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Artículo de método

Senescencia asociada a la neurodegeneración: evaluación simultánea de la actividad de β gal y la mancha de Nissl en secciones histológicas del cerebro de roedores

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DOI:

10.3791/70676

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17 de julio de 2026

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo se presenta como una herramienta para detectar la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, para realizar tinción de Nissl para la evaluación simultánea de la senescencia y la integridad neuronal, y para investigar los vínculos entre la carga de la senescencia y la neurodegeneración.

Resumen

La senescencia celular es un proceso fisiológico caracterizado por una parada irreversible del ciclo celular que afecta la regeneración y función tisular. Este fenómeno ha surgido como un motor clave de la neurodegeneración, impulsado por la acumulación de células senescentes dentro del sistema nervioso central (SNC). Las células senescentes adquieren un fenotipo secretor asociado a la senescencia proinflamatorio (SASP) que sostiene la neuroinflamación crónica y altera el microambiente neuronal. En consecuencia, procesos esenciales como la neurogénesis, la plasticidad sináptica y la supervivencia neuronal se ven comprometidos. Un extenso cuerpo de literatura asocia la senescencia celular con varios trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la esclerosis múltiple, y daños neuronales agudos, como la isquemia cerebral o la lesión cerebral traumática.

La evaluación combinada de la actividad de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a la senescencia y la tinción de Nissl en secciones histológicas proporciona un enfoque integral para evaluar simultáneamente la senescencia celular y la integridad neuronal dentro del mismo contexto tisular. Esta estrategia permite una correlación espacial precisa entre la acumulación de células senescentes en regiones vulnerables específicas (por ejemplo, el hipocampo o la corteza) y la pérdida neuronal o el daño tisular. Al integrar un marcador funcional de senescencia con un indicador clásico de morfología y densidad neuronal, este enfoque refuerza la robustez interpretativa del análisis. Además, permite una caracterización más precisa de la relación entre la carga senescente y los cambios neurodegenerativos, maximizando la obtención de información a partir de muestras de tejido limitadas.

Además, este protocolo puede determinar cómo ocurre la acumulación de células senescentes en respuesta a intervenciones (farmacológicas, manipulación genética, etc.) en modelos de roedores de enfermedades neurodegenerativas, proporcionando así una herramienta poderosa para analizar esta contribución a su fisiopatología.

Introducción

La senescencia celular se define por una detención esencialmente irreversible del ciclo celular acompañada de extensas alteracionesmacromoleculares 1. Además, las células senescentes adquieren un fenotipo hipersecretor (SASP), caracterizado por la secreción robusta de una amplia variedad de citocinas proinflamatorias, factores de crecimiento yproteasas 2. En conjunto, estos factores contribuyen al establecimiento de un microambiente proinflamatorio que refuerza la senescencia e afecta la homeostasis tisular. En el SNC central, las células senescentes se acumulan progresivamente con la edad, especialmente en regiones vulnerables a patologías relacionadas con laedad 3. La senescencia celular desempeña un papel significativo en las alteraciones funcionales asociadas al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos, con la carga de las células senescentes aumentando progresivamente durante el envejecimiento normal. Múltiples tipos celulares dentro del SNC son susceptibles a la senescencia, incluyendo astrocitos, microglías, oligodendrócitos, neuronas y células madreneuronales 4. La acumulación de evidencia implica la senescencia de estas poblaciones celulares del SNC en la etiopatología de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la demencia frontotemporal, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosismúltiple 5. Se han relacionado trastornos neurodegenerativos con la senescenciacelular 6, y se ha demostrado que las células senescentes se acumulan cerca de placas de β amiloide y enredos neurofibrilares. Se han descrito aumentos relacionados con la edad en la actividad de SA-β-gal en cerebros de roedores (por ejemplo, 3, 8, 17 y 24 meses), con elevaciones estadísticamente significativas más evidentes en la cohorte de mayor edad (24 meses)7.

Diferentes estudios aportan importantes conocimientos sobre la relación entre alteraciones histológicas y resultados funcionales, como el deterioro cognitivo y la desregulación metabólica, en modelos animales patológicos que abordan los correlatos funcionales o conductuales de la lesión cerebral 8,9.

