguaje R para analizar la intersección entre las proteínas objetivo de los ingredientes activos y las proteínas objetivo de fiebre y tos, confirmando el conjunto génico superpuesto identificado en el paso 1.2.7.
   2. Prepara este conjunto de genes superpuestos confirmados para el análisis posterior de la red de interacción proteína-proteína (PPI).

3. Cribado de proteínas clave objetivo

1. Visualización de redes PPI
   1. Importa los datos de interacción filtrados del paso 2.2.2 a la versión 3.8.1 de Cytoscape y utiliza la herramienta de visualización de red para dibujar el diagrama de red PPI.
   2. Instala y abre el plugin CytoNCA dentro de Cytoscape, luego utiliza este plugin para realizar un análisis topológico calculando los siguientes parámetros para cada nodo de la red: centralidad de grado (DC), centralidad de intermedio (BC), centralidad de proximidad (CC), centralidad de vectores propios (EC), centralidad de red (NC) y conectividad promedio local (LAC).
2. Identificación de proteínas clave objetivo mediante cribado basado en mediana
   1. Exporta la tabla de parámetros topológicos calculados desde CytoNCA como un archivo CSV que contiene todos los identificadores de nodos y sus correspondientes valores DC, BC, CC, EC, NC y LAC.
   2. Calcula el valor mediano de centralidad de grados (DC) en todos los nodos de la red e identifica todos los nodos con DC mayor al doble del valor mediano.
   3. Calcular los valores medianos de centralidad de proximidad (CC) y centralidad de intermediedad (BC) en todos los nodos de la red, luego, a partir de los nodos identificados en el paso 3.2.2, conservar solo aquellos nodos que satisfacen simultáneamente CC mayor que el valor mediano y BC mayor que el valor mediano, siguiendo el enfoque de cribado descrito por Kibble et ^al.9.
3. Compilación final de objetivos clave
   1. Compila los identificadores de los nodos retenidos del paso 3.2.3 en una lista de proteínas clave objetivo y exporta esta lista como un archivo CSV.
   2. Aplicar esta regla de cribado basada en mediana (DC mayor del doble de la mediana, CC mayor que la mediana y BC mayor que la mediana) como único criterio para la identificación de objetivos clave en todo el manuscrito, asegurando la coherencia con el enfoque unificado de cribado establecido en el protocolo.

4. Análisis de enriquecimiento GO y análisis de vías KEGG

1. Análisis de enriquecimiento funcional utilizando la base de datos DAVID
   1. Siguiendo el método descrito por Tanabe et ^al.10, sube la lista de genes intersectantes del paso 1.3.4 en formato de símbolo génico a la base de datos DAVID en https://david.ncifcrf.gov/, establece la especie en Homo sapiens y el tipo de lista en símbolo génico.
   2. Realiza análisis de enriquecimiento GO seleccionando GOTERM_BP_DIRECT para el proceso biológico, GOTERM_CC_DIRECT para componente celular y GOTERM_MF_DIRECT para la función molecular, y realiza análisis de enriquecimiento de vías KEGG seleccionando KEGG_PATHWAY.
   3. Establezca el umbral de significación a p < 0,05 y aplica la corrección de tasa de descubrimiento de falsos de Benjamini-Hochberg (FDR) para múltiples pruebas, luego descarga los resultados del enriquecimiento como archivos CSV que contienen nombres de términos, recuento de genes, valores p, valores p ajustados por FDR y genes asociados.
2. Generación de gráficos burbujas usando la plataforma en la nube OmicShare
   1. Importa los resultados de enriquecimiento GO del paso 4.1.3 a la plataforma cloud de OmicShare en https://www.omicshare.com/tools y selecciona la herramienta de gráfico burbuja de enriquecimiento GO.
   2. Sube el archivo de resultados que contiene nombres de términos, recuento de genes y valores p, y luego configura la herramienta para mostrar los 20 términos principales con los valores p más bajos.
   3. Configura el eje x para representar la relación de enriquecimiento, el eje y para listar los términos GO, el tamaño de la burbuja para representar el recuento génico y el color de la burbuja para representar el valor p.
   4. Genera el gráfico de burbujas y descárgalo como un archivo de imagen de alta resolución.
3. Visualización de rutas KEGG usando KEGG mapper
   1. Ordena los resultados del enriquecimiento de vías KEGG por p-valor en orden ascendente y selecciona las 20 mejores vías con los valores p más pequeños.
   2. Para cada ruta seleccionada, accede a la base de datos KEGG en https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html para obtener el diagrama de vías.
   3. Identifica las proteínas objetivo de la lista de genes que se intersectan y que están presentes en cada vía cruzando referencias con los conjuntos génicos de la vía a partir de los resultados del enriquecimiento.
   4. Accede a la herramienta de mapeo KEGG en https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, selecciona la función Color Pathway , introduce la lista de símbolos génicos que se intersectan y el identificador de vías KEGG, y genera un diagrama de vías codificado por colores con las proteínas objetivo identificadas resaltadas en rojo.
   5. Compila todos los resultados del análisis de enriquecimiento, incluyendo los archivos CSV de enriquecimiento GO para tres categorías, el archivo CSV de enriquecimiento de rutas KEGG, la imagen del diagrama de burbujas y los diagramas de caminos codificados por colores para las 20 rutas principales, y luego exporta estos archivos para análisis posteriores.

