Los agregados de Pseudomonas aeruginosa demuestran una mayor tolerancia a antibióticos y células inmunitarias. El papel de la integridad de la membrana en la supervivencia agregada está actualmente poco explorado. Este estudio demuestra un método para cuantificar los cambios en la dinámica de la membrana celular dentro de agregados de P. aeruginosa para entender cómo la integridad celular puede afectar la viabilidad global de los agregados.
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Artículo de método
Imagen en tiempo real de la respuesta al estrés inducido por el huésped en agregados de Pseudomonas aeruginosa
En este artículo
Resumen
Resumen
Las infecciones crónicas como las de la fibrosis quística (FQ) se mantienen por pequeños agregados de Pseudomonas aeruginosa altamente tolerantes que persisten a pesar de las presiones inmunitarias y terapéuticas. A diferencia de los biofilms clásicos, estos agregados representan una unidad patogénica distinta: comunidades a microescala, organizadas espacialmente, que mantienen la integridad estructural y la homeostasis fisiológica bajo estrés inducido por el huésped. Sin embargo, los mecanismos que permiten que los agregados permanezcan intactos bajo estas condiciones, y si estos procesos homeostáticos pueden ser interrumpidos selectivamente, siguen estando poco definidos. Una barrera clave para abordar esta brecha ha sido la falta de herramientas capaces de captar los procesos dinámicos y espacialmente resueltos que vinculan el estrés fisiológico con la estabilidad estructural y el colapso en tiempo real. Este estudio presenta un flujo de trabajo integrado de imágenes y análisis para cuantificar respuestas agregadas a factores de estrés relevantes para el huésped. Utilizando el colorante sensible al voltajeDiBAC 4(5), se monitorizó la despolarización de membrana como un indicador temprano de la alteración fisiológica en los agregados formados en el medio sintético de esputo para fibrosis quística (SCFM2). La microscopía confocal time-lapse de alta resolución permite la visualización de agregados tanto en estados estables como inducidos por estrés, mientras que la segmentación de imágenes y el análisis basado en vóxeles proporcionan un mapeo cuantitativo de la heterogeneidad espacial en la integridad de membranas y el desensamblaje de agregados a resolución de célula única. Este flujo de trabajo establece una plataforma reproducible y adaptable para vincular el estrés fisiológico con los resultados estructurales en agregados bacterianos multicelulares. Al permitir la disección cuantitativa de los procesos que preservan —o comprometen— la integridad de los agregados, este enfoque proporciona una base crítica para identificar y dirigir los mecanismos homeostáticos que sustentan la resiliencia de los agregados, impulsando nuevas estrategias para interrumpir este modo clínicamente significativo de persistencia bacteriana.
Introducción
Las infecciones bacterianas crónicas a menudo se mantienen no por grandes biopelículas unidas a la superficie, sino por pequeños agregados multicelulares que se forman en ambientes asociados al huésped. En la fibrosis quística (FQ) y otras enfermedades crónicas de las vías respiratorias, Pseudomonas aeruginosa suele existir como agregados suspendidos incrustados en el moco o el esputo, en lugar de como biopelículas clásicas adheridas a superficies epiteliales. Estos agregados representan un modo de crecimiento distinto, caracterizado por una organización espacial a microescala, una marcada heterogeneidad fisiológica y una tolerancia excepcional a factores de estrés inmunitario y antimicrobiano 1,2,3,4. A pesar de su relevancia clínica, los mecanismos que rigen la estabilidad de agregados, que en este protocolo se define como la capacidad de mantener la integridad de la membrana y la organización espacial bajo tales factores de estrés, siguen siendo poco comprendidos, ya que estudios previos se centran más en los componentes matriciales que soportan la formación de biopelículas unidas a la superficie 5,6 .
Una barrera importante para estudiar eventos que contribuyen a la desestabilización de agregados, como los cambios en la despolarización de membranas y la arquitectura de agregados, es la falta de flujos de trabajo experimentales que capturen cambios fisiológicos y estructurales dinámicos en tiemporeal 7,8. Los ensayos masivos tradicionales y los enfoques de imagen de punto final no pueden resolver cómo surgen las respuestas al estrés dentro de los agregados, cómo estas respuestas se distribuyen espacialmente o cómo el debilitamiento fisiológico, como la despolarización de membranas y la pérdida de la homeostasis iónica, se traduce en signos tempranos de estrés celular y eventual colapso físico. Aunque la microscopía confocal se ha aplicado ampliamente a biopelículas adheridas a superficies, menos enfoques integran imágenes resueltas en el tiempo con análisis cuantitativo que vinculan directamente la fisiología celular con la arquitectura agregada y la actividad de membranas.
