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Artículo de método

Evaluaciones de la oxigenación y perfusión vascular en modelos preclínicos de cáncer y cicatrización de heridas utilizando OS-DCE OAI

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DOI:

10.3791/70689

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7 de abril de 2026

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1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para realizar la Imagen Optoacústica Sensible al Oxígeno – Imagen Optoacústica Mejorada por Contraste Dinámico (OS-DCE OAI) para evaluar modelos preclínicos de cáncer y cicatrización de heridas. El OAI puede obtener imágenes de oxihemoglobina y desoxihemoglobina, mapeando la oxigenación tisular. El DCE-OAI puede obtener imágenes de la farmacocinética de un agente de contraste exógeno, mapeando así la perfusión vascular.

Resumen

La imagen optoacústica sensible al ogénigeno (OS, OAI) y la imagen optoacústica dinámica con contraste mejorado (DCE OAI) proporcionan lecturas complementarias y no invasivas de la fisiología tisular. La OAI de la AO aprovecha la detección multiespectral de oxihemoglobina y desoxihemoglobina endógenas para generar mapas de saturación de oxígeno en sangre (%sO₂), mientras que la OAI de la DCE rastrea la farmacocinética in vivo de un absorbente en infrarrojo cercano para cuantificar la perfusión y permeabilidad vascular. El objetivo de este protocolo es presentar un flujo de trabajo unificado OS-DCE OAI que permita la evaluación simultánea de la oxigenación y la perfusión en dos entornos preclínicos ampliamente utilizados: tumores ortotópicos de cáncer de mama y heridas cutáneas de grosor total.

En este protocolo, demostramos la IAO de modelos murinos de cáncer de mama o heridas de laceración. Para OS OAI, se adquieren escaneos multiespectrales multi-corte a 700–875 nm para permitir la desmezcla espectral y la estimación de %sO₂. Para la DCE OAI, las adquisiciones repetidas a resolución temporal ≤5-s se realizan antes y después de la inyección intravenosa de bolo de verde de indocianina (ICG), utilizando muestreo multiespectral a 700-875 nm o muestreo de longitud de onda única a 800 nm para generar curvas de amplitud de la señal de OA en función del tiempo. Se detallan el desarrollo de modelos animales, la preparación para la imagen de OA, las adquisiciones de OAI OS y DCE, y los análisis para medir características de la oxigenación y la perfusión vascular, junto con guías clave para la resolución de problemas de artefactos de movimiento, absorbentes superficiales e inyecciones fallidas.

En conjunto, este protocolo OS-DCE OAI proporciona un retrato funcional integrado de la hipoxia y el transporte vascular que puede detectar cambios fisiológicos en tumores y heridas antes que las medidas anatómicas globales. OS-DCE OAI es fácilmente adaptable a otros modelos de enfermedades.

Introducción

La imagen optoacústica (OAI), también conocida como imagen fotoacústica o tomografía optoacústica multiespectral, es una modalidad relativamente nueva que combina la excitación óptica con la detección por ultrasonido (US) para permitir la imagen detejidos profundos 1,2. En la OAI, pulsos láser de nanosegundos breves excitan cromóforos endógenos como la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina, produciendo expansión termoelástica localizada y ondas acústicas de banda ancha que son detectadas por transductores estadounidenses. Estas señales permiten que la OAI produzca imágenes con contraste óptico a una resolución espacial similar a la de un ultrasonido, logrando una profundidad de visión a escala de centímetro in vivo. Cuando los datos se adquieren en múltiples longitudes de onda y se analizan mediante desmezcla espectral, el IAO sensible al oxígeno (OS) puede estimar las concentraciones relativas de oxihemoglobina y desoxihemoglobina y, por tanto, inferir la saturación de oxígeno tisular (%sO₂)2. La saturación de ogen en sangre proporciona una evaluación funcional de la fisiología microvascular que es difícil de alcanzar de forma no invasiva con otros métodos.

La perfusión vascular también es útil para la evaluación de la fisiología microvascular. La perfusión vascular representa una combinación de flujo vascular, permeabilidad y superficievascular 3. Para cuantificar la perfusión, la IAO puede utilizarse junto con un agente de contraste exógeno para realizar la OAI Dinámica Mejorada por Contraste (DCE OAI). En este enfoque, la imagen temporal antes, durante y después de la inyección del agente de contraste monitoriza la farmacocinética (PK) del agente. Estos resultados pueden modelarse para medir la tasa de lavado (NKtrans) desde el compartimento plasmático sanguíneo hasta el compartimento extravascular extracelular tumoral, y la tasa de lavado (kep) desde el compartimento extravascular extracelular tumoral hacia el compartimento plasmático. Hemos desarrollado un método de modelado PK que evita el notorio problema de la fluidez de la luz (es decir, dispersión y absorbancia en tejidos que causan energía radiante variable a través del tejido)4. Nuestro método normaliza el cambio en la señal dinámica de OAI de 0% (pre-inyección) a 100% (máxima potencia) y luego utiliza ecuaciones diferenciales para estimar la tasade transferencia NK y lak ep. Otros estudios de DCE OAI han utilizado métodos estándar de modelado PK que presentan la principal suposición de que la fluidez de la luz es uniforme en todo eltejido 5,6.