5. Verificación de acoplamiento molecular

1. Descarga las estructuras 3D de proteínas vitales (como CYP3A4 y POR identificadas como objetivos clave en el análisis de la red) de la base de datos RCSB PDB en https://www.rcsb.org/, seleccionando estructuras con resolución ≤ 2,5 Å de Homo sapiens que contienen un ligando cocristalizado para definir el sitio activo, y descarga los archivos de datos estructurales de compuestos activos (incluido beta-caroteno, espatulenol, y beta-sitosterol) de la base de datos PubChem en formato SDF.
2. Prepara las estructuras proteicas usando AutoDockTools eliminando moléculas de agua y el ligando cocristalizado, añadiendo hidrógenos polares y asignando cargas de Gasteiger, luego guarda las proteínas preparadas en formato PDBQT, convierte los archivos SDF del compuesto a formato PDB usando Open Babel, detecta enlaces rotativos para cada ligando en AutoDockTools y guarda los ligandos en formato PDBQT.
3. Define la caja de la rejilla de acoplamiento con dimensiones de 60 × 60 × 60 Å centrada en las coordenadas del sitio de unión del ligando cocristalizado, luego realiza el acoplamiento molecular usando AutoDock Vina con exhaustividad ajustada a 8 y num_modes a 10 para generar 10 poses de unión para cada par ligando-proteína.
4. Importar los archivos de acoplamiento resultantes y sus correspondientes archivos de destino a PyMOL, identificar y guardar el modelo de acoplamiento con la energía de enlace más baja (valor más negativo) como pose representativa.
5. Después, envía este modelo a la base de datos PLIP a https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ para analizar las interacciones entre las moléculas pequeñas y las proteínas, incluyendo enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, apilado de π y puentes salinos.
6. Calcula y compila las energías de unión de todos los componentes activos en LYXT contra las proteínas objetivo asociadas a fiebre y tos, luego genera una tabla resumen que contenga nombres de compuestos, proteínas objetivo, energías de unión (kcal/mol) y tipos clave de interacción para su presentación en la sección de resultados.
   NOTA: El script R utilizado para el análisis de farmacología de redes está disponible en el Archivo Suplementario 1.