Los cambios en el potencial de membrana bacteriana proporcionan un indicador temprano y sensible del estrés celular y la pérdida de homeostasis. Los colorantes sensibles al voltaje, como el bis-(1,3-dibutilbarbitúrico) y la pentametina oxonol (DiBAC4(5)) se acumulan en las células despolarizadas y ofrecen una lectura no destructiva basada en fluorescencia de la integridad de la membrana. Aunque los tintes DiBAC se han utilizado para evaluar la despolarización de membranas en cultivos planctónicos y biopelículas unidas asuperficies 9,10, su aplicación a agregados multicelulares, especialmente bajo condiciones de crecimiento fisiológicamente relevantes e imágenes en lapso de tiempo, ha sido limitada.
Aquí presentamos un flujo de trabajo integrado de imagen y análisis que permite la visualización y cuantificación en tiempo real de la despolarización de membranas y la falla estructural en agregados de P. aeruginosa. Los agregados se forman en un medio sintético para fibrosis quística (SCFM2), un medio definido químicamente que recapitula características nutricionales e iónicas clave de la vía aérea de la fibrosis quística y favorece la formación espontánea de agregados sin superficies impuestas ni flujo11,12. En estas condiciones, P. aeruginosa forma agregados suspendidos de tamaños y heterogeneidad estructural comparables a los observados en muestras de esputo y vías respiratorias de FQ, proporcionando una plataforma fisiológicamente relevante para estudiar el comportamientoagregado 13.
Utilizando microscopía láser confocal de lapso de tiempo bajo temperatura y humedad controladas, este flujo de trabajo captura tanto estados agregados estables como estados inducidos por estrés, caracterizados por un aumento de la despolarización de membrana y pérdida de homeostasis celular durante períodos de imagen prolongados. Al combinar la información de potencial de membrana basada en DiBAC con imágenes z-stack de alta resolución, este método permite cuantificar la fluorescencia de DiBAC₄(5) a nivel de célula única, con valores mapeados y analizados dentro del contexto espacial de agregados individuales. La segmentación de imágenes aguas abajo y el análisis superficial basado en vóxeles permiten cuantificar en paralelo los cambios en la arquitectura de agregados y la despolarización de membrana.
Es importante destacar que, aunque este protocolo se demuestra utilizando agregados de P. aeruginosa formados en SCFM2, el flujo de trabajo es ampliamente generalizable. La estrategia de imagen, la lectura fisiológica basada en colorantes y el marco analítico pueden adaptarse fácilmente a otras especies bacterianas, medios promotores de agregados y factores estresantes, incluidos agentes antimicrobianos, efectores inmunes o perturbaciones ambientales. Por ello, este enfoque proporciona una plataforma transferible y reproducible para interrogar la estabilidad de las comunidades bacterianas en diversos contextos experimentales.
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Protocolo
Todo el trabajo con P. aeruginosa debe realizarse bajo las condiciones adecuadas de contención BSL-2 y las aprobaciones institucionales de bioseguridad. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Generación de agregados de Pseudomonas aeruginosa en medio sintético para fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: Este paso describe la preparación de cultivos de P. aeruginosa y la formación de agregados multicelulares suspendidos bajo condiciones fisiológicamente relevantes que imitan el entorno de las vías respiratorias de la fibrosi quística.
- Preparación de cultivos bacterianos
- El día antes del experimento, inocular la Pseudomonas aeruginosa PAO1 de tipo salvaje que transporta el plásmido pMRP9-1 (GFP)14 de reservas de glicerol congelado en 5 mL de caldo de lisógena (LB).
- Añadir carbbenicilina (300 μg/mL) para mantener la selección de plásmidos.
- Cultiva los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
- Redilución y preparación para la formación de áridos
- El día del experimento, se diluyen los cultivos nocturnos 1:5 (1 mL durante la noche: 4 mL LB. No se reañaden antibióticos en esta fase; la retención residual es mínima y no afecta al crecimiento).