A pesar de la extensa investigación, no existe un marcador universal único que identifique de forma fiable las células senescentes distinguiéndolas de otros estados no proliferativos; sin embargo, el marcador más utilizado de la senescencia celular es la enzima lisosomal asociada a la senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal), que se detecta en pH 6, una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de β-galactósidos en monosacáridos. Un factor clave que lo distingue es el pH. La SA-β-gal muestra una actividad óptima en pH 6, en contraste con la β-galactosidasa bacteriana, que actúa a pH 7,4, y la β-galactosidasa lisosomal, endógena, que actúa a valores de pH ácidos que van de 3 a 5 7,10.

La densidad celular y la citoarquitectura cerebral son determinantes fundamentales de la organización y función neuronal. La distribución espacial y la abundancia de poblaciones celulares específicas son críticas para el funcionamiento del circuito, y su cuantificación precisa es esencial para estudiar condiciones neuropatológicas que implican vulnerabilidad o pérdida celular selectiva. La tinción de Nissl, un método estándar en neurociencia, es una técnica histológica ampliamente utilizada para evaluar la densidad neuronal y la citoarquitectura en el tejido nervioso. Al marcar selectivamente los cuerpos de Nissl dentro de los somata neuronales, este método permite una visualización y cuantificación fiable de poblaciones neuronales en las regionescerebrales 11. Además de su robustez, la tinción Nissl se caracteriza por su simplicidad técnica, bajo coste y tiempo de procesamiento relativamente corto, lo que la convierte en una herramienta práctica y accesible para estudios neuroanatómicos y de neurodegeneración rutinarios.

La evaluación combinada de la tinción de Nissl y la actividad de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a la senescencia dentro de la misma sección histológica proporciona un marco robusto y resuelto espacialmente para interrogar simultáneamente la integridad neuronal y la carga celular senescente. Este enfoque integrador permite el mapeo directo de la senescencia con características neurodegenerativas específicas de la región, incluyendo la pérdida neuronal y la alteración citoarquitectónica. Acoplar un marcador estructural clásico con un indicador funcional de senescencia fortalece la interpretación de los datos y revela vínculos mecanicistas entre la acumulación celular senescente y la disfunción tisular, maximizando al mismo tiempo el rendimiento analítico de muestras limitadas.

Es importante destacar que esta estrategia es especialmente adecuada para estudios con disponibilidad tisular limitada, diseños longitudinales o basados en intervenciones (por ejemplo, tratamientos senolíticos o senomorfos) y análisis específicos de región en estructuras cerebrales complejas, donde correlacionar la senescencia con la vulnerabilidad neuronal es fundamental.

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Protocolo

Realizar todos los procedimientos animales conforme a las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y obtener la aprobación previa del comité de ética correspondiente. Este protocolo cumple con la actual Norma Oficial Mexicana para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NOM-062-ZOO-1999 (Muñoz, 2001)), la revisión previa y aprobación por parte de los Comités de Ética e Investigación, y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). Los animales eran suministrados por el vivario de la Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina.

NOTA: Para permitir la evaluación simultánea de la actividad de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a la senescencia y la tinción de Nissl en tejido cerebral de roedores, este protocolo emplea cerebros de roedores fijados con paraformaldehído al 4% que son criosecados a -20 ± 1 °C. Todas las secciones se evalúan primero para detectar actividad de SA-β-gal (paso 1), luego se tiñen con Nissl (paso 2) y posteriormente se montan con un medio antifade (paso 3). Una vez procesadas, las láminas se examinan bajo un microscopio óptico de campo claro, lo que permite adquirir imágenes de alta resolución de las regiones de interés para su análisis posterior.

1. Preparación de secciones tisulares y detección de la actividad de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a la senescencia