6. Experimento con animales

1. Cronología experimental
   1. Aclimatar a los animales durante una semana, luego realizar la administración de solución fisiológica o solución salina el día 0, administrar tratamientos farmacológicos diarios desde el día 7 hasta el día 20 durante 2 semanas, y realizar la eutanasia con recogida de muestras en el día 21.
2. Adquisición y agrupación de animales
   1. Compra 60 ratones machos adultos C57BL/6 ratones que pesen 25 ±± 4 g, alimenta a los ratones durante 1 semana y luego divídelos aleatoriamente en un grupo normal de solución salina (6 ratones) y un grupo con lesiones por LPS (54 ratones).
   2. El día 7 antes del inicio del tratamiento, se divide aleatoriamente el grupo lesionado por LPS en siete subgrupos con 6 ratones cada uno: grupo modelo, grupo positivo (dexametasona, 50 mg·^kg-1·^d-1), grupo de tratamiento LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupo beta-caroteno (50 mg·^kg-1·^d-1), grupo espatulenol (50 mg·^kg-1·^d-1), y grupo beta-sitosterol (50 mg·^kg-1·^d-1).
      NOTA: La administración del tratamiento y las evaluaciones de resultados fueron ciegas.
3. Modelo de inflamación pulmonar inducida por LPS
   1. Administrar un 2% de pentobarbital sódico mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 60 mg/kg para anestesia. Confirma una profundidad moderada de anestesia por ausencia de respuesta de pinzamiento en la cola. Finalmente, basándose en el peso corporal registrado, calcular el volumen de inyección requerido de LPS a una concentración de 10 mg/mL.
   2. Prepárate para la administración nasal extrayendo el volumen calculado con precisión de solución de LPS en la pipeta. Sujeta firmemente al ratón sujetando la base de su cola con la mano derecha, mientras que con el pulgar y el índice de la mano izquierda sujetas suavemente su cabeza por las orejas.
   3. Expulsa el líquido lentamente hasta que se forme una pequeña gota (aproximadamente 2 μL) en la punta de la pipeta. Acerca cuidadosamente la gota a la fosa nasal derecha del ratón hasta que haga contacto. Inmediatamente y rápidamente levanta la mano izquierda 30–40 cm hacia arriba, luego devuelva suavemente la mano izquierda junto con el ratón a la posición inicial.
      NOTA: Es necesario prestar atención a las fosas nasales del ratón para mantener el estado ascendente.
   4. Utiliza el mismo método para inyectar pequeñas gotas de líquido en la fosa nasal izquierda del ratón y añádelas sucesivamente en las fosas nasales izquierda y derecha hasta que la infusión de líquido esté completa.
   5. Luego suelta el ratón, fija el ratón en la placa con cinta y mantén la posición con el abdomen hacia arriba y la cabeza hacia arriba durante más de 4 horas. Después de que el ratón despierte, vuelve a colocarlo en la jaula para observarlo, siguiendo el método descrito por Lorenz et ^al.11.
4. Recogida de fluidos de lavado broncoalveolar
   1. Separar aleatoriamente los ratones del grupo lesionado por LPS en siete grupos: grupo control negativo, grupo modelo, grupo positivo (dexametasona, 50 ^mg.kg-1.d-1), grupo de tratamiento con LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), grupo beta-caroteno (50 ^mg.kg-1.d-1), grupo espatulenol (50 ^mg.kg-1.d-1) y grupo beta-sitosterol (50 ^{mg.kg-1.d-1),} con seis ratones en cada grupo.
      NOTA: Prepare LYXT de la siguiente manera: mezcle Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. y Zingiber officinale Roscoe en polvo en una proporción de masas de 5:3:2.  Mezcla el polvo con agua a 1:30 (g/mL) y reflujo a 80 °C durante 2 horas. Filtra y concentra la solución (30 °C, 0,01–0,08 MPa) y disuelva en agua para preparar una solución de 2 g/mL. Se utilizaron beta-caroteno, beta-sitosterol y espatulenol como estándares de referencia para la validación experimental. Administra los fármacos a cada grupo una vez al día durante 2 semanas, empezando una semana después del tratamiento LPS. Eutanasiar a los animales mediante una sobredosis de tiopental (100 mg/kg), según Jin et ^al.12.
   2. Intuba el ventrículo con una cánula nº 23. Luego, inyectar lentamente 10 mL de PBS en el tejido pulmonar bajo una presión de 25 cm de H₂O, y repetir este lavado aproximadamente 6 veces para obtener líquido de lavado broncoalveolar (BALF), siguiendo el método descrito por Pinheiro et ^al.13.
5. Análisis de leucocitos y citoquinas en BALF y suero
   1. Centrifugar el BALF recogido a 500 × g durante 10 minutos a 4 °C. Resuspende el pellet celular en 1 mL de PBS, diluye 1:10 con azul de tripán y cuenta el total de leucocitos usando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico a 400× de aumento.
   2. Recoge el sobrenadante BALF y las muestras de suero de la punción cardíaca.
   3. Mide las concentraciones de TNF-α, IL-1β e IL-18 utilizando kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante, leyendo la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas y calculando concentraciones a partir de curvas estándar. Determina la concentración de proteínas en BALF utilizando el ensayo BCA.
6. Validación de componentes activos mediante análisis HE y WB
   1. Para identificar los componentes activos que contribuyen a la eficacia de LYXT, restablecer el modelo de inflamación pulmonar inducida por LPS siguiendo la sección 6.3.
   2. Comprar 60 ratones, aclimatarse durante una semana y dividirlos aleatoriamente en cinco grupos (n = 12 cada uno): grupo modelo, grupo LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupo beta-caroteno (50 mg·^kg-1·^d-1), grupo espatulenol (50 mg·^kg-1·^d-1) y grupo combinado (25 mg·^kg-1·^d-1 cada uno).
   3. Administrar LPS el día 0 y tratamientos del día 7 al día 20 según se describe en el paso 6.3. En el día 21, recoge tejido pulmonar¹⁴.
7. Análisis histológico
   1. Fijar el lóbulo superior del pulmón izquierdo con paraformaldehído al 4% durante 24 horas, insumergirlo en parafina, cortar secciones de 5 μm y realizar tinción de hematoxilina y eosina (HE).
   2. Examinar secciones bajo un microscopio óptico a aumentos de 200× y 400× para evaluar la infiltración celular inflamatoria y el engrosamiento de la pared alveolar. Captura imágenes representativas.
8. Análisis de Western blot
   1. Homogeneizar tejido pulmonar mediante un tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) con inhibidores de proteasa y fosfatasa. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C y determinar la concentración de proteínas usando el ensayo de ácido bicincónico (BCA).
   2. Carga 30 μg de proteína por pozo sobre geles de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), transfiere a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y bloquea con leche desnatada al 5%.
   3. Incubar con anticuerpos primarios contra p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 y β-actina durante la noche a 4 °C, y luego con anticuerpos secundarios conjugados con HRP.
      NOTA: La dilución de los anticuerpos se proporciona en la Tabla de Materiales.
   4. Visualiza bandas usando sustrato ECL, captura imágenes y cuantifica las intensidades usando ImageJ. Normalizar la expresión de proteínas objetivo a β-actina o p38 total.