- Cultivar cultivos durante ~2 horas a 37 °C con agitación (200 rpm) para alcanzar la fase logarítmica.
NOTA: Las células suelen estar en la fase exponencial temprana tras ~2 horas bajo estas condiciones. Además, las células se lavan posteriormente antes de la inoculación en SCFM2 para minimizar cualquier residuo de antibióticos.
- Preparación y equilibrio de SCFM2
- Aproximadamente 30 minutos antes del final del periodo de retrodilución, alicuota preprepara SCFM2 en tubos estériles y calienta a 37 °C.
- Para la imagen en una antena óptica de fondo de vidrio de 4 pozos, asignar 500 μL SCFM2 por pozo. Prepara el volumen excesivo para compensar el error de pipeteo.
NOTA: SCFM2 se almacena a 4 °C. El precalentamiento minimiza el choque térmico y mejora la reproducibilidad de la formación de agregados.
- Lavado y estandarización del inóculo
- Cultivo pellets por centrifugación a 4200 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Si se requieren cálculos a rpm (rpm), el radio del rotor del cubo oscilante es de 172 mm. - Retirar el sobrenadante y volver a suspender los pellets en 3 mL de PBS estéril (pH 7,0).
- Repite los pasos de lavado dos veces más (un total de tres lavados).
- Mide OD₆₀₀ y calcula el volumen necesario para inocular SCFM2 a un OD₆₀₀₀ inicial de 0,05.
- Vórtice brevemente para homogeneizar células e inocular cada pozo que contiene 500 μL de SCFM2.
- Cultivo pellets por centrifugación a 4200 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
- Formación de agregados en condiciones estáticas
- Incubar el SCFM2 inoculado estáticamente a 37 °C durante 4 horas para permitir la formación de agregados.
NOTA: Una incubación de 4 horas produce de forma reproducible agregados suspendidos con tamaños y heterogeneidad comparables a los observados en muestras de esputo y vías respiratorias de fibrose quística, minimizando la maduración de biofilm en etapasposteriores 1,15.
- Incubar el SCFM2 inoculado estáticamente a 37 °C durante 4 horas para permitir la formación de agregados.
2. Preparación del estresor inmunitario asociado (elastasa neutrófila humana)
NOTA: Este paso describe la preparación de un estresor derivado del huésped utilizado para inducir estrés celular y desestabilización de agregados bacterianos.
- Reconstitución y almacenamiento de elastasa de neutrófilos humanos (HNE)
- Reconstituir la elastasa de neutrófilos humanos según las recomendaciones del fabricante usando 50 mM de acetato de sodio, 200 mM de NaCl y agua estéril.
- Prepara una solución de base de 50 μg/L y esteriliza con filtro usando un filtro de 0,2 μm.
- Alicota en volúmenes de 50 mL y almacena a −20 °C.
- La noche antes de usarla, descongela una alicuota a 4 °C.
NOTA: La alicuación minimiza los ciclos de congelación-deshielo, lo que puede reducir la actividad enzimática e introducir variabilidad. Las alicuotas se mantienen estables a 4 °C durante aproximadamente un mes.
3. Preparación y aplicación de DiBAC4(5) para informar sobre la despolarización de membrana
NOTA: Este paso describe la preparación y el uso de un tinte sensible al voltaje para visualizar la despolarización de membrana dentro de los agregados.
- Preparación y almacenamiento de DiBAC4(5)
- Comienza preparando una solución estándar de DiBAC4(5). Reconstituye el polvo deDiBAC 4(5) en DMSO anhidro a 1 mg/mL.
NOTA: La reconstitución del DiBAC4(5) en DMSO sigue las recomendaciones estándar del fabricante. - Alicota en volúmenes de 100 μL y almacenada a −20 °C protegida de la luz.
- Usa cada alicuota no más de dos veces.
NOTA: DiBAC4(5) es funcionalmente equivalente a DiBAC4(3) pero se selecciona aquí para coincidir con los espectros de excitación/emisión de GFP. En este protocolo, DiBAC4(3) se utiliza únicamente para una tinción adicional que se discute en la sección de resultados. El colorante principal utilizado en todo este protocolo es DiBAC4(5).