Los resultados de DCE OAI también pueden utilizarse para evaluar las tasas de lavado realizando mediciones empíricas de Mejora Máxima de Señal (MSE), Tiempo hasta el Pico (TTP) para alcanzar MSE, pendiente (típicamente para la inyección a TTP) y Área Inicial Bajo la Curva (IAUC; de nuevo típicamente para la inyección a TTP después de la inyección)7. Cabe señalar que si la TTP ocurre más tarde en la curva PK, la pendiente o IAUC puede tomarse durante la parte lineal de la curva o desde el momento de la inyección hasta 1 minuto después de la inyección. Hemos demostrado que las mediciones empíricas también pueden ser útiles al evaluar tratamientos administrados a modelos tumorales o al evaluar la cicatrización deheridas 8,9. Otros estudios también han demostrado valor en el uso de mediciones empíricas para evaluar la permeabilidad vascular tumoral y la fibrosishepática 10,11. La forma de la curva PK también puede utilizarse para categorizar cualitativamente la perfusión vascular tumoral como alta o baja 12,13,14.

Además, la señal de OAI en un único punto de tiempo post-inyección puede utilizarse como evaluación empírica de la perfusión, conocida como OAI Mejorada con Contraste No Dinámico (CE OAI)15. Una imagen de OA de CE que muestra un tumor o herida brillante es simple y muy visual, y sin embargo a menudo solo se utiliza para una evaluación cualitativa de perfusión alta frente a baja. En general, el cambio dinámico en las señales de OAI tras la TTP no se analiza empíricamente para evaluar empíricamente la perfusión vascular en tumores. Sin embargo, como se muestra a continuación, las tasas de lavado en heridas son extremadamente rápidas, por lo que NKtrans, TTP, slope y IAUC son difíciles de medir. Por lo tanto, hemos utilizado la pendiente lineal o exponencial de la fase de lavado como medida empírica de la perfusión vascular enheridas 9.

La mayoría de los agentes OAI absorben en el rango de longitudes de onda del infrarrojo cercano (NIR), que pueden penetrar más profundamente en lostejidos 16,17. Sin embargo, la absorción de agua a longitudes de onda superiores a 900 nm limita el rango de longitudes de onda utilizables en vivo de OAI a 700–900 nm para la mayoría de lasaplicaciones 2. El verde de Indocyanina (ICG) es un agente prototípico de la DCE OAI porque ofrece una fuerte absorción de NIR a 780–800 nm, produce una señal de OAI moderadamente fuerte y tiene una biocompatibilidad favorable con la aprobación de la FDA para uso clínico. Estas características permiten contraste intravascular y curvas PK interpretables.

Hemos desarrollado un protocolo combinado OS-DCE OAI para evaluar la oxigenación y la perfusión vascular en modelos preclínicos de tumores sólidos yheridas 8,9. La parte OS de este protocolo puede evaluar la oxigenación en múltiples cortes de imagen que pueden cubrir volúmenes completos del tumor y de la herida en modelos murinos. La parte DCE de nuestro protocolo tiene la opción de obtener imágenes de una sola sección del tumor o herida usando múltiples longitudes de onda láser (mejorando la precisión de la detección de agentes de contraste), o de obtener imágenes de hasta 5 cortes con una sola longitud de onda láser (mejorando la cobertura espacial). Hemos utilizado OS-DCE OAI para monitorizar el cambio en la oxigenación y la perfusión vascular tras tratar un modelo tumoral con radioterapia o con combretastatina A4 fosfato, un agente disruptorvascular 4,8. También hemos utilizado OS-DCE OAI para monitorizar la cicatrizaciónde heridas 9. La DCE OAI otorga a la OAI la capacidad de monitorizar la progresión mediante perfusión vascular que puede aplicarse a diversas enfermedades.

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Protocolo

Realiza todos los procedimientos bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de tu institución. Todos los procedimientos del protocolo a continuación fueron aprobados por la IACUC de nuestra institución.

1. Anestesia (para procedimientos posteriores)

  1. Induce anestesia. Inicialmente inducir y mantener la anestesia con un 5% de isoflurano en gas portador de osígeno al 100% hasta que el ratón deje de estar despierto.
  2. Mantén la anestesia. Continúa anestesiando al ratón con isoflurano al 1,5–2% en gas portador de osígeno al 100%. Verifica la ausencia de reflejo pedal.
  3. Mantén la normotermia. Asegúrate de mantener a los animales en una superficie cálida y controlar la temperatura durante todo el periodo de anestesia.
    NOTA: (Punto de pausa) Proceder a la implantación tumoral o formación de heridas una vez que el animal está completamente anestesiado.

2. Preparación del modelo

NOTA: Todo el trabajo celular debe realizarse en un armario de bioseguridad para evitar exposición y posible contaminación.

