Establecimiento de un co-cultivo epitelial-endotelial pulmón en chip para investigación en condiciones sanas y de EPOC

Resumen

Este protocolo establece un sistema dinámico de cocultivo pulmón en chip que combina células epiteliales primarias de las vías respiratorias humanas y células endoteliales microvasculares pulmonares para dos modelos: modelo sano y modelo de EPOC. El sistema reproduce las interacciones vía aérea-vascular bajo la interfaz aire-líquido y el flujo, y proporciona evaluación de barreras, fenotipado celular y análisis de ARN.

Resumen

Se desarrollaron dos modelos dinámicos de cocultivo pulmón en chip para recrear la interfaz vía aérea–vascular incorporando células epiteliales primarias de las vías respiratorias y microvasculares endoteliales pulmonares. Un modelo utiliza células disponibles comercialmente de donantes sanos, mientras que el otro emplea células derivadas de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lo que permite la comparación directa de condiciones sanas y enfermas bajo condiciones de cultivo idénticas. Ambos modelos soportan la diferenciación epitelial bajo perfusión continua y condiciones de interfaz aire-líquido (ALI), lo que resulta en una barrera epitelial fisiológicamente relevante sostenida por una capa endotelial subyacente. El flujo de trabajo incluye el recubrimiento de matriz extracelular, la siembra celular, el establecimiento de ALI, la evaluación de la función de barrera, el fenotipado celular y la extracción de ARN específico por tipo celular. Los ensayos de permeabilidad demostraron una robusta integridad de barrera en ambos sistemas, mientras que la inmunofluorescencia confirmó la localización continua de Zonula Ocludens-1 (ZO-1) y la cadherina endotelial vascular (VE-cadherina) en las uniones celulares. La diferenciación epitelial se confirmó mediante la tinción con β-tubulina IV y la visualización del batido ciliar. Se obtuvo ARN de alta calidad por separado de cada compartimento, apoyando análisis moleculares específicos por tipo celular. El modelo de EPOC recapituló características clave de la enfermedad, notablemente una mayor producción de moco, sin comprometer la función de la barrera ni la viabilidad celular. El uso de células epiteliales y endoteliales derivadas del paciente preserva características patológicas individuales, permitiendo la investigación de los mecanismos intercelulares en la EPOC. Este enfoque ofrece una alternativa fisiológicamente relevante a modelos estáticos in vitro y animales y apoya estudios preclínicos sobre fármacos inhalados, exposición a patógenos e interacciones epitelial-endotelial. Es importante destacar que los modelos sanos y de EPOC, pulmón en chip, pueden usarse tanto en combinación para estudios comparativos directos como de forma independiente para investigaciones mecanicistas, pruebas terapéuticas y descubrimiento de fármacos. El sistema también puede adaptarse a otras condiciones respiratorias que impliquen compartimentos epiteliales o endoteliales alterados, ofreciendo una plataforma versátil y traslacional para la investigación respiratoria.

Introducción

La interacción entre las células epiteliales de las vías respiratorias y las células endoteliales microvasculares pulmonares es esencial para mantener la homeostasis pulmonar y coordinar las respuestas ante lesiones, infecciones e inflamaciones. Juntos, estos tipos celulares forman una barrera funcional que regula el intercambio de gases, la vigilancia inmune y la permeabilidad vascular. Su diafonía dinámica implica señalización paracrina, interacciones directas célula-célula y respuestas a estímulos mecánicos, todos ellos críticos para la función pulmonar y la integridad^{estructural 1}.

En la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), un trastorno pulmonar progresivo caracterizado por inflamación crónica, remodelación de las vías respiratorias y destrucción de la interfaz alveolar-capilar, la función barrera tanto del epitelio de las vías respiratorias como del endotelio vascular pulmonar está afectada y acompañada de una liberación aberrante de citocinas y mecanismos de reparación tisular^{desregulados 2,3}. Sin embargo, la interacción entre las células endoteliales epiteliales de las vías respiratorias y las microvasculares pulmonares sigue siendo poco comprendida. Esta limitación se debe en parte a las deficiencias de los modelos in vitro e in vivo existentes. Aunque los modelos animales han proporcionado importantes conocimientos sobre fisiología y patología respiratoria, su relevancia está limitada por diferencias interespecies en función inmunitaria, arquitectura pulmonar, señalización celular y metabolismo de fármacos, que pueden dificultar la traducción a la biología humana.

Los sistemas in vitro convencionales, como los cultivos bidimensionales (2D) de líneas celulares epiteliales inmortalizadas, no logran recapitular características clave del epitelio de las vías respiratorias, incluyendo la diferenciación adecuada y la respuesta biomecánica. Aunque los monocultivos tridimensionales (3D) de interfaz aire-líquido (ALI) de células epiteliales primarias de las vías respiratorias mejoran su relevancia fisiológica, permanecen estáticos y carecen de interacciones con otros tipos celulares y estímulos^{mecánicos 4}. El pulmón es un órgano dinámico que está continuamente expuesto al flujo de aire, al esfuerzo cortante, a la rigidez de la matriz extracelular y al estiramiento cíclico generado por la respiración. Estos factores influyen fuertemente en el comportamiento celular y en la remodelación^{tisular 5}. Por lo tanto, los modelos estáticos son insuficientes para replicar procesos como la adhesión de leucocitos, el tráfico de células inmunitarias y las respuestas en tiempo real a la exposición a fármacos.

Para abordar estas limitaciones, han surgido plataformas órgano-en-un chip como sistemas avanzados para modelar interacciones celulares complejas. Los modelos pulmón en chip integran tecnología microfluídica con células de origen humano para replicar características estructurales y mecánicas clave del microambiente pulmonar. Estas plataformas permiten el co-cultivo de células endoteliales epiteliales y pulmonares de las vías respiratorias dentro de un entorno dinámico y tridimensional que imita más de cerca las condiciones in vivo ⁶. La incorporación de movimientos fisiológicos de respiración, flujo de líquidos y monitorización en tiempo real mejora el estudio de la comunicación epitelial-endotelial tanto en condiciones normales como^{enfermas 7–9}.

A pesar de estos avances, la mayoría de los sistemas existentes de pulmón en chip dependen de células derivadas de donantes^{sanos 10}, lo que limita su capacidad para modelar interacciones específicas de la enfermedad. Además, muchas plataformas carecen de flexibilidad para incorporar células derivadas del paciente o para recrear el complejo microambiente de la EPOC. Además, los protocolos detallados para el co-cultivo de células endoteliales epiteliales primarias de las vías respiratorias y microvasculares pulmonares —ya sea de fuentes comerciales o de pacientes con EPOC— utilizando recubrimientos de matriz extracelular específica para tipo celular (ECM) siguen siendo limitados.