- Comienza preparando una solución estándar de DiBAC4(5). Reconstituye el polvo deDiBAC 4(5) en DMSO anhidro a 1 mg/mL.
4. Imagen confocal en lapso de tiempo de la despolarización de membrana en agregados de P. aeruginosa
NOTA: Este paso describe la adquisición de imágenes confocales de alta resolución y resolución temporal para capturar cambios fisiológicos y estructurales dinámicos en los agregados.
- Microscopio y preparación de cámaras ambientales
- Instala un inserto de microplaca calefactada o una cámara ambiental en la etapa del microscopio confocal.
- Activa el control de temperatura y humedad al menos 1 hora antes de la imagen y ponlo a 37 °C.
- En la pestaña de Adquisición , localice la pestaña Láser y, aproximadamente 1 hora antes de su uso, encienda los láseres necesarios para permitir un calentamiento adecuado (láser de argón para GFP; DPSS 561-10 para DiBAC4(5)) (Figura suplementaria 1A).
NOTA: El control ambiental estable reduce la deriva de enfoque y preserva la integridad de los agregados durante experimentos de largo tiempo y tiempo.
- Aplicación del factor de estrés inmunitario
- Tras 4 horas de formación de agregados, se añade HNE a pozos experimentales hasta una concentración final de 20 μg/L16.
- Deja los pozos de control sin tratar.
- Transfiere la antena de 4 pozos a la etapa del microscopio.
NOTA: La HNE se preparó en concentraciones fisiológicamente relevantes (μg/L), basándose en los niveles reportados en esputo inducido, en lugar de como un stock concentrado. Las concentraciones utilizadas para este estudio pueden encontrarse en McGarvey et al.16 bajo IS (esputo inducido), NE-AAT (complejo NE/a1-antitripsina) HV (voluntario sano).
- Identificación de regiones agregadas de interés
- Utilizando la pestaña Localizar y un objetivo de 20×, enciende la Luz Transmitida para identificar regiones ricas en agregados mediante imágenes en campo claro (Figura suplementaria 1B).
- Mientras sigas usando imágenes de campo brillante, navega a la pestaña de Adquisición y guarda las coordenadas x, y y z usando el módulo Posiciones (Figura suplementaria 1C).
- Repite para múltiples réplicas técnicas por pozo.
- Adquisición de z-stack y series temporales de alta resolución
- Muévete a una posición guardada y cambia a un objetivo de inmersión en aceite del 63×.
- Aplica aceite de inmersión antes de colocar el plato.
- En la pestaña de Adquisición , configurar canales usando Smart Setup (Figura suplementaria 1D): GFP (488/509 nm) – asignar verde, DiBAC4(5) (591/615 nm) – asignar rojo.
- Navega hasta la vista en directo , luego usando el módulo Z-stack , identifica la parte inferior del abrigo ajustando el enfoque fino y luego configúrala como la primera posición z haciendo clic en Configurar primero (Figura suplementaria 1E).
- Sube hasta que el rango indique 60 μm y establece la posición final z haciendo clic en Definir el último (Figura suplementaria 1E).
- Desactiva la vista en directo y activa el enfoque definido. Selecciona Buscar superficie y, posteriormente, selecciona Almacenar Enfoque solo una vez que el estado indique Reflejo Encontrado (Figura suplementaria 1F).
- Repite la calibración de enfoque para cada posición guardada usando los módulos Z-stack y Definite Focus .
- Configura la adquisición por series temporales para obtener imágenes de cada posición cada 3 minutos durante 6 horas (Figura suplementaria 1G).
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí para descongelar, añadir e incubar el tinte DiBAC4(5), y puede reanudarse tras el periodo de incubación. - Selecciona Iniciar experimento.
NOTA: Los intervalos de tres minutos equilibran la resolución temporal con consideraciones de fototoxicidad y fotoblanqueamiento.
- Adición e incubación de DiBAC4(5)
- Añadir DiBAC4(5) a cada pozo hasta una concentración final de 5 μg/mL9.
- Incubar en la oscuridad durante 30 minutos antes de iniciar la imagen en time-lapse.
NOTA: Esta incubación permite el equilibrio del colorante minimizando la fluorescencia de fondo.