  1. Establecer un modelo tumoral ortotópico 4T1 (Figura 1).
    1. Prepara las células sobre hielo: Resuspende las 4T1 en PBS helado a una concentración de 2 × 107 celdas/mL.
    2. Mezcla células con matriz: Combina la suspensión celular 1:1 (v/v) con hidrogel biológico helado que tiene una matriz extracelular rica. La combinación debería dar lugar a una solución de células a 1 × 107 células/mL.
    3. Carga la jeringuilla: Carga la mezcla de células en una jeringuilla de laboratorio estéril con un volumen no superior a 1,0 mL. Limita el volumen a 100 μL por inyección (1 × 106 celdas). Como opción, calienta suavemente la jeringuilla a 30 °C, lo que hace que el hidrogel biológico sea ligeramente viscoso y se retenga más en el punto de inyección.
      PRECAUCIÓN: Ten en cuenta que las jeringuillas son afiladas y evita recubrirlas.
    4. Anestesiar al ratón como se describe en la sección 1.
    5. Elimina el pelo si existe: Despilar la zona del pecho. Omite este paso si usas ratones desnudos atímicos.
    6. Coloca la aguja e inyeta: Esteriliza la cuarta almohadilla grasa mamaria inguinal. Inserta la aguja con el bisel hacia arriba e inyecta lentamente 100 μL en la almohadilla grasa para evitar el reflujo.
    7. Recuperar al animal de la anestesia: Devuelve al ratón a una jaula calentada y vigila al ratón hasta que camine.
    8. Permitir que el tumor crezca: Dejar 8-10 días para que los tumores 4T1 alcancen un diámetro mínimo de 0,3 cm antes de la imagen.
      NOTA: También se pueden visualizar tumores de mayor diámetro. El diámetro del tumor puede medirse con un calibrador vernier calibrado. Los tumores que superen el diámetro máximo aprobado por la IACUC (o un comité institucional equivalente) deben ser sacrificados. Sigue la inyección ortotópica y adapta el número/volumen celular al protocolo de enjerto deseado.
  2. Generación de una herida por escisión en un ratón (Figura 2)
    1. Prepara el campo quirúrgico: Esteriliza el área de trabajo y los instrumentos.
    2. Anestesiar al ratón como se describe en la sección 1.
    3. Eliminar el pelo si está presente: Depilar la región dorsal. Omite este paso si usas ratones desnudos atímicos.
    4. Administrar analgesia: Asegurar al ratón sobre una superficie quirúrgica estéril. Inyectar buprenorfina 0,05–0,1 mg/kg subcutáneamente (SC) en la región dorsal.
    5. Desinfectar la zona de la herida: Desinfectar la piel dorsal con povidona-yodo seguido de etanol al 70%.
    6. Crea una herida de escisión: Utiliza una perforadora de biopsia de 6 mm para delinear el lugar. Extirpe la piel y el panniculus carnoso para formar un defecto de grosor completo.
    7. Coloca la férula de silicona:
      1. Centra una férula de silicona en forma de donut alrededor de la herida. Asegúrese de que el diámetro interior de la fisura sea 2–4 mm mayor que el diámetro de la herida y que el ancho de la férula sea de ~5 mm.
      2. Corta una férula de silicona en forma de donut de una lámina de material de silicona. Utiliza un material transparente para suturas para coser la férula en su sitio. Si es necesario, usa una película adhesiva fina para colocar el anillo.
        NOTA: Los materiales pigmentados para suturas pueden absorber la luz NIR y, por tanto, no deben usarse.
    8. Sutura la férula: Coloca ocho suturas interrumpidas espaciadas uniformemente para asegurar la férula a la piel circundante sin estrangulamiento.
    9. Aplica un apósito oclusivo: Cubre la herida y la férula con un apósito oclusivo para proteger la cama y estandarizar el entorno de la herida.
    10. Recuperar al animal de la anestesia: Devuelve al ratón a una jaula calentada y vigila al ratón hasta que camine.
    11. Permite que el animal sane: Continúa con el cuidado diario y las evaluaciones según el diseño del estudio o hasta que la herida esté completamente curada.
    12. Sustituye el apósito cada día: Sustituye el apósito oclusivo diariamente tras la imagen o la fotografía para limitar la contaminación y mantener la esterilidad.
      NOTA: (Paso crítico) Entablillar la herida para suprimir la contracción y promover la reepitelialización, mejorando la relevancia traslacional para la curación humana. (Punto de pausa) Después de aplicar el apósito para pausarse hasta la próxima evaluación o sesión de imagen programada.

