Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Resumen

Este artículo presenta un protocolo LysoTracker de células vivas para medir la remodelación lisosomal durante la senescencia en fibroblastos humanos IMR-90.

Resumen

La senescencia celular es un estado estable de detención del ciclo celular asociado a fenotipos característicos, incluyendo morfología celular agrandada, alteración de la señalización secretora y un pronunciado remodelado lisosomal. Las células senescentes suelen mostrar expansión del compartimento endo-lisosomal ácido, acompañada de cambios en la acidez luminal y la capacidad degradativa, creando una oportunidad para lecturas simples de células vivas de remodelación de orgánulos vinculados a la senescencia. Este trabajo describe un protocolo de imagen de células vivas que utiliza LysoTracker Deep Red, un colorante fluorescente acidotrópico, para proporcionar un proxy indirecto dependiente del pH del compartimento ácido de orgánulos como correlato de la carga de senescencia. El método se demuestra en fibroblastos pulmonares humanos IMR-90 que sufren senescencia replicativa a través del paso en serie. El protocolo detalla el cultivo celular y el seguimiento del pasaje, la tinción con LysoTracker, la imagen por fluorescencia y la cuantificación basada en imágenes de la intensidad de la señal lisosomal y el área positiva por célula. La tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-Gal) en cultivos paralelos se incluye como marcador confirmatorio opcional en lugar de estándar de referencia. Los resultados representativos muestran una señal de colorante fluorescente acidotrópica más alta y regiones lisopositivas más grandes en cultivos de paso tardío que en controles de paso temprano, consistente con la expansión del compartimento ácido del orgánulo durante la senescencia. Debido a que la lectura depende del volumen del compartimento, el gradiente de protones y la disponibilidad de colorantes, es mejor interpretarla como un correlato indirecto de la remodelación lisosomal, más que como una medida directa del número de lisosomas o la biogénesis. El protocolo es sencillo de adoptar y puede adaptarse a otros tipos celulares o tensiones que inducen la senescencia, proporcionando un complemento práctico y cuantitativo a los ensayos finales convencionales.

Introducción

La senescencia celular es un programa duradero de detención del ciclo celular activado por diversos factores de estrés y desencadenantes relacionados con^{el envejecimiento} 1,2,3,4. Las células senescentes se identifican clásicamente por una constelación de marcadores, ya que ningún marcador es completamente específico. Las características incluyen una morfología celular agrandada y aplanada, actividad de β-galactosidasa (SA-β-Gal) asociada a la senescencia, formación de focos de daño al ADN y un perfil secretor proinflamatorio (SASP^)2,4,5. Entre estas características, la remodelación lisosomal ha surgido como un rasgo destacado y funcionalmente significativo de la^{senescencia 6,7}. Las células senescentes muestran cambios lisosómicos profundos, incluyendo una expansión dramática en tamaño y número lisosomal, junto con una función alterada (a menudo implicando una neutralización parcial del pH lisosomal y acumulación de material no degradado⁾6,7,8,9. Esta expansión lisosómica contribuye a un aumento de la actividad de SA-β-Gal, un marcador de senescencia establecido que refleja una actividad elevada de β-galactosidasa lisosomal en células^senescentes 10,11,12. De hecho, la tinción SA-β-Gal aprovecha este fenómeno utilizando una incubación subóptima de pH (6,0) para precipitar selectivamente el colorante en lisosomas de células senescentes, que han acumulado la enzima y presentan un pH más alto que las células^jóvenes 10,12,13.

Los lisosomas desempeñan un papel central en la renovación y señalización de proteínas, y su desregulación se considera ahora una característica del envejecimiento y la^senescencia 1,2,4,6. Las células senescentes suelen mostrar disfunción lisosomal, evidenciada por un pH luminal elevado, alteración de la actividad enzimática y acumulación de lipofuscina (un pigmento autofluorescente de macromoléculas oxidadas^)6,14. La biogénesis lisosomal suele estar regulada o alterada al alza a través de la red coordinada de expresión y regulación lisosomal (CLEAR) bajo el control del factor de transcripción EB (TFEB) y factores^{relacionados 6,7,15}. Este proceso puede aumentar la masa lisosomal en las células senescentes a medida que se adaptan al estrés al expandir el compartimento^{degradativo 6,7,10}. Por el contrario, las células senescentes también pueden experimentar un declive funcional lisosomal (por ejemplo, reducción de la acidez), lo que puede afectar procesos como la autofagia y conferir resistencia a ciertos esfuerzos, incluida la muerte celular^{ferroptótica 6,8}. Por tanto, medir el contenido y la función lisosomal es fundamental para entender e identificar la^{senescencia 6,16}.