En este estudio, se utilizó una plataforma microfluídica de dos canales comercialmente de pulmón en chip para establecer dos modelos de cocultivo que comprenden células epiteliales primarias de las vías respiratorias y células endoteliales microvasculares pulmonares. Se generó un modelo sano utilizando células disponibles comercialmente derivadas de diferentes donantes, mientras que se estableció un modelo de EPOC utilizando células epiteliales y endoteliales de las vías respiratorias obtenidas del mismo paciente. Ambos modelos emplean un recubrimiento ECM específico para cada tipo celular que imita mejor el microambiente pulmonar in vivo. Estos sistemas permiten investigar las interacciones epiteliales-endoteliales bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Los modelos sano y de EPOC pueden usarse tanto en combinación para estudios comparativos directos como de forma independiente para investigaciones mecanicistas y pruebas terapéuticas.

Este sistema de co-cultivo refleja la organización anatómica del epitelio de las vías respiratorias y la vasculatura pulmonar, que funcionan como una unidad integrada epitelial-endotelial. El epitelio de las vías respiratorias es una capa pseudoestratificada compuesta por células basales, secretoras y ciliadas, situada sobre una capa vascularizada de tejido conectivo (lámina propia) y separada del endotelio por una membrana basal. En este modelo, el recubrimiento de ECM (colágeno tipo I, fibronectina y laminina) aproxima la composición de las membranas basales epitelial y endotelial. La membrana porosa que separa los dos canales imita el tejido conectivo subepitelial, aunque carece de complejidad vascular. Múltiples mecanismos contribuyen a la comunicación epitelial-endotelial, incluyendo la señalización paracrina, la regulación coordinada de la permeabilidad, el reclutamiento de células inmunitarias y las respuestas a estímulos mecánicos como el estiramiento inducido por la respiración, que influyen en la resistencia vascular y las vías mecanotransducción.

Este estudio metodológico describe los pasos necesarios para establecer un epitelio de vía aérea completamente diferenciado cultivado bajo condiciones de interfaz aire-líquido (ALI) con un endotelio microvascular pulmonar subyacente. El sistema permite una evaluación cualitativa y funcional de la integridad de la barrera, logrando valores reproducibles de permeabilidad aparente (Papp) ≤ 1 × 10⁻⁶ cm/s. Además, se proporcionan protocolos para la fenotipificación celular y para la extracción y cuantificación de ARN de cada compartimento, lo que proporciona consistentemente ARN de alta calidad (número de integridad del ARN > 7). Este método no está destinado al análisis cuantitativo de ARNm ni a la evaluación detallada de la producción de moco, ni investiga los efectos del estiramiento mecánico, aunque tales aplicaciones son factibles con este sistema.

Protocolo

Todo el uso de células humanas primarias fue aprobado por el Comité Local de Ética de Investigación UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). Se obtuvieron células epiteliales primarias humanas primarias (HBEC) y microvasculares pulmonares (HPMEC) disponibles comercialmente de dos donantes no fumadores (Tablas suplementarias 1, 2). Las células primarias para el modelo de EPOC fueron aisladas de tejido pulmonar explantado de tres pacientes con EPOC con antecedentes de tabaquismo (Tabla Suplementaria 3), según un protocolo bien establecido (aprobación ética S51577) y almacenadas en el biobanco BREATHE. Tanto HBEC como HPMEC se obtuvieron del mismo paciente con EPOC.

Para establecer el modelo sano de pulmón en chip, se utilizaron HBEC y HPMEC comerciales. Para el modelo de EPOC, se aislaron células endoteliales bronquiales primarias y microvasculares pulmonares de tejido pulmonar explantado obtenido del mismo paciente tras el trasplante pulmonar. El sistema pulmón en chip utilizado en este estudio es una plataforma microfluídica de dos canales que comprende microcanales paralelos de vías aéreas (superior) y vasculares (inferiores) separados por una membrana porosa recubierta de matriz extracelular (Figura 1). Se utilizó el mismo protocolo para construir tanto modelos sanos como para EPOC. Los productos químicos, reactivos y kits utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de modelos de co-cultivo pulmón en chip bajo flujo laminar