3. Protocolos de adquisición OS-DCE OAI

  1. Prepara un ratón y el agente de contraste para la exploración OAI.
    1. Prepara el agente de contraste.
      1. Prepara una solución de 1,62 mM del agente de contraste ICG en agua estéril. Filtra la solución con un filtro de jeringuilla de 0,3 μm. Llena una jeringuilla de laboratorio estéril con 100 μμL de esta solución.
        NOTA: Esta dosis es de 162 nmol o 125,5 μμg basada en un peso molecular de ICG de 775 g/mol. La dosis es de 6,28 mg/kg de peso corporal de ratón, teniendo en cuenta que un ratón pesa aproximadamente 20 g. Una dosis equivalente animal es 12,3 veces mayor que una dosis equivalente humana18. Por lo tanto, la dosis equivalente humana es de 0,51 mg/kg de peso corporal humano. La dosis máxima tolerada en humanos es de 2 mg/kg 19. Por lo tanto, la dosis utilizada en este estudio preclínico es aproximadamente una cuarta parte de la dosis máxima tolerada en humanos.
    2. Prepara el escáner OAI.
      1. Llena el tanque de imagen con agua destilada y desionizada. Ajusta la temperatura del acuario a 36 °C para un ratón con <25 g de peso corporal.
        NOTA: La temperatura de este acuario mantendrá la temperatura corporal central cerca de 37 °C porque el ratón está envuelto en una bolsa de plástico en la cuna. La temperatura del acuario debe ajustarse a 35 °C para un ratón grande con >25 g de peso corporal para evitar sobrecalentar al ratón, ya que un ratón más grande tiene más tejido adiposo subcutáneo que actúa como capa aislante.
    3. Anestesiar al ratón como se describe en la sección 1. Durante el resto del protocolo de adquisición, asegúrese de que el ratón permanezca anestesiado con un 1,5–2% de isoflurano en un gas portador de osígeno al 100%.
    4. Si realizas DCE OAI, coloca acceso venoso.
      1. Enjuague un catéter de 27 g en la vena caudal con solución fisiológica heparinizada. Inserta el catéter en una vena lateral de la cola y asegura el catéter para evitar que se desinserte de la vena caudal (Figura 3A). Asegúrate de que no haya burbujas de aire presentes.
        NOTA: (Paso crítico) Utiliza solución salina heparinizada para mantener la permeabilidad del catéter.
      2. Además, preparar una jeringuilla de laboratorio estéril con un volumen no superior a 500 μL que pueda conectarse al catéter. Asegúrese de que la jeringuilla contiene 100 μL de 2,14 mM ICG (~322 nmol; ~16 μmol/kg para un ratón de 20 g).
    5. Cubre al ratón y acuna con gel de ecografía (Figura 3B).
      1. Aplica una capa fina de gel transparente para ecografía en la zona del tumor o herida (Figura 3C). Además, aplica gel de ultrasonidos en la cuna para crear un sello entre la cuna y el tumulo o la zona de la herida.
        NOTA: Elimina las burbujas de aire. Como opción, el gel de ultrasonido puede centrifugarse para eliminar el aire antes de utilizarlo. Además, usa una cantidad mínima de gel para ultrasonidos para evitar burbujas que puedan formarse en capas gruesas de gel.
    6. Coloque el ratón en la cuna (Figura 3D): Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento. Coloca el ratón en un soporte con la nariz del ratón firmemente dentro del morro. Usa esposas para sujetar las manos y los pies del ratón. Usa el lazo dental para estabilizar la cabeza.
      1. (OPCIONAL) Usa la cuna con un cono de nariz de rata cuando imagines un ratón. El cono de nariz de rata levanta la cabeza del ratón desde la base de la cuna, lo que puede evitar un ahogamiento accidental si una pequeña cantidad de agua se filtra en la cuna.
    7. Coloca el ratón y la cuna en el instrumento OAI. Consulta las instrucciones del fabricante para el instrumento.
      1. Observa si hay fugas en la cuna del ratón. Si hay fugas, retira el ratón y la cuna del instrumento y vuelve a sellar el ratón en la cuna para evitar ahogamientos accidentales.
      2. Si se desea DCE OAI, conecte el catéter a la jeringuilla con el agente de contraste.
    8. Equilibrar el ratón antes de la imagen: Permitir 10 minutos para estabilizar la fisiología del ratón en el tanque de agua caliente antes de la adquisición de la imagen (Figura 3E).
    9. Coloca el ratón respecto al transductor OAI:
      1. Mueve el ratón o el transductor OAI según las instrucciones del fabricante para que el tumor o la herida quede en el conjunto de imágenes multicorte.
      2. Optimiza la velocidad del sonido para el conjunto de imágenes. Completar este paso mientras el ratón está siendo equilibrado antes de la imagen (paso 3.1.7).
      3. (Paso crítico) Mantener una orientación y posición de corte consistente para todos los ratones y en todos los puntos de tiempo para asegurar resultados rigurosos
  2. Establece los parámetros OAI del sistema operativo.
    1. Selecciona los parámetros de la corte de imagen para que se imajen múltiples cortes que cubran toda la zona del tumor o herida con un grosor de corte de 1 mm.
    2. Selecciona las longitudes de onda de absorción. Para OAI de OS, selecciona longitudes de onda de absorción de 700, 730, 760, 800, 850 y 875 nm.