LysoTracker Deep Red es una sonda fluorescente permeable a membrana que se acumula selectivamente en orgánulos ácidos mediante un atrapamiento impulsado por protonación a lo largo de la membrana^{lisosomal 16,17}. La señal resultante refleja el volumen combinado del compartimento ácido, la intensidad del gradiente de protones y la disponibilidad local de colorante en lugar de la masa lisosomal, y puede desplazarse con cambios en el pH lisosomal o en el estado de membrana que ocurren independientemente del número total de^{lisosomas 6,16}. En el contexto de la senescencia celular, las células presentan compartimentos LysoTracker-positivos expandidos y marcados de forma más intensa en comparación con sus homólogos^{presenescentes 9}, lo que es coherente con la expansión del compartimento ácido de orgánulos y el aumento de la biogénesis lisosomal reportados por estudios bioquímicos y^{ultraestructurales 6,7,10}. Este enfoque de células vivas ofrece varias ventajas sobre la tinción final convencional de SA-β-Gal: permite un análisis cuantitativo y espacialmente resuelto de células individuales, puede combinarse con otros reporteros fluorescentes, no requiere fijación y captura la heterogeneidad al reportar características continuas en lugar de un extremo^{binario 6,16}. A lo largo de este protocolo, la señal de LysoTracker se utiliza como lectura del compartimento ácido de orgánulos en células vivas, y los cambios dependientes de la condición se interpretan en consecuencia en lugar de tratarse como una medida absoluta del número de^{lisosomas 6,16}.

Este protocolo detalla el uso de LysoTracker Deep Red para perfilar cambios lisosomales en fibroblastos IMR-90 que sufren senescencia replicativa. IMR-90 es una línea normal de fibroblastos diploides humanos (femenina de origen pulmonar fetal) ampliamente utilizada en la investigación sobre el envejecimiento; al igual que otros fibroblastos de tipo primario (por ejemplo, WI-38), las células IMR-90 entran en senescencia tras ~50–60 duplicaciones de población (el límite de Hayflick) debido al acortamiento de los telómeros y al daño del ADN^{en la señalización 18,19}. El protocolo describe cómo cultivar células IMR-90 para inducir la senescencia mediante pasaje en serie, verificar la senescencia por morfología y tinción de SA-β-Gal, y teñir cultivos vivos con LysoTracker Deep Red para imágenes^{de fluorescencia} 5,10,12,13. Se incluyen la adquisición y el análisis de imágenes, con lecturas cuantitativas como el recuento lisosomal por célula, el área lisosomal total por célula y la intensidad media de fluorescencia. Se enfatizan los controles experimentales y las consideraciones de seguridad, incluyendo el manejo cuidadoso de tintes y fijadores, la minimización de la fototoxicidad durante la imagen y la explicación de la autofluorescencia celular en células envejecidas. El método se demuestra utilizando senescencia replicativa, pero puede adaptarse a otros modelos, incluyendo la senescencia inducida por fármacos (por ejemplo, tratamiento con doxorrubicina o etopósidos) o la senescencia prematura inducida por estrés (SIPS) mediante^oxidantes 2,3,4,19,20. En cada caso, las lecturas basadas en LysoTracker deben compararse con controles apropiados (células proliferantes o en reposo) y, cuando sea posible, validarse cruzadamente con al menos un marcador de senescencia tradicional (como la expresión SA-β-Gal o p16INK4a^)3,5,12,13.

El perfilado lisosomal de células vivas cubre una laguna práctica en los ensayos de senescencia al proporcionar una medición reproducible y de resolución de una sola célula de un fenotipo clave de orgánulos —la expansión lisosomal— directamente vinculada a la función celular senescente (por ejemplo, mayor capacidad degradativa y actividad secretora⁾2,3,4,6 . Dado que la tinción con LysoTracker es compatible con imágenes de alto rendimiento y citometría de flujo, el protocolo puede escalarse para aplicaciones como el cribado de drogas (por ejemplo, pruebas de senolíticos o moduladores de la función lisosomal^)2,3,6. Como dirección futura, las características lisosomales por célula generadas por este protocolo son susceptibles de enfoques de clasificación posteriores, incluidos modelos de aprendizaje automático; El entrenamiento y validación de dichos clasificadores están fuera del alcance de este protocolo. En conjunto, este método (Figura 1) permite visualizar y cuantificar la dimensión lisosomal de la biología de la senescencia, proporcionando información sobre cómo cambian la biogénesis y morfología lisosomal durante el envejecimiento o el estrés, y ofreciendo una plataforma para probar intervenciones dirigidas a lisosomas en células senescentes. El flujo de trabajo de análisis de imágenes utilizado para segmentar núcleos, derivar regiones asociadas a células, umbral y cuantificar características de LysoTracker, y reproducir los análisis por pozo y por celda presentados aquí, está implementado como un paquete complementario de código abierto (SenTrackLite v0.5.0), proporcionado como Archivo Suplementario 1 y archivado con un DOI persistente para citación^{y reutilización 21}.