1. Preparación de patatas fritas
   1. Coloca la cuna de chips en una base de cultivo celular de 120 mm cuadrados, con las esquinas hacia arriba para asegurar la orientación correcta, y luego coloca las virutas en la cuna. Asegúrese de que todos los chips estén colocados correctamente antes del paso de activación (Figura 2).
   2. Preparar la solución de activación disolviendo el polvo del reactivo de activación en su correspondiente tampón, ambos suministrados por el fabricante, para obtener una concentración final de 0,5 mg/mL.
   3. Activa las superficies internas de los canales del chip para promover la unión de la matriz extracelular (ECM) introduciendo cuidadosamente aproximadamente 35 μL de la solución de activación a través de la entrada del canal inferior. Pipetea hasta que la solución empiece a salir por la salida del canal inferior. Repite el procedimiento introduciendo aproximadamente 50 μL de la solución en la entrada superior del canal.
      NOTA: El polvo del reactivo activador es fotosensible. Prepara la solución de activación inmediatamente antes de usarla y descarta cualquier solución restante 1 hora después de la reconstitución.
   4. Elimina todo el exceso de solución de activación de la superficie del chip mediante una aspiración suave. Asegúrate de eliminar solo la solución de activación de la superficie del chip — no aspirarla de los canales.
      NOTA: Antes de la activación por ultravioleta (UV), inspecciona los canales bajo un microscopio para detectar burbujas. Si hay alguna, deslámalas lavándolas suavemente con una solución activadora hasta que se eliminen todas las burbujas.
   5. Expone los chips a una lámpara UV durante 10 minutos y luego lava cada canal dos veces con 200 μL del correspondiente buffer.
   6. Pipete una solución de activación fresca en ambos canales como se ha descrito arriba y expone los chips a la luz UV durante 5 minutos adicionales.
   7. Aspirar completamente la solución por ambos canales, lavar cada canal dos veces con 200 μL de tampón correspondiente, y luego lavar cada canal una vez con 200 μL de solución fisiológica estéril tamponada con fosfato frío sin Ca²⁺ ni Mg²⁺ (DPBS -/-).
   8. Prepara una solución de recubrimiento ECM en DPBS (-/-) que contenga colágeno humano tipo I (100 μg/mL), fibronectina humana (50 μg/mL) y laminina humana (50 μg/mL). Utiliza 100 μL de solución como volumen de referencia por chip.
   9. Añade 50 μL al canal superior y 35 μL al canal inferior, mientras simultáneamente aspiras el flujo de salida a través de los conductos de salida.
      NOTA: Inspecciona los canales bajo un microscopio para detectar burbujas. Si la hay, lava suavemente con la solución ECM para eliminarlos.
   10. Deja pequeñas gotas de solución de ECM tanto en los puertos de entrada como de salida del canal para evitar la evaporación durante la incubación nocturna (ON).
   11. Incuba los chips ON a 37 °C con un 5% de CO₂. Al día siguiente, aspirar la solución de ECM y lavar ambos canales con 200 μL de DPBS precalentado (-/-) a 37 °C.
2. Siembra celular y cultivo sumergido
   Expandir la HBEC en T25^{cm 2} frascos recubiertos con colágeno humano tipo IV (150 μg/mL en DPBS (-/-)) utilizando un medio de expansión celular epitelial de las vías respiratorias hasta alcanzar una confluencia del 60%–70%.
   Paralelamente, expandir HPMEC en T75^{cm 2} matrazas recubiertas con gelatina (2 mg/mL en DPBS (-/-)) utilizando un medio de crecimiento de células endoteliales (CE) hasta alcanzar una confluencia del 90%–100%.
   Consulte la Tabla Suplementaria 4 para la composición de los principales reactivos y medios de cultivo.
3. Siembra HPMEC
   1. Aspira el medio. Lava las celdas con 10 mL de DPBS (-/-).
   2. Añade 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (1X). Incuba durante 30 s a temperatura ambiente (RT).
   3. Añade 12 mL de medio de crecimiento EC (4× el volumen de tripsina utilizado) para inactivar la tripsina. Añadir 5 mL de medio de crecimiento EC para recoger cualquier célula residual (volumen final = 20 mL).
   4. Confirma desprendimiento celular completo bajo el microscopio.
   5. Toma ~20 μL para contar células vivas usando azul de tripán.
   6. Centrifuga la suspensión de la celda de remanente a 900 × g durante 5 minutos en RT en un tubo cónico de 50 mL.
   7. Resuspende el pellet en medio de crecimiento EC. Ajusta a 7 × 10⁶ celdas/mL.
   8. Sembra HPMEC (pasaje 5) en el canal inferior (~20 μL; 1,4 × 10⁵ celdas/canal).
   9. Inmediatamente invierte los chips e incuba durante 2 horas a 37 °C con un 5% de CO₂ (Figura 3).
   10. Devuelve los chips a la orientación original.
   11. Lavar con medio de crecimiento EC tibio de 200 μL (37°C).
   12. Verifica la fijación bajo el microscopio. Extender la incubación si es necesario.
4. Sembrado HBEC
   1. Aspira el medio. Lava con 5 mL de DPBS tibio (-/-).
   2. Añade 1 mL de tripsina. Incubar durante 5 minutos a 37 °C con un 5% de CO₂.
   3. Monitorea el desprendimiento bajo el microscopio.
   4. Añadir 1 mL de inhibidor definido de tripsina (DTI) en una proporción 1:1 para inactivar la tripsina.
   5. Añadir 8 mL de medio de expansión epitelial de células de las vías respiratorias (volumen final = 10 mL).
   6. Transfiere a un tubo de 50 mL.
   7. Toma ~20 μL para contar células usando azul de tripán.
   8. Centrifuga la suspensión de celda restante a 200 × g durante 5 minutos en RT.
   9. Descarta el sobrenadante.
   10. Resuspende el pellet en un medio de expansión celular epitelial de las vías respiratorias. Ajusta a 3,5 × 10⁶ celdas/mL.
   11. Suplementar el medio de expansión epitelial de las vías respiratorias con ácido retinoico sintético de 50 nM y luminoso estable y 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rhEGF).
   12. Iniciar HBEC (pasaje 2) en el canal superior (~35 μL; 1,2 × 10⁵ celdas/canal).
   13. Incubar durante 4 horas a 37 °C con un 5% de CO₂ (Figura 4).
   14. Cambia el medio en ambos canales.
   15. Incubar durante la noche (ON) en condiciones estáticas a 37 °C con un 5% de CO₂.
       NOTA: A partir de este paso, utiliza solo medio desgasificado en todos los pasos. La desgasificación debe realizarse con una unidad Steriflip conectada a un sistema de vacío para minimizar el riesgo de formación de burbujas en el chip.
5. Conexión al flujo
   1. Añadir medio de expansión epitelial de las vías respiratorias tibio (37°C) suplementado con ácido retinoico sintético y luminoso y rhEGF al depósito superior de entrada.
   2. Añade medio de crecimiento EC tibio (37°C) al depósito inferior de entrada.
   3. Llena cada depósito de entrada con medio de 3 mL y cada depósito de salida con 300 μL.
   4. Coloque los módulos portátiles en el módulo de cultivo (Figura 5).
   5. Pulsa la perilla para seleccionar el ciclo "Prime" usando la rueda rotatoria.
   6. Pulsa el dial para iniciar el ciclo.
   7. Deja que el ciclo funcione (~1 min).
   8. Inspecciona la parte inferior de cada módulo en busca de gotas en los cuatro puertos fluidos.
   9. Repite el ciclo "Prime" si no se ven las gotas.
   10. Lava ambos canales de virutas una vez con el medio adecuado.
   11. Deja una gota en cada puerto de entrada y salida para evitar la formación de burbujas.
   12. Sujeta el chip en la mano dominante y el módulo portátil en la otra.
   13. Deslízate el chip en las vías hasta que quede completamente asentado.
   14. Coloca la unidad ensamblada en el módulo de cultivo.
   15. Ajusta el caudal a 30 μL/h para ambos canales usando la esfera rotatoria.
   16. Mantener las condiciones de interfaz líquido-líquido (LLI).
   17. Mantén los chips en el módulo bajo interfaz líquido-líquido (LLI) para permitir la formación uniforme de capas epitelial y endotelial
   18. Cambia el medium cada 3 días. Aspira el medio de los depósitos de salida. Añade 3 mL de medio fresco a cada depósito de entrada.
       NOTA: Vigila si hay burbujas bajo el microscopio. Si lo hay, desconecta el chip, limpia los canales con el medio y vuelve a conectar.
6. Diferenciación celular epitelial y cultivo de interfaces aire-líquido
   1. Monitoriza las células a diario bajo el microscopio.
   2. Confirmar la formación de una capa celular epitelial homogénea sin huecos (normalmente entre 3 y 5 días).
   3. Establecer la interfaz aire-líquido (ALI).
   4. Aspira el medio desde los depósitos superiores de entrada y salida.
   5. Eliminar el medio residual del canal superior aumentando el caudal a 600 μL/h usando la esfera rotatoria
   6. Aspira rápidamente el medio desde los depósitos de salida superiores.
   7. Aspira el medio desde los depósitos de entrada inferiores.
   8. Añadir 3 mL de medio de diferenciación epitelial suplementado con 10 ng/mL de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y 1 μg/mL de vitamina C.
   9. Pon el canal superior en "aire" usando la rueda rotatoria.
   10. Ajusta el caudal inferior del canal a 30 μL/h.
   11. Mantén la cultura ALI durante 2 semanas.
   12. Observa el desarrollo de la diferenciación epitelial bajo el microscopio.
   13. Confirmar la formación de un epitelio pseudoestratificado. Monitoriza el batido de los cilios y la producción de moco.
   14. Monitorizar la morfología de las células endoteliales en las regiones de entrada y salida.