    3. Emplear promediado de señales: Seleccione parámetros para adquirir 10 promedios por longitud de onda antes de adquirir la siguiente longitud de onda y antes de pasar a la siguiente rebanada de imagen. Las 10 medias por longitud de onda aumentan la relación señal-ruido de cada corte de imagen.
    4. Establece el número de repeticiones:
      1. Establece el número de repeticiones como se muestra en la Tabla 1 para mantener un tiempo total de adquisición de aproximadamente 2 minutos. Para los usuarios de un instrumento con una tasa de repetición de 10 Hz, el tiempo total de adquisición es de 6,0 s por corte de imagen.
      2. Mover el ratón al siguiente corte de imagen y luego volver a la primera posición requiere un promedio de 0,2 s, de modo que cada corte requiere 6,2 s.
      3. Realiza un mínimo de 3 repeticiones para asegurar la estabilidad de la medición. Un tiempo total de adquisición superior a 2 minutos es aceptable si se desean más repeticiones.
  3. Adquiere las imágenes OA del sistema operativo.
  4. Establece los parámetros OAI del DCE.
    1. Establece los parámetros de adquisición de OAI DCE para un protocolo de imagen de una sola rebanada con múltiples longitudes de onda.
      1. Coloca las rebanadas de imagen. Selecciona ≤5 cortes de imagen centrados en el tumor o la zona de la herida con un grosor de corte de 1 mm.
      2. Selecciona la longitud de onda óptima de absorción para el agente de contraste. Para el verde de indocyanina en un entorno in vivo , fija la longitud de onda en 800 nm.
      3. Establezca el número de promedios y repeticiones como se muestra en la Tabla 2. Estas recomendaciones mantendrán una resolución temporal ≤ 5 s y un tiempo total de adquisición de 11,0–11,2 minutos para los usuarios del instrumento OAI, que tiene una tasa de repetición de imagen de 10 Hz.
        NOTA: Los usuarios de otros instrumentos con una tasa de repetición de imagen diferente deben ajustar el número de promedios para mantener una resolución temporal de ≤ 5 segundos para cada conjunto de imágenes.
    2. Como alternativa al paso 3.4.1, establezca los parámetros de adquisición de OAI DCE para un protocolo de imagen multi-corte con una sola longitud de onda.
      1. Coloca las rebanadas de imagen. Selecciona ≤ 5 cortes de imagen centrados en el tumor o la herida con un grosor de corte de 1 mm.
      2. Selecciona la longitud de onda óptima de absorción para el agente de contraste. Para el verde de indocyanina en un entorno in vivo , fija la longitud de onda en 800 nm.
      3. Establezca el número de promedios y repeticiones como se muestra en la Tabla 2. Estas recomendaciones mantendrán una resolución temporal ≤ 5 s y un tiempo total de adquisición de 11,0–11,2 minutos para los usuarios del instrumento OAI, que tiene una tasa de repetición de imagen de 10 Hz.
        NOTA: Los usuarios de otros instrumentos con una tasa de repetición de imagen diferente deben ajustar el número de promedios para mantener una resolución temporal de ≤ 5 s para cada conjunto de imágenes.
  5. Adquiere las imágenes de DCE OA.
    1. Registrar imágenes de referencia: Inicia la adquisición y recoge 12 conjuntos de imágenes (~1 min).
    2. Inyectar el agente de contraste: administrar 100 μL a través del catéter mientras continúan la adquisición.
      NOTA: La inyección en bolo debe ser constante durante aproximadamente 10–15 segundos para evitar una acumulación de presión en el catéter en la frágil vena caudal. Esta consistencia puede controlarse con una presión constante sobre el émbolo de la jeringuilla durante la inyección manual, o mediante un inyector automático. Es importante destacar que tasas de inyección de 10–15 s suavizan la administración inicial del agente al tumor, en lugar de crear picos cinéticos en la primera pasada en la curva PK causados por tiempos de inyección más rápidos, lo que mejora la modelización PK y el análisis de mediciones empíricas.
      1. (Paso crítico) Evita la fuga de agentes de contraste desde el vaso sanguíneo hacia los tejidos circundantes en el lugar de la inyección para preservar una sincronización precisa del bolo.
    3. Continúa con la imagen: Adquiere los 128 juegos de imágenes restantes durante 10,2 minutos después de la inyección para capturar la cinética de lavado y lavado.
    4. Monitoriza el proceso de imagen para asegurarte de que se adquieren las imágenes: Controla la frecuencia respiratoria del ratón para garantizar que la fisiología del ratón esté estable durante los escaneos.
    5. Quita el ratón y la cuna del instrumento: Saca el ratón de la cuna. Permite que el ratón se recupere de la anestesia. Vuelve al ratón a una jaula calentada y vigila al ratón hasta que esté en camino.
      NOTA: Utiliza el software adecuado y consulta las instrucciones del fabricante para el instrumento OAI. Los pasos siguientes describen los pasos de reconstrucción y análisis para un instrumento OAI que utiliza el software viewMSOT v4.0, y Matlab R2019b o una versión más reciente del software Matlab.