Figura 1: Visión general del ensayo de senescencia lisosomal de células vivas. (A) Flujo de trabajo experimental. Las células se tiñen en vivo con LysoTracker Deep Red y un colorante nuclear, se obtiene una imagen mediante microscopía de fluorescencia estándar y, opcionalmente, se procesa en paralelo para la tinción SA-β-Gal para validación. (B) Mediciones por célula derivadas de la imagen. El canal nuclear se utiliza para identificar células individuales, y la expansión anclada en el núcleo define una región por célula para extraer mediciones asociadas a lisosomas del canal LysoTracker. Las mediciones representativas por célula incluyen el área lisosomal, la intensidad media de LysoTracker y el recuento de lisosomas. La tinción SA-β-Gal puede usarse como etiqueta de validación opcional al generar o confirmar conjuntos de datos de referencia. (C) Cuantificación y salidas. Las mediciones lisosomales por célula se combinan en una única puntuación o probabilidad de senescencia por célula utilizando un enfoque de puntuación simple. Los resultados incluyen valores por célula y resúmenes a nivel de pozo o condición de la carga de senescencia, que pueden compararse entre condiciones de inducción por senescencia o tratamiento senolítico. Creado con BioRender.com
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Protocolo

Las células IMR-90 son una línea celular de fibroblastos humanos establecida y no constituyen investigación en humanos. No se requería aprobación ética ni consentimiento informado. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de bioseguridad de la Universidad de Albany, Universidad Estatal de Nueva York, para trabajar con líneas celulares de origen humano bajo condiciones de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2).