Figura 1: Plataforma microfluídica de pulmón en chip. Sección transversal (izquierda) y vista superior (derecha) del dispositivo microfluídico de pulmón en un chip de dos canales. Las ilustraciones esquemáticas se proporcionan únicamente con fines ilustrativos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Posición del chip en el soporte del chip. Imagen representativa que muestra la orientación correcta de la cuna del chip y su colocación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Siembra de células endoteliales en el chip microfluídico. Imágenes representativas en campo claro de las células endoteliales microvasculares pulmonares inmediatamente después de la siembra (A) y tras 2 horas de incubación (B). Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Siembra de células epiteliales de las vías respiratorias en el chip microfluídico.
Imágenes representativas en campo claro de las células epiteliales de las vías respiratorias inmediatamente después de la siembra (A) y después de 4 horas de incubación (B). Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Configuración del sistema microfluídico pulmón en chip.
La parte superior de la figura muestra el módulo portátil con cuatro depósitos (dos entradas y dos salidas) usados para el suministro de medios y la recogida de efluentes. El dispositivo microfluídico está conectado a un módulo de cultivo que regula los caudales y a un módulo hub que suministra gas, aire y energía. La representación esquemática se proporciona únicamente con fines ilustrativos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Evaluación de la integridad de las barreras

La integridad de la barrera se evaluó de dos maneras: primero, funcionalmente, evaluando la permeabilidad al dextrano marcado con fluorescencia a lo largo del tiempo (antes de la ALI y después de 10 días de ALI), y segundo, cualitativamente, mediante inmunodetección de Zonula Ocludens-1 (ZO-1) en el epitelio bronquial y la endotelial vascular cadherina (VE-cadherina) en el endotelio vascular pulmonar.

1. Función de barrera
   1. Bajo el flujo laminar, añadir 1 mL de medio de diferenciación epitelial suplementado con VEGF y vitamina C y que contenga 100 μg/mL de dextrán marcado con fluorescencia al depósito superior de entrada del canal de la vía aérea. Simultáneamente, añadir 1 mL de medio libre de trazadores al depósito de entrada inferior del canal vascular.
   2. Introduce el medio que contiene el trazador en el canal superior. Usando la esfera rotatoria, ajusta el caudal en ambos canales a 600 μL/h durante 3 minutos, luego aspira el medio de ambos depósitos de salida superior e inferior.
   3. Coloca el chip, conectado al módulo portátil, de nuevo en el módulo de cultura. Usando la esfera rotatoria, ajusta ambos canales a un caudal de 45 μL/h y mantén este caudal durante 3 h.
   4. Recoge 100 μL de medio de los depósitos de salida superior e inferior y mide la intensidad de fluorescencia usando un lector de placas.
   5. Calcular la permeabilidad aparente (Papp) usando la ecuación de permeabilidad:
      
      donde SA representa el área superficial del canal de cocultivo (0,17 cm²), Q_R y_{Q D} denotan los caudales del fluido en los canales dosificadores y receptores respectivamente (cm³/s) y C_R,0 y C_D,0 corresponden respectivamente a las concentraciones recuperadas en los canales dosificadores y receptores.
      NOTA: Un valor de Papp inferior a 1 x ^10-6 cm/s indica una fuerte integridad de la barrera, reflejando baja permeabilidad de la capa epitelial al trazador. Este umbral lo establece el fabricante del sistema como una medida interna de control de calidad.
2. Inmunodetección de uniones tensas y adherentes
   1. Después de 2 semanas de ALI, retira cuidadosamente el chip del módulo portátil.
   2. Fija las células añadiendo 50 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% a ambos canales durante 20 minutos en RT.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico; Realiza todos los pasos en una campana extractora certificada para químicos.
   3. Lava ambos canales dos veces con 200 μL de DPBS (-/-) y guarda las astillas a 4 °C hasta que se teñan.
   4. Permeabiliza las células añadiendo 50 μL de 0,1% de Triton X-100 en DPBS (-/-) durante 5 minutos en RT. Luego bloquea con 50 μL 0,1% de Triton X-100 en DPBS (-/-) que contenga un 10% de suero de cabra, por canal durante 1 hora en RT.
   5. Incubar el canal superior (epitelio bronquial) con 50 μL del anticuerpo primario monoclonal antihumano ZO-1 del ratón (1:100), y el canal inferior (endotelial vascular pulmonar) con 50 μL de anticuerpo primario monoclonal anti-humano VE-cadherina de conejo (1:600).
   6. Diluir ambos anticuerpos en solución de anticuerpos (0,1% Triton X-100 en PBS (-/-) con suero de cabra al 1%) e incubar ON a 4°C en condiciones estáticas.
   7. Lava las virutas tres veces con 200 μL de DPBS (-/-). Luego incubar cada canal durante 1 hora en RT con 50 μL de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados, diluidos en solución de anticuerpos (1:500): anticuerpo secundario anti-ratón de cabra en el canal superior y anti-conejo de cabra en el canal inferior.
   8. Lava ambos canales tres veces con 200 μL DPBS (-/-). Realizar tinción nuclear con 50 μL para cada canal de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1 μg/mL en DPBS (-/-)) durante 10 minutos en RT.
   9. Realizar un lavado final con 200 μL de DPBS (-/-) y almacenar el chip en DPBS (-/-) a 4°C en la oscuridad hasta la imagen.
   10. Fotografía las astillas en las cubiertas (20x60 mm con un grosor de 0,16-0,19 mm) usando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un módulo de disco giratorio, una cámara de alta sensibilidad y un objetivo 20X (NA 0,8). Utiliza software adecuado de adquisición y análisis de imágenes para el postprocesado.