  1. Preparación de secciones cerebrales
    1. Obtener el cerebro por perfusión transcardíaca con paraformaldehído al 4% siguiendo el protocolo descrito anteriormente por Wu et al., 202112. Transfiere los cerebros a una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,01% de azida de sodio para su almacenamiento a largo plazo a 4 °C.
    2. Para seguir el protocolo, coloca el cerebro en una solución de sacarosa al 30%, espera a que se hunda hasta el fondo y luego guárdalo a -20 a -80 °C. Este protocolo puede utilizarse en diferentes tejidos cerebrales de roedores (por ejemplo, rata, ratón, conejillo de indias) y congelarse en 2-metilbutano.
    3. Criosección del tejido a -20 ± 1 °C para obtener secciones uniformes incrustadas en un compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.) (20–40 μm de espesor) y montar sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina.
    4. Monta secciones sobre correderas de cristal y guárdalas en frío hasta que se usen.
  2. Detección de actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal).
    1. Prepara la solución de tinción de SA-β galones fresca el día de su uso a partir de las soluciones que se muestran en la Tabla 1.
    2. Ajusta la solución a pH 6,0 para asegurar la especificidad de la actividad de SA-β galón.
      NOTA: Prepara la solución de tinción de SA-β gal antes de usarla; Evita premezclar en una solución acuosa.
      El 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) no es estable en solución acuosa.
  3. Equilibra la temperatura de las láminas de tejido.
    1. Retira los portaobjetos del almacenamiento en frío.
    2. Coloca las láminas en un tarro de Coplin y déjalas equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos.
    3. Hidrata las secciones añadiendo suficiente PBS para cubrir las láminas del tarro de Coplin.
    4. Coloca las correderas sobre un agitador orbital de baja velocidad durante 5 minutos en RT.
    5. Repite la lavadora una vez.
  4. Prepara las láminas para teñir.
    1. Retira suavemente el exceso de PBS de los bordes de las diapositivas usando papel absorbente.
    2. Dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de cada sección usando un corral barrera repelente al agua, evitando el contacto con el tejido.
  5. Realizar tinción SA-β gal
    1. Coloca los portaobjetos en una cámara de humedad.
    2. Con una micropipeta, añade aproximadamente 200 μL de solución de tinción por sección, asegurando una cobertura completa del tejido.
    3. Incubar a 37 °C durante 48 horas.
    4. Tras la incubación, retira la solución de tinción usando papel absorbente.
    5. Coloca las láminas en un tarro de Coplin y añade PBS para cubrir las láminas, y añade una agitación suave en un agitador orbital de baja velocidad durante 5 minutos en RT.
      NOTAS: No utilice una incubadora de CO₂. Procede inmediatamente a la tinción Nissl.

2. Tinción de Nissl

  1. Prepara la solución de funcionamiento Nissl.
    1. Preparar soluciones de stock tal como se describe en la Tabla 2.
    2. A partir de las soluciones estándar, prepara la solución de trabajo Nissl mezclando 15 mL de solución de violeta cresil con 85 mL de tampón de acetato.
    3. Filtra la solución para eliminar los precipitados con papel filtro (grado 4, poro de 20-25 μm).
    4. Después de la solución filtrada, pre-calientar a 37 °C durante al menos 30 minutos (o 40–43 °C en baño maria).
    5. Añade 10 gotas de ácido acético 0,1 M inmediatamente antes de usarlas a la solución de trabajo Nissl.
      NOTA: Utilice la solución de trabajo Nissl hasta cuatro veces en el mismo día; No lo almacenes durante la noche.
    6. Prepara etanol acidificado añadiendo 95 mL de etanol absoluto a un matraz volumétrico y añadiendo 15 gotas de ácido acético 0,1 M. Lleva a 100 mL con agua destilada y mezcla bien.
  2. Precondiciona las correderas.
    1. Coloca las láminas en un tarro de Coplin y añade PBS según sea necesario para cubrir las láminas e incuba a 37 °C durante 5 minutos.
  3. Secciones de manchas.
    1. Sumerge cuidadosamente los deslizadores en la solución Nissl precalentada, diapositiva a diapositiva.
    2. Incuba las láminas durante 5–20 minutos en solución Nissl.
      NOTA: El tiempo depende del grosor del tejido. Monitorea el tinte cada 5 minutos hasta que aparezca un color púrpura intenso.
  4. Lava las secciones.
    1. Enjuaga las láminas suavemente con agua destilada durante 1 minuto. Transfiere a los portaobjetos en un tarro Coplin con agua destilada fresca durante 1 minuto adicional.
    2. Evalúa la calidad de las manchas. Observa las láminas bajo un microscopio de campo claro (10× objetivo).
    3. En un microscopio de campo claro, confirma una intensa tinción de puntos púrpura con fondo mínimo.
      NOTA: Si el fondo es excesivo, sumerge las láminas en etanol acidificado al 95% durante 10 segundos.
    4. Transfiere inmediatamente a etanol absoluto durante 10 segundos para detener la diferenciación.
      NOTA: Retener si es necesario, repitiendo los pasos de tinción (8.1-9.3) si la coloración es débil.
  5. Deshidrata y limpia las láminas.
    1. Sumerge los portaobjetos en xileno durante al menos 5 minutos (hasta 2 horas si es necesario)
      NOTA: Trabaja rápido, ya que el tejido se deshidrata en ~2 minutos.