4. Análisis de resultados OS-DCE OAI

  1. Reconstruye las imágenes OA.
    1. Seleccionar parámetros de reconstrucción de imagen: Configurar la reconstrucción de imagen para usar un método de retroproyección filtrado con un filtro pasa banda de 50 kHz–6,5 MHz y habilitar la corrección automática de energía pulso a pulso.
    2. Reconstruir todas las imágenes: Obtener imágenes en todas las longitudes de onda láser, todas las posiciones de cortes de imagen y todos los puntos temporales. Este volumen de datos puede requerir un tiempo considerable para la reconstrucción de la imagen.
  2. Analizar imágenes de OA del sistema operativo.
    1. Desmezclar cromóforos: Realizar desmezclas espectrales para generar mapas paramétricos de oxihemoglobina (HbO 2), desoxihemoglobina (Hb), hemoglobina total (donde HbT = HbO2 + Hb) y %sO 2 (donde %sO 2 = HbO2/HbT).
    2. Define ROIs:
      1. Dibuja manualmente un ROI que represente el tumor o la herida en cada corte de imagen. Dibuja un ROI conservador que se incline por excluir píxeles de la periferia tumoral o de la herida en lugar de incluir píxeles para el tejido normal en la periferia.
      2. Como alternativa, se extrae manualmente un ROI que represente el borde tumoral y un segundo ROI que represente el núcleo tumoral. El borde tumoral puede tener una mayor vascularización que el núcleo tumoral, lo que proporciona un análisis potencialmente útil de subregión.
        NOTA: Aunque se pueden extraer ROI adicionales de subregiones tumorales o heridas, o evaluar los valores píxeles deHbO 2, Hb, HbT o %sO 2 (sin requerir ROI), estas regiones más pequeñas tienen menor relación señal-ruido, lo que conduce a mediciones imprecisas.
      3. Mantener las posiciones del ROI consistentes en todas las imágenes en cada longitud de onda y punto temporal.
    3. Calcula los parámetros medios para todo el tumor.
      1. Calcula el valor medio deHbO 2, Hb, HbT y %sO 2 en el ROI tumoral o ROI de la herida para cada corte de imagen y cada punto temporal.
      2. Para la OAI de OS multi-cortes, calcular el valor medio deHbO 2, Hb, HbT y %sO 2 de todos los cortes de imagen para obtener un valor medio único para cada parámetro en todo el tumor o herida.
    4. Evalúa la estabilidad de los parámetros. Grafica el valor de %sO 2 para cada repetición (véase el paso 3.2.4). Evalúa si el valor de %sO2 cambió más de un 10% durante los escaneos, lo que indica una medición temporalmente inestable.
  3. Analiza imágenes DCE OA.
    1. Desmezclar cromóforos en imágenes DCE OA de múltiples longitudes de onda: Realizar desmezclas espectrales para generar mapas paramétricos deHbO 2, Hb y el agente de contraste. Este paso no es necesario para el OAI DCE de longitud de onda única.
    2. Define el retorno de inversión.
      1. Dibuja manualmente un ROI que represente el tumor o la herida en cada corte de imagen. Dibuja un ROI conservador que se incline por excluir píxeles de la periferia tumoral o de la herida en lugar de incluir píxeles para el tejido normal en la periferia.
      2. Como alternativa, se extrae manualmente un ROI que represente el borde tumoral y un segundo ROI que represente el núcleo tumoral. El borde tumoral puede tener una mayor vascularización que el núcleo tumoral, lo que proporciona un análisis potencialmente útil de subregión.
        NOTA: Aunque se pueden extraer inversores adicionales de subregiones tumorales o evaluar los valores píxeles por píxeles del agente de contraste (sin requerir retorno de inversión), estas regiones más pequeñas tienen menor relación señal-ruido, lo que conduce a mediciones imprecisas.
      3. Mantener las posiciones del ROI consistentes en todas las imágenes en cada longitud de onda y punto temporal.
    3. Extraer curvas PK de imágenes DCE OA.
      1. Para el ROI en cada segmento de imagen, exporta los puntos de tiempo frente a la señal media ICG (de DCE OAI multilongitud de onda) o la señal OAI en la longitud de onda seleccionada (para DCE OAI de longitud de onda única).
      2. Calcula la señal media para todas las rebanadas de imagen. Un gráfico de la señal media a lo largo del tumor o herida en función del tiempo se conoce como curva PK.
      3. Transfiere la señal media de todas las cortes de imagen en cada momento a un programa informático que pueda evaluar los parámetros empíricos que se enumeran a continuación. Por ejemplo, Microsoft Excel y Graphpad Prism pueden realizar análisis sencillos de grafos.
    4. Calcular parámetros empíricos tal como se describen en los pasos 4.3.5–4.3.11.
    5. Normalizar la curva PK: Determinar el valor medio de los puntos de tiempo previos a la inyección, conocidos como señal base. Resta el valor base de la señal de todos los valores de señal post-inyección.
    6. Determinar la Mejora Máxima de Señal (MSE): Identificar el valor de señal post-inyección más alto en la curva PK.
    7. Determinar el tiempo hasta el pico (TTP): Identificar el valor en punto de tiempo del MSE.
    8. Calcula la pendiente inicial de la curva PK.
      1. Obtén esta pendiente inicial desde el momento de la inyección inicial hasta la TTP. Alternativamente, calcula la pendiente 1 minuto después de la inyección si la forma de la curva es demasiado pronunciada o si el TTP llega demasiado tarde.
      2. En este escenario, adquiere las imágenes de preinyección durante 1 minuto y calcula esta pendiente del minuto 1.0 al minuto 2.0 en la curva PK.
    9. Calcular el área inicial bajo la curva (IAUC): Calcular el valor medio de los valores de la señal desde el momento de la inyección inicial hasta la TTP en la curva PK.
    10. Calcula una tasa empírica de la fase de lavado.
      1. Para la porción de la curva PK desde 1 minuto después de la TTP hasta el último punto temporal, ajusta esta porción de la curva con una línea recta o una función de decaencia monoexponencial con un término de desplazamiento constante.
      2. Utiliza la pendiente de la línea recta o la constante de decaimiento exponencial como medida empírica de la tasa PK de la fase de lavado.
    11. Calcula OAI con contraste mejorado.
      1. Selecciona un punto de tiempo más largo que TTP. Determina el valor de la señal en este punto de tiempo como medida de mejora del contraste.
        NOTA: A menudo se selecciona el momento de 10 minutos tras la inyección, pero también se pueden seleccionar otros momentos según sea necesario.
      2. Como alternativa, calcula la señal media desde TTP hasta el punto temporal seleccionado, la señal media desde TTP hasta el último punto, o otro rango de puntos temporales según sea necesario.