1. Resumen general de la preparación y el flujo de trabajo

1. Define el objetivo experimental como un ensayo de perfilado lisosomal de células vivas usando tinción LysoTracker Deep Red y un colorante nuclear vivo para cuantificar la remodelación lisosómica como una lectura continua de la carga de senescencia en células IMR-90. Defina la comparación biológica primaria como uno de los siguientes diseños:
   1. Inducción por senescencia vs. control no inducido emparejado.
   2. Condiciones de senescencia alta vs. baja de senescencia a lo largo de una dosis o serie temporal.
   3. Condición de senescencia alta tratada con un senolítico vs. Tratamiento con vehículo - alto control de senescencia.
   4. Serie de tratamientos senolíticos que incluye tanto un grupo con baja senescencia como un grupo con alta senescencia.
2. Establecer la estructura mínima de control para todos los experimentos.
   1. Incluye un grupo de control de baja senescencia adaptado a la densidad del blindaje, el momento de la tinción y los ajustes de imagen.
   2. Incluye un grupo de senescencia alta generado por un desencadenante de senescencia definido o por senescencia replicativa de paso tardío.
   3. Incluye réplicas biológicas por condición y realiza tinciones e imágenes con el mismo tiempo en cada condición.
3. Defina las lecturas de ensayo como medidas directas basadas en imágenes de la remodelación lisosomal:
   1. Mide la intensidad media por célula de LysoTracker dentro de la máscara lysopositiva usando un umbral de intensidad consistente como lectura primaria del ensayo. A nivel de célula única, esta métrica separa las condiciones de senescencia baja de las de alta senescencia con el mayor tamaño de efecto y es insensible a la densidad nuclear a nivel de campo (Figura suplementaria 1).
   2. Registrar las siguientes como lecturas secundarias, que documentan la expansión del compartimento pero son más sensibles a las elecciones de segmentación o a la densidad nuclear a nivel de campo: área enriquecida con lisosomas por célula e intensidad integrada de LysoTracker por núcleo a nivel de campo. La intensidad integrada por núcleo es informativa en campos bien poblados, pero se vuelve inestable cuando un campo contiene un pequeño número de núcleos, ya que la normalización por núcleo pasa a estar dominada por células individuales.
   3. Registrar métricas opcionales de recuento de puntos y tamaño de lisosomas cuando la resolución de imagen soporte la discriminación de puntos.
4. Utiliza la tinción asociada a la senescencia con β-galactosidasa (SA-β-Gal) como paso opcional de validación realizado en pozos paralelos o muestras emparejadas, dependiendo de las restricciones experimentales. Utiliza esta validación para confirmar que las culturas de paso tardío muestran una mayor positividad SA-β-Gal en comparación con las culturas de paso temprano.
5. Estandariza el ensayo en diferentes condiciones fijando las siguientes variables antes de la recogida de datos:
   1. Concentración de trabajo de LysoTracker (75 nM) y duración de la tinción (30 min).
   2. Identidad del colorante nuclear y rango de concentración de trabajo (por ejemplo, Hoechst 33342 a 1 μg/mL a 2 μg/mL).
   3. Parámetros de imagen, incluyendo aumento objetivo, tiempo de exposición, intensidad de iluminación, agrupamiento y estrategia de enfoque.
   4. Formato de placa y configuración de imagen (placas de imagen con fondo transparente o platos con fondo de vidrio), incluyendo la disposición de pozos replicados.
   5. Selección de umbral y normalización de intensidad.
      1. Aplicar un único umbral fijo de intensidad al canal LysoTracker en todos los pozos dentro de un experimento para definir la máscara lisopositiva.
      2. Seleccionar el umbral una vez durante la preparación del ensayo utilizando un conjunto de campos de calibración que abarcan el rango de intensidad esperado (por ejemplo, dos campos de senescencia baja y dos campos de senescencia alta), y mantenerlo constante en todos los pozos dentro de esa sesión; permitir que el umbral varía por pozo introduce una dependencia circular entre la medición y el resultado.
      3. Para comparaciones entre experimentos, adquiere todas las condiciones en una sola sesión bajo la misma potencia, exposición y ganancia láser y reporta estos ajustes en la legenda de la figura.
      4. Si se requieren comparaciones de intensidad absoluta entre sesiones, incluye un estándar de referencia fluorescente (por ejemplo, una placa de perlas de referencia o un pozo de referencia fijo) y normaliza las intensidades medidas en consecuencia.
         NOTA: No compares valores de intensidad bruta entre sesiones sin idénticos ajustes de adquisición o normalización basada en referencias.
   6. Normalización de densidad nuclear.
      NOTA: Debido a que los cultivos senescentes suelen mostrar una proliferación reducida y menor densidad nuclear a tiempos de siembra comparables7,10, las métricas a nivel de campo basadas en el recuento absoluto de píxeles (por ejemplo, el área total de lisopositiva) pueden verse influenciadas por el número de células por campo.
      1. Informa tanto de los valores normalizados en bruto como por núcleo (valor en bruto dividido por el número de núcleos segmentados en Hoechst).
         NOTA: La normalización por núcleo controla los factores de confusión relacionados con la densidad y es la comparación adecuada para la interpretación por célula. Para lecturas basadas en área, el valor normalizado sirve como métrica principal, mientras que el total no normalizado se mantiene para mayor integridad.
6. Adquirir imágenes en condiciones que preserven la calidad de la señal de las células vivas y minimicen la variabilidad técnica. Mantener las placas de paso temprano y tardío protegidas de la luz durante la tinción y el transporte, y minimizar el tiempo fuera de condiciones de cultivo controlado durante la imagen.
7. Guarda las imágenes de fluorescencia como archivos TIFF de un solo plano, de un solo canal y sin pérdida. Utiliza un esquema de nombres consistente que preserve el emparejamiento entre imágenes nucleares y LysoTracker y mantenga la trazabilidad para placar, pozo, condicionar y replicar. Utiliza un nombre base compartido con sufijos de canal (por ejemplo, _Hoechst.tif y _Lyso.tif). Guarda las imágenes en una carpeta dedicada organizada por experimento, con subcarpetas según sea necesario.
   NOTA: Un punto de pausa práctico es tras establecer cohortes de paso temprano y tardío y confirmar que los cultivos de paso tardío muestran un crecimiento lento y una morfología similar a la senescencia.
8. (Opcional) Incluir el ogénito como variable experimental manteniendo cohortes IMR-90 emparejadas bajo condiciones ambientales y de bajo oxígeno. Procesa todos los grupos de la misma manera.