3. Montaje

  1. Prepara el medio de montaje
    1. Mezcla 8 mL de medio de montaje con 2 mL de xileno.
      NOTA: Prepara solo el volumen requerido; El medio de montaje se endurecerá rápidamente.
    2. Retira las láminas del xileno y separa los bordes suavemente. Coloca los tobogáns sobre una superficie plana.
    3. Aplica ~120 μL del medio de montaje sobre el tejido.
    4. Coloca la funda despacio desde un lado para evitar burbujas.
  2. Seca las diapositivas y adquiere imágenes.
    1. Deja que las diapositivas se sequen al menos 5 minutos en tiempo de descanso.
    2. Observa bajo un microscopio de campo brillante y adquiere imágenes de regiones de interés.
    3. Después del montaje, el secado completo del medio de montaje requiere un tiempo prolongado (24 horas).
  3. Guarda las diapositivas.
    1. Guarda las diapositivas en RT para su conservación a largo plazo (durante muchos meses).

4. Cuantificación de la carga de senescencia

NOTA: Este enfoque se aplica como una evaluación cualitativa; sin embargo, cuando el diseño del estudio lo requiera, puede ampliarse para incluir el análisis cuantitativo.

  1. Definir la carga de senescencia como la abundancia relativa de células β-galactosidasa (SA-β-gal)–positivas asociadas a la senescencia dentro de una región de interés (ROI) definida. Expresa esta métrica como un porcentaje de celdas positivas en relación con el número total de celdas, o como la densidad de celdas positivas por unidad de área (celdas/mm2).
  2. Seleccionar la región de interés (ROI). Identificar los ROI basándose en hitos neuroanatómicos estandarizados utilizando un atlas cerebral apropiado para la especie y la edad. Las regiones recomendadas incluyen subcampos hipocampos (CA1, CA3, giro dentado) y áreas corticales con organización laminar definida.
    1. Selecciona 3–5 campos no solapados por ROI por sección.
    2. Analizar al menos 2–3 secciones por animal, espaciadas en intervalos anatómicos consistentes.
    3. Mantener el mismo tamaño y forma de retorno de inversión en todas las muestras.
    4. Cega al operador ante las condiciones experimentales durante la selección del ROI para minimizar el sesgo.
  3. Adquiere imágenes.
    1. Adquirir imágenes utilizando un microscopio de campo claro equipado con una cámara digital bajo condiciones estandarizadas:
      1. Utiliza aumentos consistentes (por ejemplo, 10× para la visión regional, 20× o 40× para cuantificación).
      2. Mantener una iluminación constante, tiempo de exposición y balance de blancos en todas las muestras.
      3. Evita la saturación de la señal SA-β-gal (azul) y asegura una visualización clara de la tinción de Nissl (morada).
      4. Guarda las imágenes en un formato sin pérdidas (por ejemplo, TIFF) para análisis posteriores.
  4. Preprocesa las imágenes.
    1. Realizar preprocesamiento usando software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ/Fiji)13.
      1. Convierte imágenes a formato RGB si es necesario.
      2. Aplica la resta de fondo para corregir la iluminación desigual.
      3. Normalizar el contraste de forma uniforme en todas las imágenes sin alterar la intensidad relativa de la señal.
      4. Evita el sobreprocesamiento que pueda distorsionar los límites de la señal.
  5. Identificar células SA-β-gal-positivas.
    1. Definan las células positivas basándose en la presencia de un precipitado azul distinto localizado dentro del citoplasma. Utiliza umbrales de color para aislar la señal azul (por ejemplo, rangos de tono/saturación/intensidad determinados empíricamente).
    2. Validar los umbrales usando controles negativos (tejido joven o no tratado) para excluir la tinción de fondo.
  6. Confirmar la consistencia morfológica con los perfiles celulares observados en la tinción de Nissl.
  7. Enfoques de cuantificación
    1. Cuantificación basada en celdas: Contar las células SA-β-gal-positivas manualmente o utilizando herramientas semi-automatizadas. Determina el número total de celdas dentro del mismo ROI usando tinción Nissl.
    2. Expresar los resultados como:
      Carga de senescencia (%) = (células positivas de β gal de glucosa/Células totales) ' 100
    3. Cuantificación basada en densidad: calcular el número de celdas SA-β-gal–positivas por unidad de área:
      Densidad celular = Celdas positivas/área ROI (mm2)
    4. Definición de umbrales y controles: Establecer los umbrales de detección empíricamente:
    5. Utiliza controles negativos para definir los niveles de señal de fondo.
    6. Incluye controles positivos (por ejemplo, tejido cerebral envejecido o modelos inducidos por estrés) para validar la sensibilidad.
    7. Aplica ajustes de umbral idénticos en todas las muestras dentro de un experimento. Documenta todos los parámetros umbral para asegurar la reproducibilidad.