5. Análisis cuantitativo de imágenes de la estructura de agregados y colocalización deDiBAC 4(5)
NOTA: Este paso describe un flujo de trabajo cuantitativo para vincular la despolarización de membranas con la arquitectura de agregados y la desestabilización.
- Importación de imagen y separación de canales
- Sube archivos de imagen (.czi o equivalente) a Imaris x64 versión 10.2.0 o superior.
- Verifica la calibración de los vóxeles comprobando que las dimensiones de los píxeles x, y y z (tamaño del vóxel) en los metadatos de la imagen reflejen con precisión los parámetros de adquisición confocal (objetivo, zoom, tamaño z-step). Una calibración incorrecta conducirá a errores en las mediciones espaciales y volumétricas.
- Renderizado superficial de agregados bacterianos y señal de DiBAC4(5)
- Utiliza el módulo Superficies para renderizar agregados de P. aeruginosa :
- En Configuración de segmentación, seleccione el canal GFP (Figura suplementaria 2A).
- Seleccione activar División de Objetos que Tocan (Región Crecente) y ajuste el umbral de intensidad para capturar completamente los agregados (Figura suplementaria 2B).
- Bajo el módulo Filter Seed Points , cambia el tipo de filtro a Número de vóxeles Img = 1 y ponlo en 90% (Figura suplementaria 2C).
- Tras procesar el renderizado, ajusta las superficies al 100% (Figura suplementaria 2D).
- Completar el renderizado y asignar coloración verde a las superficies bacterianas (Figura suplementaria 2E).
- Repite el renderizado para el canal DiBAC4(5) y asigna el color rojo.
- Utiliza el módulo Superficies para renderizar agregados de P. aeruginosa :
- Colocalización y cuantificación basada en volumen
- Seleccione el renderizado de superficieDiBAC 4(5) (Figura suplementaria 3A) y determine en qué punto(s) temporal(es) se realizará el análisis de colocalización.
- Navega a Estadísticas > pestaña Detallada > Valores Específicos (Figura Suplementaria 3B).
- Defina la colocalización seleccionando objetos con una Distancia Mínima a las Superficies Bacterianas de 0,00 (Figura Suplementaria 3B).
- Localiza Edita y luego duplica estos objetos para generar una superficie que se superpone con las células en DiBAC (Figura suplementaria 3C). Asegúrate de renombrar esta superficie para indicar sus características superpuestas.
- En la pestaña Detallado bajo Valores Medios, registra los valores de volumen sumados en cada momento(s) seleccionado(s) para: (1) Señal Total de DiBAC4(5) (Figura suplementaria 3D); (2) Señal DiBAC4(5) colocalizada (Figura suplementaria 3E).
- Calcular el solapamiento porcentual como:
NOTA: El solapamiento porcentual refleja la proporción de señal de DiBAC₄(5) asociada a células dentro de los agregados, reflejando la despolarización de la membrana en un momento determinado.
NOTA: Aunque se ha demostrado usando agregados de P. aeruginosa en SCFM2 y se ha estresado con HNE, este flujo de trabajo es ampliamente adaptable a otras especies bacterianas, medios promotores de agregados, reporteros fluorescentes y factores estresantes, incluidos agentes antimicrobianos o perturbaciones ambientales.