2. Cultivo celular e inducción de senescencia replicativa

1. Descongelar fibroblastos pulmonares humanos IMR-90 según las prácticas estándar de cultivo celular y expandir las células en Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%. Añade penicilina-estreptomicina al 1% si es consistente con la práctica de laboratorio y el diseño experimental. Mantener las células a 37 °C con un 5% de CO₂.
2. Mantener los cultivos en crecimiento logarítmico y paso antes de la confluencia entre el 70% y el 80%. Utiliza un manejo consistente del medio y horarios de alimentación para reducir la variabilidad entre las pruebas experimentales. Cambia el medio de cultivo completo cada 2 o 3 días entre pasos.
   NOTA: No permitas que el medio permanezca sin cambios durante más de 72 horas, ya que la depresión de nutrientes y la acumulación de factores secretados pueden promover fenotipos inducidos por estrés que complican la senescencia replicativa.
3. Definir el grupo basal de senescencia baja como cultivos IMR-90 en proliferación activa mantenidos bajo condiciones que preservan el comportamiento normal de crecimiento. Adapta la densidad y manejo del chapado a todos los grupos experimentales.
4. Genera un grupo con alta senescencia utilizando uno de los siguientes enfoques, elegidos en función de objetivos experimentales.
   1. Inducir la senescencia replicativa mediante pasajes seriados con duplicación poblacional hasta que se evidencie una proliferación ralentizada y morfología asociada a la senescencia.
      NOTA: El nivel de duplicación de población (PDL) y el número de pasos son medidas distintas que se registran por separado. PDL se refiere a los duplicamientos acumulativos posteriores al deshielo y se calcula en cada pasaje como:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (celdas recolectadas / celdas sembradas⁾¹⁸,
      mientras que el número de pasajes cuenta el número de subculturas desde el deshielo. Dado que los cultivos suelen dividirse 1:4 en aproximadamente un 70%–80% de confluencia, cada pasaje aporta aproximadamente dos duplicaciones de población, por lo que el número de pasajes y la PDL acumulada no son intercambiables.
      NOTA: Los cultivos de alta senescencia suelen observarse en niveles avanzados de duplicación poblacional, cuando la proliferación se ralentiza y la morfología asociada a la senescencia se hace evidente. Los umbrales exactos deben determinarse empíricamente para cada lote IMR-90, ya que los PDL varían entre proveedores.
   2. Senescencia inducida por estrés aplicando un desencadenante de senescencia definido y permitiendo una ventana de desarrollo fenotípica adecuada.
   3. Senescencia inducida por el tratamiento al exponer células a la condición en estudio cuando el objetivo es comprobar si dicha condición induce senescencia.
5. Validar que el enfoque seleccionado produce un fenotipo de senescencia alta utilizando al menos una lectura ortogonal realizada en pozos paralelos. Realizar la tinción SA-β-Gal como método opcional de validación y documentar la fracción de células positivas por condición cuando se incluye.
   1. Un cultivo se considera de alta senescencia cuando al menos el 50% de las células muestran una tinción perinuclear azul sin ambigüedad de SA-β-Gal tras una incubación de 12 a 16 horas a pH 6,0, mientras que el control de senescencia-bajo emparejado muestra no más del 10% de células positivas bajo condiciones de tinción^{idénticas 13}.
   2. Los valores fuera de estos límites indican inducción de senescencia incompleta o fondo elevado y justifican una reoptimización antes de proceder a la imagen.
      NOTA: Pausa tras establecer las cohortes de senescencia baja y senescencia-alta y confirmar una diferencia fenotípica clara mediante morfología y tinción opcional por validación.
6. Opcional: Diseño de tratamientos senolíticos
   1. Las placas tienen condiciones de senescencia baja y alta en pozos replicados y permiten que las células se adhieran y recuperen antes del tratamiento.
   2. Tratar los pozos de alta senescencia con compuestos senolíticos e incluir un control de alta senescencia tratado por vehículo.
   3. Incluir un grupo de baja senescencia tratado con el mismo vehículo y, cuando corresponda, con la misma concentración de compuestos para monitorizar la sensibilidad no senescente.
   4. Procede a la tinción en vivo y a la tinción nuclear en un tiempo constante tras el tratamiento en todas las condiciones.
7. Monitoriza los cultivos durante el proceso tardío o el tratamiento y documenta la morfología y los patrones de crecimiento. Identificar cultivos senescentes por proliferación ralentizada, morfología agrandada y aplanada, y mayor granularidad citoplasmática. Una vez que se detecta la detención del crecimiento, mantener el cultivo como la cohorte con alta senescencia para la tinción e imagen en lugar de pasar más allá.
8. Minimiza los factores de estrés que confunden durante el mantenimiento del cultivo utilizando una preparación consistente del medio, horarios de alimentación consistentes y un tiempo de manipulación constante fuera de la incubadora. Considera las fluctuaciones de temperatura, el tiempo prolongado fuera de CO₂ controlado y el calentamiento inconsistente del medio como fuentes de variabilidad técnica evitable.
9. Opcional: Mantener cultivos compatibles bajo oxígeno ambiente y bajo oxígeno. Mantener cultivos por debajo del 21% de O₂ y por debajo del 5% de O₂ como cohortes separadas y mantener cada cohorte bajo su condición de oxígeno asignada durante el manejo rutinario del cultivo cuando sea posible. Limitar la exposición al oxígeno ambiente durante las transferencias y la preparación de imágenes para cohortes con bajo oxígeno.
   NOTA: Un punto de pausa práctico es tras definir y estabilizar las cohortes de paso temprano y tardío y confirmar que los cultivos de paso tardío muestran un crecimiento lento consistente y una morfología asociada a la senescencia.