3. Fenotipado

1. Preparación de las secciones de astillas
   1. Fijen los chips con un 4% de PFA según se describe en la sección 2.2.2.
   2. Elimina el polidimetilsiloxano (PDMS) circundante del chip usando una cuchilla de afeitar.
   3. Llenar ambos canales con 50 μL de agarosa de baja fusión al 2% en DPBS (-/-), y permitir que la agarosa solidifique en RT.
   4. Corta la astilla transversalmente en dos mitades usando una cuchilla de afeitar, incrusta cada mitad en un medio de incrustación a temperatura óptima de corte (OCT) y guárdalo a −80 °C hasta la sección.
2. Criosección
   1. Prepara un criostato y corta criosecciones de 200 μm de las mitades del chip.
   2. Recoge las secciones de astillas con pinzas en pozos de una placa de 48 pozos llena de DPBS (-/-) y guárdalas a 4 °C hasta que se inmunecine.
3. Tinción inmunofluorescente
   NOTA: Realiza cada paso en la placa de 48 pozos, usando 400 μL como volumen de referencia.
   1. Permeabiliza las células y bloquea la unión inespecífica como se describió anteriormente en la sección 2.2.4.
   2. Incubar cada sección de ON a 4°C con anticuerpos primarios específicos para células ciliadas epiteliales (β-tubulina IV, 1:2000) o para células endoteliales (CD31, 1:25), diluidos en solución de anticuerpos (0,1% Triton X-100 en DPBS con suero de cabra al 1%).
   3. Lava las secciones tres veces con DPBS (-/-).
   4. Incubar secciones durante 1 hora en RT con anticuerpos secundarios anti-ratón anti-ratón conjugados con fluoróforo (1:500) para β-tubulina IV y CD31, diluidos en solución de anticuerpos, protegidos de la luz.
   5. Lavar las secciones tres veces con DPBS (-/-) y realizar tinción nuclear con DAPI (1 μg/mL en DPBS (-/-)) durante 10 minutos en RT.
   6. Lava las secciones una vez con DPBS (-/-) antes de montarlas.
   7. Con pinzas, coloca un separador en cada lámina de microscopio y luego coloca una sección en el centro. Añade 1 o 2 gotas de medio de montaje y coloca una cubierta circular.
   8. Déjalas secar en la oscuridad en RT, luego sella los bordes de la cubierta con esmalte transparente.
   9. Guarda las láminas a 4°C en la oscuridad hasta la imagen.
   10. Fotografía las secciones de chips usando un microscopio de fluorescencia invertida, equipado con un módulo de disco giratorio, una cámara de alta sensibilidad y un objetivo de 40X (NA 1.25). Procesar imágenes utilizando el software de microscopía adecuado.

4. Extracción y cuantificación de ARN

1. Colección de celdas de chips bajo flujo laminar
   1. Tras 2 semanas de cultivo ALI, desconecte los chips de los módulos portátiles y lave ambos canales dos veces con 200 μL de DPBS (-/-) precalentados a 37 °C.
   2. Añadir 35 μL de tripsina-EDTA al 0,25% (1X) a las células endoteliales del canal inferior e incubar durante aproximadamente 30 segundos en RT.
   3. Inspecciona las células bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento completo. Luego recoge la suspensión de la celda en un tubo y centrifuga a 900 × g durante 5 minutos en RT.
   4. Resuspende el pellet celular en 50 μL de reactivo de aislamiento de ARN basado en fenol y almacena a -80 °C hasta la extracción de ARN.
   5. Añadir 50 μL de reactivo de aislamiento de ARN basado en fenol directamente en el canal superior para lisar las células epiteliales, sellar los puertos con puntas e incubar sobre hielo durante 3-4 minutos.
   6. Pipetea suavemente para asegurar la lisis completa, recoge el lisado en un tubo y guárdalo a -80 °C hasta la extracción de ARN.
   7. Inspecciona ambos canales bajo un microscopio para confirmar la colección completa de la célula.
2. Extracción de ARN
   1. Añadir cloroformo (0,2 volumen por 1 volumen de reactivo de aislamiento de ARN basado en fenol usado para la lisis; 10 μL por muestra), mezclar los tubos cuidadosamente agitándolos e incubar sobre hielo durante 2-3 minutos.
   2. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar las fases y transferir cuidadosamente la fase acuosa superior a un nuevo tubo sin alterar la interfase. Luego, añade 5 μg de glucógeno libre de ARN a la fase acuosa como portador.
   3. Añadir isopropanol (0,5 volumen por 1 volumen de reactivo de lisis; 25 μL por muestra), incubar muestras a 4 °C durante 10 minutos y centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
   4. Descarta el sobrenadante mientras conservas el pellet de ARN.
3. Lavado y resuspensión de ARN
   1. Lavar el pellet de ARN con etanol al 75% (1 volumen por 1 volumen de reactivo de lisis; 50 μL por muestra), vórtice brevemente y centrifugar a 7.500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   2. Desecha el sobrenadante y deja que la pastilla se seque al aire durante 5–10 minutos.
   3. Resuspende ARN en 30 μL de agua libre de RNasa mediante pipeteo suave y almacena ARN a -80 °C hasta su uso adicional.
   4. Evalúa la integridad y cuantificación del ARN utilizando un sistema de separación de ácidos nucleicos basado en chips microfluídicos.

Resultados

Establecimiento de los modelos de cocultura pulmón en chip

Las imágenes en campo claro revelaron adhesión y crecimiento celular a lo largo del tiempo en el sistema de cocultivo pulmón en chip. Las células epiteliales de las vías respiratorias bronquiales proliferaron en cultivo sumergido en la interfaz líquido-líquido (LLI), formando una capa uniforme a lo largo del canal superior (Figura 6A), mientras que las células endoteliales vasculares pulmonares se expandieron para cubrir todo el canal inferior, formando una monocapa confluente (Figura 6B).

Una vez establecida la co-cultura, se monitorizaron las células endoteliales en las regiones de entrada y salida del canal inferior, que son las únicas áreas accesibles para inspección microscópica. Como se muestra en la Figura 7, las células endoteliales permanecieron viables y mostraron una morfología alargada alineada con la dirección del flujo. Tras 14 días de cultivo de ALI, la capa epitelial tanto en modelos sanos como en EPOC mostraba latidos ciliares visibles (Vídeo suplementario). Como era de esperar, el modelo de EPOC mostró un aumento notable en la producción de moco en comparación con el modelo sano (Figura 8), recapitulando características clave de la patología de la EPOC.