5. Normalización de datos y análisis estadístico

  1. Normalizar la carga de senescencia para tener en cuenta las diferencias regionales en la densidad celular; usar tinción de Nissl para estimar el número total de células por ROI—mediciones medias entre ROIs, secciones y animales. Realizar análisis estadísticos utilizando pruebas adecuadas (por ejemplo, t-test, ANOVA) dependiendo del diseño experimental.
  2. Informa los datos como media ± SEM o SD, especificando el número de réplicas biológicas (n).
  3. Cegamiento y reproducibilidad: Realizar todos los análisis de cuantificación en condiciones de cegamiento. Validar la reproducibilidad mediante: (a) Análisis independiente por al menos dos observadores, o (b) Re-análisis de un subconjunto de imágenes para evaluar la variabilidad intra-observador.
  4. Limitaciones de la estrategia de cuantificación: Interpretar los resultados cuantitativos junto con marcadores complementarios cuando sea posible. Además, la variabilidad en la intensidad de la tinción entre secciones puede influir en la cuantificación basada en umbrales y debe controlarse cuidadosamente.

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Resultados

La aplicación combinada de la tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) y la tinción de Nissl permite la visualización simultánea de la carga celular senescente y la citoarquitectura neuronal dentro de la misma sección cerebral.

Tras el procedimiento de tinción de SA-β galones (paso 1), examina las láminas bajo un microscopio de campo claro. La tinción exitosa se indica por la presencia de un precipitado azul distinto localizado dentro de...

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Discusión

Actualmente, la limitada disponibilidad de herramientas robustas y específicas para identificar, aislar y eliminar selectivamente células senescentes en el SNC sigue siendo una barrera importante para los estudios mecanicistas. Esta brecha metodológica limita nuestra capacidad para separar las contribuciones causales de la senescencia celular a la neuropatología de la mera correlación con la progresión de la enfermedad. El flujo de trabajo presentado aquí combina la detección enzimática ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, UNAM (PAPIIT IN224624), y los programas de la Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) Ciencia de Frontera CBF-2025-I-1337 y el Programa Posdoctoral de UNAM (POSDOC). RJRC recibió el número de beca 1020262 del CONAHCyT. VSV recibió una beca postdoctoral del Programa de Becas Postdoctorales, Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA), UNAM.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-metilbutaneSIGMAM32631-500ML
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-Gal)PROMEGAV394AAlmacenar a -30 a -10 °C
Ácido cítrico MERCK251275-5G
Cresil violeta acetatoSIGMAC5042-10G
Montante DPX para histologíaSIGMA06522-500ML
Papel filtroWhatmanWHA1001929
Ácido acético glacialSIGMA695092-500ML
Pluma hidrofóbica MERCKZ672548
Xileno de grado histológicoSIGMA534056-500ML
Cámara de humedadSTAINTRAY25501
Cloruro de magnesio anhidroSIGMAM8266-100GAjustar molaridad si se usa cloruro de magnesio hidratado.
OCTSAKURA FINE TEK4583
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SIGMAP4417-50TABSe utilizan tabletas comerciales.
Ferricianuro de potasio (hexacianoferrato(III) de potasio)SIGMAP8131-100G
Ferrocianuro de potasio (hexacianoferrato(II) de potasio trihidrato)SIGMAP9387-100G
Acetato de sodio anhidroSIGMAS2889-250GAjustar molaridad si se usa acetato de sodio hidratado.
Cloruro de sodioSIGMAS9888-2.5KG
Fosfato sódico (Fosfato sódico dibásico dodecahidrato)SIGMA71649-500G

Referencias

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