3. Tinción lisosomal y nuclear de células vivas con LysoTracker Deep Red y un colorante nuclear

1. Placar las células IMR-90 para todas las condiciones experimentales en placas de imagen de fondo transparente o platos de fondo de cristal. Incluir una condición de control de baja senescencia y al menos una condición de senescencia-alta generada por el desencadenante seleccionado, e incluir réplicas biológicas para cada condición.
2. Células semilla para lograr una monocapa subconfluente el día de la tinción. Registra la densidad de siembra y el tiempo entre el chapado y la tinción de cada experimento para apoyar la comparabilidad entre corridas.
3. Caliente a medio de cultivo completo hasta 37 °C. Prepara una solución de trabajo LysoTracker Deep Red a 75 nM en el medio calentado y protégela de la luz. La solución de trabajo se prepara diluyendo el material LysoTracker Deep Red de 1 mM (suministrado por el fabricante en DMSO) 1:13.333 en medio de cultivo completo calentado (por ejemplo, 0,75 μL de 1 mM de material por cada 10 mL de medio calentado).
   NOTA: Las células senescentes de paso tardío e inducidas por estrés acumulan lipofuscina y otro material autofluorescente inespecífico que emite a lo largo de amplios rangos de longitudes de onda y puede contribuir a la señal aparente de LysoTracker en controles no teñidos¹⁴. Para estimar la contribución de la autofluorescencia en un experimento dado, incluye al menos un pozo sin tinción por condición y adquírelo bajo idénticas configuraciones de imagen. Resta la señal media de pozo sin teñir de las mediciones de pozos tintidos, o reporta tanto valores brutos como de fondo resplanados.
   NOTA: En la práctica, la señal del canal LysoTracker sin tinción en los cultivos IMR-90 es pequeña en relación con la señal senescente teñida (aproximadamente entre el 5% y el 10% de la media senescente teñida en el conjunto de datos actual), pero la contribución aumenta con el número de pasajes y puede llegar a ser sustancial (más del 20%) en cultivos senescentes profundamente senescentes o inducidos por^{oncogenes 6,14}. Verifica siempre la magnitud de autofluorescencia al adoptar este protocolo para un nuevo tipo de célula o modelo de inducción de senescencia.
4. Prepara suficiente solución de trabajo LysoTracker para todos los pozos que se teñirán en la canalización. Mezcla la solución de trabajo mediante una suave inversión y mantenla protegida de la luz hasta que la uses.
5. Aspira el medio gastado de cada pozo. Añade suavemente la solución de trabajo LysoTracker a lo largo de la pared del pozo para evitar alterar la monocapa y mantener un volumen de tinción constante entre pozos.
6. Incubar las células con LysoTracker durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO₂. Mantén todos los grupos experimentales bajo la misma duración y temperatura de incubación.
7. Añade un tinte nuclear vivo durante los últimos 10 minutos de incubación con LysoTracker. Añadir Hoechst 33342 directamente al medio que contiene LysoTracker a la concentración de trabajo recomendada por el fabricante, por ejemplo de 1 μg/mL a 2 μg/mL, y mezclar mediante un suave balanceo de la placa.
8. Retira el medio de tinción al final de la incubación. Enjuaga las células una vez con solución salina tamponada con fosfato precalentada para reducir la fluorescencia de fondo.
9. Añade medio de cultivo rojo sin fenol previamente calentado o un tampón de imagen inmediatamente después del enjuague. Proceder directamente a la imagen en vivo y mantener un tiempo consistente entre el intercambio de búfer y la adquisición de imágenes en todos los pozos del experimento.
10. Protege las placas de la luz durante las transferencias y la instalación de imágenes. Minimizar el tiempo pasado fuera de las condiciones controladas de temperatura y CO₂ durante la manipulación y adquisición de imágenes.
    PRECAUCIÓN: Manipula los tintes fluorescentes usando guantes y protección ocular. Desechar líquidos que contengan tintes y consumibles contaminados según los procedimientos institucionales de seguridad química.
    NOTA: Utiliza un punto de pausa después del Paso 3.9 si la imagen requiere preparar varias placas. Mantén las placas protegidas de la luz a 37 °C y reanuda la imagen lo antes posible para limitar la deriva de manchas.
    NOTA: Si el diseño experimental incluye oxígeno como variable, mantener cada cohorte bajo su condición asignada de osígeno durante la tinción e incubación, y registrar el tiempo de manipulación fuera de la condición asignada.