      3. Cabe señalar que la señal media es equivalente al área bajo la curva PK para estos dos puntos temporales, lo que técnicamente se conoce como una medida de la intensidad de la señal más que como una medida de amplitud de señal.
    12. Realizar el modelado PK tal y como se describe en los pasos 4.3.13–4.3.20.
      NOTA: Los siguientes pasos analizan las imágenes DCE OA adquiridas con un instrumento OAI inVision. Otros instrumentos OAI pueden producir imágenes en un formato de datos diferente. Los pasos siguientes aún pueden seguirse para analizar imágenes DCE OA usando otros instrumentos OAI si el formato de datos de los otros instrumentos puede transferirse a MatLab y el formato de datos se ajusta para coincidir con los archivos de ejemplo proporcionados con el paquete de software.
    13. Descarga el software.
      1. Para DCE OAI multilongitud de onda, descarga OE-DCE_MSOT_Matlab desde el repositorio CAMEL-MartyPagel en Github, o https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab.
      2. Para DCE OAI de longitud de onda única, descarga DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab desde el repositorio CAMEL-MartyPagel en Github, o https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab.
      3. Descomprime el archivo comprimido. Abre el archivo SOP en la carpeta doc y sigue el procedimiento estándar para instalar y usar el software.
    14. Organiza los componentes de software en diferentes carpetas. Almacenar los siguientes archivos de software en una sola carpeta:
      Código principal: run_MSOT_nonneg.m
      Subcódigos: run_DCE_MSOT_MSP.m ; run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      Otros códigos: Negative_pixel_count.m ; Voxel_count.m; ROI_modification.m
      Carpeta titulada: com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      Datos exportados desde ViewMSOT tras la reconstrucción y la desmezcla espectral.
    15. Lanza el programa en MatLab.
      1. Haz doble clic en run_MSOT_nonneg.m para iniciar el programa en Matlab. Haz clic en el botón "Correr" en la parte superior de la ventana de Matlab. El código puede informar de un error que run_OE_MSOT_AK_nonneg no se encuentra en la carpeta actual ni en la ruta MATLAB.
      2. Para solucionar este error, escribe addpath y luego pon la ubicación del archivo entre comillas (por ejemplo, addpath 'C:\Users\yourname\Documents\Non negative analysis') antes de ejecutar el código.
    16. Seleccione el tipo de análisis: Introduzca N para el análisis OE y Y para el análisis DCE.
      NOTA: El programa es capaz de analizar imágenes de OA Mejorado por Oxígeno (OE), que consisten en una combinación de mapas %sO 2 adquiridos con gas respiratorio 21%O2 (aire de grado médico) o gas respirable 100%O2 , que no se utiliza para los estudios OS-DCE OAI descritos en este protocolo.
    17. Selecciona los datos:
      1. Selecciona la carpeta que contiene los archivos OAI de DCE. Selecciona la carpeta principal de escaneo y no la subcarpeta MSP.
      2. Luego verifica el nombre del escaneo. Por último, selecciona la carpeta para guardar los datos analizados.
    18. Introduce 3 para el número de cromóforos. Los cromóforos son Hb,HbO 2 y el agente de contraste.
      NOTA: El programa está diseñado para acomodar el análisis OAI DCE de múltiples cromóforos que se coinyectan en el modelo del ratón, si es necesario. Sin embargo, el protocolo DCE OAI en este protocolo solo utiliza un cromóforo.
    19. Extrae los ROIs tal y como se describe en los pasos 4.3.19.1–4.3.19.4.
      1. Dibuja el ROI del vaso sanguíneo que servirá como Función de Entrada Arterial para el análisis: aparecerá una imagen en escala de grises de la exploración. Rastrea manualmente el ROI que representa el vaso sanguíneo.
        NOTA: Haz zoom haciendo clic en la lupa con el signo de más justo encima de la esquina superior derecha de la imagen. Haz clic de nuevo en la lupa para volver al modo de dibujar el ROI. La vena cava inferior cerca de la columna vertebral puede identificarse y usarse a menudo como la AIF.
      2. Calcula el ROI del tumor: aparecerá una imagen en escala de grises de la exploración. Rastrea el ROI que representa todo el tumor, el borde tumoral o el núcleo tumoral. Para analizar más de un ROI, repite todo este procedimiento de modelado PK (Paso 4.3.12) para obtener un ROI adicional.
      3. Calcula el ROI de una región muscular: No uses este ROI en el cálculo de la DCE OAI. Utilice el ROI del músculo para el análisis de OAI DCE utilizando el Modelo de Región de Referencia Lineal, que no se utiliza en este informe. Este paso debe realizarse para que el programa continúe.
      4. Verifica que se haya obtenido el retorno correcto. Comenzará la modelización de la curva PK.
    20. Visualiza los resultados analizados del DCE OAI.
      1. Para cargar los datos analizados de DCE, ve a la barra del navegador y selecciona DCE_MSOT_MSP.
      2. En la ventana de comandos, introduce borrar todo.
        NOTA: La pestaña actual de carpetas está ahora poblada con datos analizados de DCE OAI, que incluyen:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat: Haz doble clic aquí para ver los valores tabulados de NKtrans y kep para el ROI del tumor. Los parámetros cinéticos se tabulan de 3 maneras:
        Trans NK_avg: Promedio dela trans NK calculada para cada píxel.
        _avg_signal trans NK: Valortrans NK único calculado tras promediar las señales de todo el tumor
        NKtrans _nz: NK trans_avg calculado solo con valores de píxel distintos de cero.
        De manera similar, se pueden mostrar k valoresde ep .
        NKtrans.fig: Muestra el mapa de _avgtrans NK superpuesto sobre una imagen en escala de grises.
        kep.fig: Muestra el kep _avg mapa superpuesto sobre una imagen en escala de grises.
        Maps_Wavelength_ICG.mat: Esto necesita cargarse para visualizar otros mapasde trans o kep . Después de cargar esta matriz, utiliza el "código de solapamiento" (incluido por separado) para mostrar el parámetro deseado.
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat y Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat: Parámetros de visualización de los ROI musculares.
        Señal normalizada para ICG. Fig: Denota la señal media de ICG a lo largo del tiempo en los tres ROIs, normalizada a la señal máxima.
        Señal para ICG.fig: Denota la señal media de ICG a lo largo del tiempo en los tres retornos de inversión.