Figura 6: Co-cultivo de células epiteliales y endoteliales de las vías respiratorias en el dispositivo microfluídico.
Imágenes representativas de células epiteliales bronquiales primarias en la superficie superior (A) y de células endoteliales microvasculares pulmonares primarias en la superficie inferior (B) de la membrana porosa bajo condiciones de interfaz líquido-líquido (LLI). Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Células endoteliales en el canal microfluídico inferior durante la interfaz aire-líquido.
Imágenes representativas de campo brillante que muestran células endoteliales microvasculares pulmonares en la entrada (superior) y salida (inferior) del canal inferior durante la interfaz aire-líquido (ALI). Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Acumulación de moco en el canal de la vía aérea.
Imágenes representativas que muestran la producción de moco tras 14 días de interfaz aire-líquido (ALI) en modelos de cocultivo sanos (A) y EPOCO (B). La capa marrón en el compartimento de las vías respiratorias representa la acumulación de moco. Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Evaluación cuantitativa de la integridad de la barrera

La evaluación funcional de la integridad de la barrera mostró una menor permeabilidad aparente (Papp) tanto en modelos sanos como en modelos de EPOC en comparación con el control positivo (chip recubierto de ECM sin células) (Figura 9).

En ausencia de células, valores altos de Papp indicaban una formación mínima de barreras. En contraste, en presencia de capas epitelial y endotelial, el trazador fluorescente de dextrán no cruzó la MEC, lo que resultó en una permeabilidad notablemente disminuida e indicó una barrera fuerte. Este efecto se observó tanto antes de la ALI como después de 10 días de ALI, demostrando que la función de barrera se establece temprano durante la diferenciación.

Como se muestra en la Figura 10, en el modelo sano, los valores medios de Papp antes de la ALI ya estaban por debajo del umbral indicativo de integridad robusta de barreras (1 × 10⁻⁶ cm/s) y disminuían aún más durante el cultivo de la ALI. En el modelo de EPOC, los valores medios de Papp también estaban dentro del rango de barrera fuerte antes de la ALI y, aunque ligeramente aumentaron tras 10 días de ALI, la integridad de la barrera se mantuvo robusta.

Figura 9: Evaluación de la función de barrera en el modelo pulmón en chip.
La permeabilidad aparente (Papp) medida en chips recubiertos de ECM sin células (control positivo para fuga; negro), y en modelos sanos (rosa) y de EPOC (verde) antes y después de 10 días de interfaz aire-líquido (ALI). Cada punto representa un chip individual. El modelo sano incluye células de donantes separados, mientras que el modelo de EPOC utiliza células derivadas de un solo paciente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10: Comparación de la función de barrera en modelos sanos y de EPOC.
La permeabilidad aparente (Papp) se midió antes y después de 10 días de interfaz aire-líquido (ALI) en modelos de cocultivo sanos (izquierda) y EPOC (derecha). Cada punto representa un chip individual. Los valores son medios ± SD. El modelo de EPOC incluye células de tres pacientes, mientras que el modelo sano combina células de diferentes donantes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Inmunodetección de uniones tensas y adherentes

El análisis de inmunofluorescencia confirmó la organización estructural de las proteínas unionales. ZO-1 mostró una localización continua a lo largo de los bordes de las células epiteliales bronquiales, lo que indica una barrera epitelial intacta (Figura 11A). De manera similar, la tinción con VE-cadherina reveló una distribución uniforme en las uniones endoteliales, consistente con una monocapa endotelial confluente. Las células endoteliales mostraron una morfología alargada alineada con la dirección del flujo (Figura 11B).

No se observaron diferencias entre los modelos sanos y de EPOC en la localización de proteínas de unión estrecha y adherente. Estos hallazgos son coherentes con los datos de barreras funcionales, apoyando la presencia de una interfaz epitelial-endotelial fisiológicamente relevante con integridad de unión preservada en ambos modelos.

Figura 11: Expresión de proteínas unionales en el modelo de cocultivo pulmón en chip.
Imágenes de inmunofluorescencia en vista superior obtenidas tras 14 días de interfaz aire-líquido (ALI) que muestran la localización de ZO-1 en el compartimento epitelial de las vías respiratorias (A) y la localización de VE-cadherina en el compartimento endotelial (B). Los núcleos se teñen con DAPI. La flecha indica la dirección del flujo. Barra de escala: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Fenotipado

La tinción inmunofluorescente de criosecciones en chip reveló células β-tubulina IV positivas en el lado apical de la membrana, indicando la diferenciación de células epiteliales de las vías respiratorias en células ciliadas, una característica definitoria del epitelio bronquial maduro (Figura 12A). La tinción CD31 confirmó la presencia de una monocapa endotelial confluente a lo largo del lado basal de la membrana (Figura 12B). Estos resultados demuestran que el sistema de co-cultivo apoya el establecimiento de fenotipos epiteliales y endoteliales fisiológicamente relevantes en ambos modelos.

Figura 12: Imágenes de inmunofluorescencia de secciones eficaces pulmón en chip. Tinción inmunofluorescente representativa de secciones transversales de chips tras 14 días de interfaz aire-líquido (ALI) mostrando expresión de β-tubulina IV en el compartimento epitelial de las vías respiratorias (A) y expresión de CD31 en el compartimento endotelial (B). Los núcleos se teñen con DAPI. Barra de escala: 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Extracción y cuantificación de ARN

El ARN aislado de células epiteliales de las vías respiratorias dio concentraciones que oscilaban entre 59 y 135 ng/μL, con Números de Integridad del ARN (RIN⁾¹¹ de 7,4–9,6, mientras que el ARN de células endoteliales microvasculares oscilaba entre 12 y 46 ng/μL, con valores de RIN de 9,6–10, en ambos modelos. Los datos indicaron que ambos modelos lograron cantidades suficientes de ARN de alta calidad, adecuados para análisis moleculares posteriores.

Tabla suplementaria 1: Información sobre donantes para las células epiteliales de las vías respiratorias. La tabla representa las células epiteliales de las vías respiratorias bronquiales utilizadas en el modelo sano. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Información sobre donantes para las células endoteliales microvasculares pulmonares. Información del donante para células endoteliales microvasculares pulmonares utilizadas en el modelo sano. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Información del paciente. La tabla representa información sobre las células endoteliales epiteliales de las vías respiratorias y microvasculares pulmonares utilizadas en el modelo de EPOC. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Resumen de los principales reactivos y medios de cultivo utilizados en el protocolo.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo suplementario 1: Latidos ciliares en el canal de las vías respiratorias (modelo sano).
Vídeo representativo mostrando latidos ciliares tras 14 días de interfaz aire-líquido (ALI). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo suplementario 2: Latidos ciliares en el canal de las vías respiratorias (modelo EPOC).
Vídeo representativo mostrando latidos ciliares tras 14 días de interfaz aire-líquido (ALI). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio presenta un protocolo detallado para establecer un sistema de co-cultivo pulmón en chip para generar tanto un modelo sano, utilizando células endoteliales epiteliales bronquiales y microvasculares pulmonares disponibles comercialmente, como un modelo de EPOC utilizando células derivadas del paciente de pulmones explantados. En ambos modelos, los dos tipos celulares están separados por una membrana porosa y elástica recubierta con matriz extracelular específica de cada tipo celular (ECM), lo que permite un microambiente que se asemeja más al pulmón in vivo . El protocolo también incluye métodos para evaluar la integridad de la barrera, fenotipado celular y extracción de ARN de cada compartimento. Ambos modelos se mantuvieron con éxito bajo condiciones de perfusión dinámica e interfaz aire-líquido (ALI), resultando en una barrera epitelial-endotelial fisiológicamente relevante con un epitelio de vía aérea pseudoestratificado completamente diferenciado. Las células endoteliales se alinearon con la dirección del flujo, observado in vivo, y se obtuvo ARN de alta calidad de ambos compartimentos.