4. Tinción SA-β-Gal para validación (opcional)

1. Utiliza la tinción SA-β-Gal como paso opcional de validación para confirmar que la condición de senescencia alta muestra una mayor actividad de SA-β-Gal en relación con el control de baja senescencia. Realizar validación en pozos paralelos procesados en el mismo formato de placa y bajo la misma línea de tiempo de manejo que los pozos de imagen.
2. Imagen completa en vivo para los pozos de validación antes de la fijación. Cuando se desean comparaciones pre y post-fijación del mismo campo (Figura 2), registrar las coordenadas de la etapa en la adquisición, reubicar manualmente cada campo tras la fijación y tinción, y comprobar visualmente la posición nuclear y la morfología celular para confirmar que los campos coinciden antes de incluirlos en el análisis posterior.
3. Fijar las células utilizando la solución de fijación proporcionada en el kit de tinción SA-β-Gal preparado a la concentración de trabajo recomendada de 1x que contiene un 2% de formaldehído y 0,2% de glutaraldehído. Incuba entre 10 y 15 minutos a temperatura ambiente. Para referencia, la solución de fijación contiene un 2% (p/v) de formaldehído y 0,2% (p/v) de glutaraldehído en solución salina con fosfato tamponado. La solución de tinción SA-β-Gal a pH 6,0 contiene 1 mg/mL de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) disuelto en dimetilformamida inmediatamente antes de su uso, 40 mM de tampón de ácido cítrico / fosfato sódico a pH 6,0, 5 mM de ferrocianuro de potasio, 5 mM de ferricianuro de potasio, 150 mM de NaCl y 2 mM ^{de MgCl��12,13}. Los kits comerciales que cumplan estas especificaciones pueden usarse indistintamente, siempre que el pH del tampón de tinción esté verificado en 6,0.
4. Retira el fijador y enjuaga los pozos dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Añadir solución de tinción SA-β-Gal a pH 6,0 que contenga sustrato de X gal a cada pozo.
5. Sella la placa para limitar la evaporación durante la incubación. Coloque la placa en una incubadora libre de CO₂ a 37 °C durante 12-16 horas.
6. Inspecciona los pozos mediante microscopía de campo claro y documenta el patrón de tinción. Adquiere imágenes representativas para cada condición e informa la fracción de células SA-β-Gal-positivas por pozo al validar los resultados.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído y el glutaraldehído son tóxicos y volátiles. Prepara y utiliza la solución de fijación en una campana extractora química y lleva el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, protección ocular y una bata de laboratorio.
   NOTA: Si la tinción SA-β-Gal muestra un fondo alto en el control de senescencia baja o una tinción débil en la condición de senescencia-alta, repita la validación tras ajustar la densidad de placaje, duración de fijación, duración de incubación y consistencia de temperatura, manteniendo el pH del tampón en 6,0.

Resultados

Aplicar este protocolo a fibroblastos IMR-90 en condiciones de senescencia baja y alta da como se obtienen lecturas lisosómicas cuantitativas que pueden resumirse a nivel de célula única y, cuando se desea, a nivel de campo completo.

El conjunto representativo mostrado en las figuras y tablas deriva de un único experimento biológico que comparó cultivos de IMR-90 en el pasaje 13 (P13; senescencia baja, ~PDL 26) y en el pasaje 23 (P23; senescencia alta, ~PDL 46...