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Resultados

La señal OAI puede generar mapas de saturación de oxígeno en tumores y heridas
Tras la adquisición y reconstrucción de conjuntos de datos multiespectrales de OAI, se pueden definir regiones de interés (ROI) dentro de tumores o lechos de heridas para cuantificar la intensidad de la señal en diferentes longitudes de onda. A continuación, se aplican algoritmos de desmezcla espectral para separar las contribuciones de oxihemoglobina (HbO 2) y desoxihemoglobina ...

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Discusión

Las curvas PK de OAI de la DCE pueden verse afectadas por una variedad de artefactos que reducen la fiabilidad del análisis PK. Un obstáculo común es la presencia de heridas superficiales, costras o sangre seca en el campo de imagen, que pueden introducir una absorción fuerte y no específica en la superficie de la piel y ocultar señales más profundas (Figura 8). Al extraer los ROI dentro del tumor, se debe tener cuidado de evitar incluir estas estructuras su...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés respecto a esta obra.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Neal Burton de iThera Medical, GmbH por su consulta. Este trabajo fue financiado por la subvención NRSA de la UW-Madison Radiology (2T32CA009206-46), la beca piloto ITPT Radiological Sciences Trainee, el programa Clinical and Translational Science Award (CTSA), la subvención del National Center for Advancing Technologies Translational Sciences (NCATS), UL1TR002373 y TL1TR002375, NIH R43 CA265603, NIH R01 EB034261, NIH R21 EB037731 y un Falk Catalyst Award del Falk Medical Research Trust.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de 20 gExel INT26417Aguja hipodérmica; 20G x 1", usado para preparar soluciones de heparina
Células 4T1ATCCCRL-2539Línea celular de cáncer de mama triple negativa
Anti-Anti (100x)Gibco15240-062Cóctel de antibióticos
Punzón para biopsiaIntegra 33-36punzón de biopsia desechable de 6 mm  
Agua de calidad para cultivo celularCorning25-055-CV500 mL; analizado con USP estéril sater para especificaciones de inección y nbsp;
Solución de matriz de colágenoCorning354262Matriz de colágeno para la formación e inyección tumoral
EtanolLaboratorio Deacon2701Antiséptico de uso general
Lubricante para los ojos Optixcare 50-218-844220 g/0,70 oz; solo para uso animal 
Gasa y gasas;Fisherbrand22-415-468Algodón de gasas; 3" x 3" (7,6 x 7,6 cm); 12 capas
GuantesVWR76457-130Guantes de examen de nitrilo
HeparinaMeithealNDC71288-402-1010.000 unidades USP por 10 mL, 1.000 unidades USP por mL; Vial multidosis de 10 mL
Verde de IndocianinaTCII0535Agente de contraste optoacústico
IsofluranoIsospire17033-091-25Un anestésico inhalable no inflamable y no explosivo para su uso en caballos y perros; 250 mL 
Película de laboratorioParafilm PM-9922" x 250'; Núcleo de 1" de diámetro
Depilador de dorada corporal Nair NairLL4038Crema Purificatoria; Manteca de cacao rica y vitamina E
Aguja TerumoNN2732R27G x 1 1/4" (6,40 mm x 32 mm); R.W. Reg. Bevel 
Máquina de Imagen OptoacústicaiTheraMedical MSOT en Visión 512Escáner optoacústico
PBS, 1xCorning 21-040-CV500 mL; Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio  
RPMICorning 10-040-CVMedios de cultivo celular
Solución salinaHospiraNDC0409-4888-0210 mL de dosis única; Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, USP
CronòmetroiTheraMedical 4135333Se usaba para registrar minutos y segundos y nbsp;
JeringuillasCardinal Health11881280121 mL de jeringuilla de insulina; U-100 solo insulina; 27G x 1/2" (0,35 x 12,7 mm)
Vendaje transparente para heridasTegaderm1624Westilo de fotograma de película transparente; 2 3/8" x 2 3/4" (6 cm x 7 cm)
PinzasTermo Electron 7626Se usa para tirar la piel hacia atrás al inyectar células en ratones
Gel de ultrasonidosEcoVue28332 g de sobre, libre de prpylenoglicol, soluble en agua, parabeno ni colorante
Suturas sin teñirEthiconVR493corte de 18"; P-3 3/8 13 mm; sin teñir ni trenzar, sutura absorbible sintética, no USP
Almohadilla térmicaRepti Therm UTH120VAC 60Hz 8W Acostumbraba a calentar animales bajo anestesia;  
FérulasGrace Bio-Labs476684Silicona transparente, 14 mm de diámetro exterior x 10 mm diámetro interior de 0,5 de grosor con puntos de sutura y nbsp;
Clips de heridaReflex 7203-1000Sistema de cierre de piel reflex, 7 mm, acero inoxidable

Referencias

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