Resultados

La base de datos TCMSP se utilizó para recopilar 409 ingredientes activos de LYXT. De ellos, 58 ingredientes procedían de Verbena officinalis L., 86 de Semen Pharbitidis y 265 ingredientes activos procedían de Zingiber officinale Roscoe. Se examinaron veintiséis ingredientes activos clave según el índice: OB ≥ 30,1% y DL ≥ 0,12 para Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, DL ≥ 0,13 para Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93% y DL ≥ 0,50 para Semen Pharbitid...

Discusión

Este artículo identificó con éxito 26 ingredientes activos y 207 posibles objetivos de LYXT, una decocción tradicional de medicina Dong utilizada para la fiebre y la tos. Los hallazgos clave incluyen la identificación de CYP3A4 como proteína objetivo crítica mediante análisis de topología de la red, y la validación experimental de LYXT, beta-caroteno y espatulenol como compuestos activos con efectos antiinflamatorios significativos en un modelo de inflamación pulmonar inducida por LPS. E...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, China	27095-1-AP	Conejo policlonal, 1:500
Anti-IL-1 y beta;	Proteintech, Wuhan, China	66737-1-IG	Monoclonal de ratón, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, China	14064-1-AP	Policlonal de conejo, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, China	28796-1-AP	Policlonal de conejo, 1:1000
Anti-TNF-& alpha;	Proteintech, Wuhan, China	80258-6-RR	Conejo monoclonal, 1:500
Anti-β-actina	Proteintech, Wuhan, China	66009-1-IG	Monoclonal de ratón, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Versión 1.5.6	Software de acoplamiento molecular
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Versión 1.5.6	Herramienta de preparación del acoplamiento molecular
Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	23225	Para la determinación de concentración de proteínas
Betacaroteno	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	83-46-5	Estándar de alta pureza, >95%
Beta-sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	83-46-5	Estándar de alta pureza, >95%
Ratones C57BL/6	Centro de Animales Médicos de la Universidad de Lanzhou  	-	Hombre adulto, 25 años y más; 4 g
Cytoscape	https://cytoscape.org/	Versión 3.8.1	Software de visualización y análisis de redes
Dexametasona	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	D4902	Control positivo
Sustrato ECL	MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.	WBKLS0500	Para la detección de manchas occidentales
ELISA Kits
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Versión 8.0 o superior	Software de análisis estadístico y gráficos
Hematoxilina y eosina (H&; E) Kit de tinte	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekín, China	G1120	Para la tinción del tejido pulmonar
Histología
Anti-ratón conjugado con HRP	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7G	Anticuerpo secundario, 1:5000
Anti-conejo conjugado con HRP	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7H	Anticuerpo secundario, 1:5000
IL-18 ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekín, China	SEKH-0016	Para medir IL-18 en BALF y suero
IL-1 y beta; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekín, China	SEKM-0004	Para medir IL-1 y beta; en BALF y suero
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Versión 1.53	Software de análisis de imágenes
Lipopolisacáridos (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	L2630	From  Escherichia coli  O111:B4
Materias Primas de LYXT	Universidad de Huaihua	-	Mezcla en polvo de  Pharbitis nil  (L.) Elección,   Verbena officinalis L., and  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, gan/p/p)
Otros materiales
Pentobarbital sódico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	P3761	Solución al 2% para anestesia
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Perfilador de interacción proteína-ligando
Membranas PVDF	MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.	IPVH00010	Para la transferencia de Western blot
PyMOL	https://pymol.org/	Versión 2.5	Software de visualización molecular
R	https://www.r-project.org/	Versión 4.0 o superior	Software de computación estadística y gráficos
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-N1205	Estándar de alta pureza, >95%
STRING	https://stringdb.org/	-	Herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Base de Datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China
Tiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	T102	Para la eutanasia
TNF-& alfa; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekín, China	SEKM-0034	Para medir TNF-y alfa; en BALF y suero
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Base de datos de secuencias y anotaciones de proteínas