Discusión

Este protocolo describe un flujo de trabajo de imagen de células vivas que mide la senescencia mediante remodelación lisosomal, y proporciona lecturas cuantitativas por célula y por pozo de la carga de la senescencia. Varios pasos son especialmente importantes para obtener un análisis fiable. Primero, el modelo biológico en sí debe estar bien controlado. La inducción de la senescencia replicativa en fibroblastos IMR-90 requiere un seguimiento cuidadoso de las duplicaciones poblacionales ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Cualquier placa de cultivo multi-pocillo de fondo transparente compatible con imágenes de fluorescencia de células vivas (por ejemplo, placas de poliestireno TC-tratadas de 6, 12 o 24 pocillos; se pueden preferir placas de fondo de vidrio para imágenes de mayor resolución).
Beta-galactosidase staining kit (ensayo de senescencia)	Cell Signaling Technology	9860	Cualquier kit comercial de SA-β-galactosidasa con tampón de tinción verificado a pH 6.0. Para referencia, la solución de fijación contiene formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0.2% en PBS, y la solución de tinción contiene 1 mg/mL de X-gal en DMF, citrato/fosfato 40 mM pH 6.0, 5 mM de ferrocianuro de potasio, 5 mM de ferricianuro de potasio, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2.
BioRender (software de ilustración científica)	BioRender	N/A — aplicación web	Utilizado para crear figuras esquemáticas (Figuras 1–3). https://www.biorender.com
Carbon dioxide gas (CO2), compressed cylinder	Airgas (or similar supplier)	N/A	CO2 de grado médico utilizado para mantener una atmósfera al 5% en el incubador de cultivo celular y en la cámara de imagen en el escenario.
Fetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Cualquier FBS de grado para cultivo celular, inactivado térmicamente a 56 °C; se utiliza al 10% v/v en medio de cultivo completo.
Fluorescence microscope with live-cell capability	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Cualquier microscopio de fluorescencia de campo amplio o confocal con control de temperatura y CO2 para células vivas, juegos de filtros para canales de lejano rojo (excitación ~647 nm / emisión ~670 nm) y DAPI/Hoechst (excitación ~405 nm / emisión ~460 nm), y un objetivo de 20×-40× con NA suficiente para resolver características lisosomales. Se utilizó el sistema de imagen EVOS M7000 en este estudio.
Hoechst 33342 nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	H3570	Tinte de ADN permeable a las células para tinción nuclear de células vivas (fluorescencia azul, excitación ~405 nm). No intercambiable con DAPI, que no es permeable a las células en condiciones fisiológicas.
Image analysis software	Python Software Foundation	N/A	Cualquier entorno de computación científica que admita la segmentación del núcleo, la expansión de la región del núcleo a la célula, el umbral de intensidad y estadísticas básicas de imágenes (por ejemplo, Python con scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). El pipeline SenTrack (ver Archivo Suplementario S1) se desarrolló para este estudio.
IMR-90 human lung fibroblasts (cell line)	ATCC	CCL-186	Línea celular de fibroblastos diploides de pulmón fetal humano normal utilizada para modelar la senescencia replicativa; se puede sustituir por cualquier línea de fibroblastos humano caracterizada de manera similar.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Tinte fluorescente acidótropo para tinción de orgánulos ácidos de células vivas; se suministra como stock de 1 mM en DMSO. La concentración de trabajo es de 75 nM en medio de cultivo celular preparado.  La emisión en lejano rojo (ex 647 nm / em 668 nm) minimiza la superposición con la autofluorescencia de la lipofuscinas pero no la elimina.
Minimum Essential Medium (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Medio de cultivo basal para fibroblastos IMR-90; se complementa con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Se puede sustituir por cualquier formulación estándar de medio esencial mínimo de Eagle con sales de Earle y L-glutamina.
Penicillin-streptomycin solution (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Suplemento antibiótico para medio de cultivo completo; se usa al 1% v/v (concentración final 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina). Se puede sustituir por cualquier solución estándar de pen-estrep.
Phenol red-free imaging medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	DMEM o HBSS libres de fenol rojo utilizados para la imagen de células vivas para reducir la fluorescencia de fondo durante la adquisición. FluoroBrite DMEM es una opción comúnmente utilizada; se puede sustituir por cualquier tampón de imagen libre de fenol rojo complementado con 10% de FBS.
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Tampon isotónico para lavado celular y dilución de reactivos; se puede sustituir por cualquier PBS 1× estéril a pH 7.4.
SenTrackLite v0.5.0 (software)	Open-Source (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Aplicación Python / Tkinter de archivo único de código abierto para el análisis de imágenes de senescencia lisosomal. Distribuido como Archivo Suplementario S1. Archivado en Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licencia MIT. Fuente: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Stage-top environmental chamber	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	Cámara ambiental para imagen de células vivas en microscopio con control de temperatura (37 °C) y CO2 (5%). Se utilizó el EVOS Onstage Incubator en este estudio; se puede sustituir por cualquier incubadora equivalente en el escenario.