Varios pasos críticos son esenciales para establecer con éxito este sistema de cocultura. Se requiere una siembra precisa de células epiteliales para lograr una cobertura uniforme, ya que una distribución no uniforme puede resultar en una cobertura superficial incompleta y en una formación comprometida de barreras. En tales casos, el compartimento apical debe aspirarse suavemente y resembrar las células epiteliales. El establecimiento de la ALI solo debe realizarse una vez que ambas capas epitelial y endotelial formen monocapas continuas, ya que la exposición prematura a la ALI puede provocar una fuga de medio vascular hacia el compartimento de las vías respiratorias y una diferenciación alterada. Si no se logra la confluencia, el establecimiento de la ALI debería retrasarse.

La eliminación incompleta del medio apical o la exposición inconsistente a la IA puede conducir a una maduración epitelial heterogénea. El medio residual en el canal superior puede eliminarse aumentando el caudal a 600 μL/h durante 3–4 minutos. La formación de burbujas, que interrumpe la perfusión y afecta la viabilidad celular, puede producirse debido a un equilibrio insuficiente. Las burbujas pueden eliminarse aumentando temporalmente el flujo a 600μL/h durante 3-4 minutos o, si persisten, desconectando el chip y desalojándolas manualmente con una pipeta. En el modelo de EPOC, la producción excesiva de moco puede obstruir el canal de las vías respiratorias y dificultar la perfusión; en tales casos, se recomienda un lavado suave con DPBS seguido del restablecimiento de la ALI.

La mayoría de los sistemas de cocultivo existentes que combinan células epiteliales de las vías respiratorias y endoteliales pulmonares dependen de células primarias comercialmente disponibles y recubrimientos genéricos de ECM como colágeno o^{fibronectina 10,12}. Aunque estos soportan la adhesión, solo reproducen parcialmente las propiedades bioquímicas y mecánicas de la interfaz vía aérea–vascular. En cambio, el sistema actual emplea recubrimientos ECM específicos de tipo celular, proporcionando un microambiente que imita más de cerca el tejido pulmonar^{humano 13}.

La función de barrera se evalúa comúnmente utilizando resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER), aunque este método puede estar influenciado por la organización epitelial multicapa¹⁴. En este estudio, se utilizó la permeabilidad al dextrano para evaluar la integridad funcional. Los valores observados de Papp estaban por debajo del umbral para una fuerte integridad de barrera (1 × 10⁻⁶ cm/s), lo que indica una interfaz epitelial-endotelial robusta. El epitelio de las vías respiratorias mostró características de diferenciación que incluían latidos ciliares y producción de moco, junto con una localización continua de ZO-1 y VE-cadherina en las uniones celulares. Además, se obtuvo de forma constante ARN de alta calidad de ambos compartimentos, lo que permitió análisis posteriores específicos por tipo celular.

Un avance clave de este trabajo es el desarrollo de un modelo de pulmón en chip para EPOC, en el que tanto las células epiteliales como las endoteliales se derivan del mismo paciente. Hasta donde se sabe recientemente, no se había reportado previamente una cocultura con este tipo de pacientes. Estudios anteriores han incorporado células epiteliales derivadas de la EPOC ^7,8, pero se han basado en células endoteliales de origen comercial, limitando la investigación de las interacciones epiteliales-endoteliales específicas de la enfermedad. El modelo actual supera esta limitación al preservar las interacciones celulares específicas del paciente.

El modelo de EPOC recapituló características clave de la enfermedad, incluyendo un aumento de la producción de^{moco 3}, manteniendo al mismo tiempo la alineación endotelial y la integridad de la unión bajo el flujo. Es importante destacar que el cocultivo de células epiteliales y endoteliales derivadas del paciente no comprometió la función ni la viabilidad de la barrera, a pesar del aumento de la producción de moco. El sistema se mantuvo estable bajo condiciones de ALI y perfusión continua, lo que apoyó su uso en estudios a largo plazo. Además, la plataforma permite un estiramiento mecánico, lo que mejora aún más su relevancia fisiológica.

Una fortaleza importante de este flujo de trabajo es la capacidad de evaluar condiciones saludables y de EPOC dentro de la misma plataforma bajo parámetros experimentales comparables. Esto permite una evaluación directa de las diferencias asociadas a la enfermedad en la diferenciación epitelial, la función endotelial y la integridad de la barrera. Los modelos también pueden usarse de forma independiente, dependiendo de la pregunta de investigación. El modelo sano es adecuado para estudios mecanicistas y modulación de vías, mientras que el modelo de EPOC proporciona una plataforma para la evaluación terapéutica y el análisis de fármacos. La capacidad de extraer ARN de alta calidad de cada compartimento por separado permite aún más un perfilado molecular específico por tipo celular. El uso de células emparejadas con pacientes en el modelo de EPOC preserva interacciones relevantes para la enfermedad que de otro modo se perderían al combinar fuentes celulares no relacionadas.

A pesar de estas ventajas, deben considerarse varias limitaciones. El uso de sistemas de pulmón en chip requiere equipos especializados y conocimientos técnicos, lo que puede limitar la accesibilidad. Además, el modelo actualmente no incluye otros tipos celulares pulmonares relevantes, como las células inmunitarias o estromales, que pueden influir en las respuestas a patógenos y fármacos. Sin embargo, la plataforma puede adaptarse para incorporar células inmunitarias circulantes, lo que permite investigar sus interacciones con los compartimentos epiteliales y endoteliales. El acceso al material de EPOC derivado del paciente también puede ser limitado, y la variabilidad entre pacientes puede afectar a la reproducibilidad. Además, una producción excesiva de moco puede interferir con la perfusión.