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Resultados
En el protocolo descrito anteriormente se proporciona un método para rastrear cambios en la dinámica de membranas de agregados de P. aeruginosa modelados en un entorno pulmonar con fibrosis quística (Figura 1). Utilizando una cepa tipo salvaje de PAO1 que transporta un plásmido pMRP9-1 (GFP) (Figura 1A), HNE para simular el estrés inmunitario y el tinte de membrana DiBAC4(5) (
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Discusión
El potencial de membrana sirve como una lectura sensible y temprana del estrés celular y la alteración de la homeostasis. Dentro de los agregados bacterianos multicelulares, estos cambios fisiológicos ocurren antes y pueden provocar una posterior desestabilización estructural. Aquí presentamos un flujo de trabajo basado en imágenes que utiliza el tinte de respuesta lenta y sensible al potencial de la pentametina oxonol (DiBAC4(5)) para seguir la despolarización en agregados
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
S.E.D. cuenta con fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como con subvenciones de investigación de la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(3)) | AAT Bioquest | 21411 | molécula lipofílica, aniónica |
| ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC4(5)) | AAT Bioquest | 21410 | molécula lipofílica, aniónica |
| Carbenicilina | Productos de investigación internacional y nbsp; | C46000-5.0 | utilizado para la selección de cepas expresoras de GFP de PAO1 |
| Plato de vidrio Cellvis de 4 cámaras y 35 mm | Fisher | NC0600518 | la placa de cámara de fondo de vidrio permite la mantenencia de agregados suspendidos en el medio de cultivo durante la imagen |
| Centrifugadora | Beckman Coulter Ciencias de la Vida | B06320 | acoplado con el rotor de cubeta basculante Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (número de pieza B01425) |
| Microscopio de barrido láser confocal (CLSM) | Zeiss | LSM 880 | el modelo de CLSM utilizado para los experimentos descritos en este protocolo ya no está disponible, pero el LSM 900 es una opción equivalente actualizada |
| Tubos de cultivo | Genesee | 21-130 | estéril; polipropileno y nbsp; |
| DAPI | Thermo Fisher | 62248 | utilizado para aplicaciones futuras propuestas de tinción de neutrófilos con DiBAC4(5) |
| Cuvettes desechables | Tecnología de marca | 759086D | 1,5 mL, semi-micro |
| DMSO | Millipore-Sigma | 276855-100ML | utilizado para la reconstitución de DiBAC4(3,5) |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 65-0880-92 | utilizado para aplicaciones futuras propuestas de tinción de neutrófilos con DiBAC4(3) |
| Cámara Ambiental para el CLSM | PECON | LSM 880 | este sistema fue fabricado exclusivamente para productos Zeiss y generalmente se conoce como el "Sistema de Incubación S"; todos los componentes pueden encargarse a través de Zeiss como complemento al sistema LSM 880 (o similar) |
| Sulfato de gentamicina | Fisher | BP918-1 | utilizado para la selección de RFP que expresan cepas de PA1633 |
| Glicerol y nbsp; | Genesee | 18-205 | se utiliza para congelar cepas para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C |
| Elastasa de neutrófilos humanos (HNE) | Millipore-Sigma | 324681-50UG | una vez reconstituida, permanece estable durante 1 mes en 4 ° C o 1 año con 20 años y nbsp; ° C |
| Software Imaris x64 | Oxford Instruments | Versión 10.2.0 | |
| Aceite de inmersión | Ciencias de Microscopía Electrónica y Ciencias; | 16919-12 | no secante; estandarizado en 37 ° C |
| Incubadora | Benchmark Scientific | H1001-M | capaz de temblar |
| Caldo de Lisogénia (LB) | Genesee | 11-118 | Mezcla Miller |
| plásmido de cereza y nbsp; | obtenido de un colaborador | ||
| Cepa mutante transposónica PA1633 | obtenido de un colaborador | ||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher | 3002 | pH 7,0 |
| Acetato de sodio | Thermo Fisher | AM9740 | 3M; pH 5,5; Libre de RNasa |
| Cloruro de sodio | Fisher | S271-500 | Utilizado para la reconstrucción de HNE |
| Espectrofotómetro | VWR | 634-0882 | se utiliza para medir la densidad celular para la inoculación de PAO1/PA1633 en SCFM2 |
| Estéril .22µ Filtro m | Genesee | 25-244 | Utilizado para purificar HNE reconstituido |
| Tubos estériles de microcentrífuga | Genesee | 24-272LR | 0,6 mL |
| Jeringuilla estéril | Fisher | 14955459 | Utilizado para purificar HNE reconstituido |
| SX4400 rotor de cubeta oscilante | Beckman Coulter Ciencias de la Vida | B01425 | emparejada con la centrifugadora Beckman Coulter Life Sciences (número de parte B06320) |
| Medio sintético para fibrosis quística (SCFM2) | SyntheBiome | 10002-500 | Lote #: 001-CF2-0724 |
| Agua ultra pura | Genesee | 18-195 | Utilizado para la reconstitución de HNE |
| Tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa PAO1 con plásmido pMRP9-1 y nbsp; | Este plásmido pMRP9-1 contiene GFP y expresa resistencia a la carbbenicilina | ||
| ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging software | Zeiss | compatible con el LSM 880 |
Referencias
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