El impacto del estiramiento mecánico cíclico no se investigó en este estudio, pero representa una dirección importante para el futuro. La membrana extensible permite simular fuerzas mecánicas asociadas a la respiración, que se sabe influyen en la función celular, la reparación y la^{homeostasis 15,16}. Estudios previos han demostrado que la tensión mecánica puede aumentar la captación y el transporte de nanopartículas a través de la barrera^{epitelial 10}.

En conclusión, los modelos sanos y de EPOC de pulmón en chip presentados aquí proporcionan una plataforma fisiológicamente relevante para estudiar las interacciones epitelial-endoteliales en salud y enfermedad. La naturaleza dinámica del sistema permite un control preciso de las condiciones de flujo y apoya aplicaciones como pruebas de fármacos y estudios de exposición a patógenos. Este protocolo ofrece una alternativa robusta a los modelos tradicionales in vitro y animales y representa una herramienta valiosa para avanzar en la investigación traslacional respiratoria.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% trypsin-EDTA (1X)  (para células endoteliales)	Gibco	25200-056	Utilizado para la desconexión enzimática de células endoteliales microvasculares pulmonares.
plato cuadrado de cultivo celular de 120 mm x 120 mm	VWR	688161	Utilizado para sujetar el chip durante la preparación y manipulación del mismo.
Bioanalyzer 2100	Agilent	G2939A	Utilizado para evaluar la calidad e integridad del ARN.
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516	Utilizado para precipitar el ARN durante la extracción.
4′,6-diamidino-2-fenilindo (DAPI)	Invitrogen	D1306	Utilizado para teñir los núcleos celulares durante la inmunofluorescencia.
tubos cónicos de 50 mL	Cellstar	227261	Utilizado para la recolección de células, centrifugación y preparación de suspensiones celulares.
Kit de ARN Agilent 6000 Nano	Agilent	5067-1511	Utilizado para el análisis de calidad del ARN con el Bioanalyzer.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Utilizado para prevenir la contaminación fúngica durante el cultivo celular.
Contador de células automático	NanoEntek	EVE PLUS	Utilizado para determinar la concentración y viabilidad celular antes de sembrar.
Platos multipocillo de cultivo celular, 48 pocillos, estériles	Falcon	353078	Utilizado para sujetar las secciones durante los procedimientos de tinción.
Centrífuga	Hettich	320R	Utilizado para formar gránulos celulares antes de sembrar.
Chip Cradle	Emulate	support@emulatebio.com	Utilizado para sostener y sujetar los chips durante la activación superficial, el recubrimiento y la siembra de células.
Cloroformo	Sigma-Aldrich	366927	Utilizado para la separación de fases durante la extracción de ARN.
Módulo de disco giratorio Cicero	CrestOptics S.p.A.		Utilizado para realizar imágenes de fluorescencia confocal de alta velocidad.
Cubiertas	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	Utilizado para sostener los chips durante la imagen confocal. Descripción: 24 x 60 mm, #1.5
Criostato	Thermo Fisher Scientific	NX70	Utilizado para cortar muestras incrustadas en OCT.
Módulo de cultivo (Zoë-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	Utilizado para controlar las condiciones ambientales para el cultivo celular dentro del sistema microfluídico.
Inhibidor de tripsina Define (DTI)	Thermo Fisher	R007100	Utilizado para neutralizar la actividad de la tripsina después de la desconexión de las células epiteliales.
Dextrano Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	Utilizado como trazador fluorescente para evaluar la permeabilidad de la barrera.
Kit de medio de crecimiento de células endoteliales MV2	PromoCell	C-22022	Utilizado para el mantenimiento y expansión de células endoteliales microvasculares pulmonares.
ER-1  reactivo de activación de superficie (reactivo de activación sensible a la luz en polvo)	Emulate	support@emulatebio.com	Utilizado para activar las superficies de los chips para el recubrimiento posterior.
ER-2  reactivo de activación de superficie (búfer)	Emulate	support@emulatebio.com	Utilizado como búfer durante la activación superficial del chip.
Etanol absoluto	Thermo Fisher Scientific	437433T	Utilizado para lavar los gránulos de ARN durante la extracción.
Lector de placas fluorescente	Agilent	Lector de microplacas BioTek Sinergy H1	Utilizado para medir la intensidad de fluorescencia en los ensayos de permeabilidad.
Gelatín de piel de bovino	Sigma-Aldrich	G9391	Utilizado para recubrir las superficies de cultivo para promover la adhesión de células endoteliales.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (para ZO-1 y β-tubulina IV)	Thermo Fisher	A11001	Utilizado para detectar anticuerpos primarios de ratón con fluorescencia verde.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (para CD31)	Thermo Fisher	A11005	Utilizado para detectar anticuerpos primarios de ratón con fluorescencia roja.
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (para VE-cadherina)	Thermo Fisher	A21429	Utilizado para detectar anticuerpos primarios de conejo con fluorescencia naranja-roja.
Módulo de conexión (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	Utilizado para suministrar gas y energía al módulo de cultivo.
Células epiteliales bronquiales humanas (HBEC)	Lonza	CC-2540S	Utilizado como células epiteliales de las vías respiratorias para establecer el modelo de co-cultivo saludable.
Colágeno humano  IV	Sigma	C5533	Utilizado para recubrir los matraces T25 para promover la adhesión de células epiteliales.
Colágeno humano tipo I	Advanced Biomatrix	5007	Utilizado como componente de la solución de matriz extracelular para el recubrimiento de los chips.
Fibronectina humana	Sigma-Aldrich	F0895	Utilizado como componente de la solución de matriz extracelular para el recubrimiento de los chips.
Laminina humana	Sigma -Aldrich	L4544	Utilizado como componente de la solución de matriz extracelular para el recubrimiento de los chips.
Células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC)	PromoCell	C-12281	Utilizado como células endoteliales microvasculares pulmonares para establecer el modelo de co-cultivo saludable.
factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (hrEGF)	PromoCell	C-60182	Utilizado para promover la proliferación de células epiteliales.
Solución madre de hidrocortisona	StemCell Technologies	7925	Utilizado como suplemento en el medio de cultivo para apoyar la diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias.
ImageJ	Software Fiji	versión ImageJ 1.54p	Utilizado para procesar y analizar las imágenes adquiridas.
Microscopio invertido para cultivo celular	Leica Microsystems	DMi1	Utilizado para monitorear la morfología y la confluencia celular durante el cultivo.
iSpacer	SUNJin Lab	IS307	Utilizado para crear una cámara definida para el montaje de muestras durante la imagen. Grosor: 0.3 mm.
Cámara Kinetix	Teledyne Photometrics		Utilizado para capturar imágenes de fluorescencia de alta resolución.
Cámara de microscopio	Leica Microsystems	FLEXA CAM C1	Utilizado para capturar imágenes de