Transducción lentiviral dual para generar células madre neuronales mutantes para investigación del glioma

Resumen

Este protocolo describe la generación de células madre neurales murinas mutantes (NSCs) para la investigación del glioma mediante transducciones lentivirales secuenciales. Las mutaciones oncogénicas se introducen primero en los CSN, seguidas por un lentivirus biistrónico que contiene genes reporteros. Tras la selección dual de antibióticos, los CSN mutantes permiten la obtención de imágenes en tiempo real del crecimiento tumoral y la respuesta al tratamiento.

Resumen

Los gliomas son los tumores cerebrales primarios más prevalentes en adultos, y la modelización murina sugiere que pueden surgir de mutaciones oncogénicas en los CSN o en progenitores diferenciadores tempranos. Por tanto, los modelos de trasplante ortotópico derivados de CSN mutantes tienen el potencial de aportar información preclínica valiosa sobre la patogénesis del glioma, los resultados y la respuesta al tratamiento. Estos modelos requieren la introducción de una mutación oncogénica en los CSN, preferencialmente acoplada a reporteros para ayudar en la determinación de la eficiencia de la transfección/transducción y para monitorizar el crecimiento tumoral in vivo. Este protocolo describe una metodología dual basada en la transducción para generar CSN mutantes adecuados para el monitoreo in vivo de tumores. En esta técnica, los CSN aislados se transducen primero con lentivirus que contienen un gen de interés (mutación oncogénica o control de la proteína fluorescente verde [GFP]) además de un elemento de resistencia a la blasticidina. Tras la selección de blasticidina, las células son transducidas secundariamente con un vector lentiviral biistrónico que expresa luciferasa y proteína fluorescente roja (RFP), así como un elemento de resistencia a la puromicina. Tras la selección de puromicina, las células pueden expandirse para ensayos de proliferación, trasplante ortotópico u otras aplicaciones posteriores. Este enfoque de doble transducción permite estimar la eficiencia de la transducción en ambas fases de infección, así como monitorizar in vivo el establecimiento, crecimiento y respuesta al tratamiento tumoral mediante imagen bioluminiscente no invasiva (BLI). Este sistema representa una herramienta útil para la investigación del glioma, fusionando la relevancia biológica de la modelización tumoral derivada de células madre neurales adultas con el beneficio práctico de la capacidad de imagen en tiempo real, mejorando en última instancia la comprensión de la biología del glioma y el avance de nuevos enfoques terapéuticos.

Introducción

Los gliomas son la forma más prevalente de tumores cerebrales primarios que afectan a adultos, constituyendo aproximadamente el 80% de todas las neoplasias cerebrales malignas en esta^{población 1}. La mayoría de estos son gliomas^{de alto grado 2}, que suelen ser muy invasivos y presentan un pronóstico negativo ^3,4 a pesar de los avances significativos en técnicas neuroquirúrgicas, radioterapia y enfoques quimioterapéuticos⁵. La alta tasa de mortalidad en los pacientes afectados por estos tumores pone de manifiesto la necesidad de investigar continuamente la formación y progresión del glioma.

La gliomagénesis en el sistema nervioso central puede desencadenarse introduciendo mutaciones oncogénicas en los^CSN 6,7,8,9 o en su prole diferenciadora ^temprana 10,11,12 en estudios de modelado murino. Cabe destacar que estos estudios han demostrado que las mismas mutaciones oncogénicas a menudo no producen tumores cuando se introducen en células más^{diferenciadas 13}, estableciendo una jerarquía celular de origen donde el aumento de la restricción de linaje se correlaciona con una menor susceptibilidad a la transformación¹⁴. Por ello, los CSN genéticamente modificados se utilizan comúnmente para generar modelos de glioma biológicamente relevantes y versátiles, utilizando técnicas transgénicas o métodos ortotópicos^{de trasplante 15}. Ambos enfoques permiten estudiar la formación de tumores de novo en el entorno cerebral nativo a partir de una célula no transformada. Modelos genéticamente modificados permiten este estudio en animales con un sistema inmunitario intacto, a menudo imitando mejor la histología y heterogeneidad celular observadas en tumores^{humanos 16}. Sin embargo, generar estos modelos requiere mucho trabajo y coste, y con frecuencia presentan tiempos de latencia largos y bajas frecuencias de formación^{tumoral 16}. En cambio, los modelos ortotópicos de NSC son más fácilmente manipulables y rentables. Los CSN mutantes pueden generarse a partir de células primarias o inmortalizadas de ratones o humanos, basándose en necesidades experimentales, y también son adecuados para experimentación in vitro. ^16,17. Además, estos modelos ofrecen la capacidad de ajustar con precisión la etapa de desarrollo tanto de los NSC como de los ratones receptores, así como la localización espacial de la que se derivan los NSC y a la que se introducen. Esto permite a los investigadores investigar cómo la edad y regiones cerebrales específicas influyen en la tumorogénesis impulsada por mutaciones^{particulares 17}.

Este protocolo describe la metodología para generar NSCs mutantes murinos a partir de cultivos primarios, que son adecuados tanto para aplicaciones experimentales in vitro como in vivo (Figura 1). El protocolo consta de dos fases de transducción distintas que ocurren en una secuencia temporal específica. En la fase inicial de transducción, los NSC murinos aislados se infectan con lentivirus recombinantes que portan el constructo genético objetivo, ya sea una mutación oncogénica o un control de proteína fluorescente verde (GFP), junto con un casete de resistencia a la blasticidina. A continuación, se aplica presión de selección antibiótica utilizando blasticidina, permitiendo que solo las células transducidas supervivientes pasen a un evento de transducción secundario. Este evento secundario emplea una construcción lentiviral biistrónica que codifica tanto los genes reporteros luciferasa luciferasa como la proteína fluorescente roja (RFP), acoplados con elementos de resistencia a la puromicina para su selección posterior. Tras la selección con puromicina, las poblaciones de NSC dualmente transducidas resultantes se expanden in vitro antes de realizar experimentos posteriores. Este enfoque de transducción secuencial ofrece varias ventajas metodológicas: (1) facilita una evaluación cuantitativa de la eficiencia de la transducción en cada^{paso 18}, (2) establece líneas celulares reporteras estables adecuadas para el seguimiento longitudinal, y (3) permite el monitoreo no invasivo de la iniciación tumoral, la cinética de progresión y las respuestas terapéuticas mediante metodologías^{BLI 18,19,20}. También puede utilizarse con los NSC primarios o^{inmortalizados 21, 22 y 23}.

El protocolo presentado aquí aborda la urgente necesidad de un enfoque estandarizado, eficiente y biológicamente relevante para generar modelos de glioma derivados de NSC a partir de animales adultos con capacidades de imagen integradas. Se prevé que los modelos resultantes aporten conocimientos clínicamente relevantes sobre la patogénesis del glioma, faciliten la identificación de nuevos objetivos terapéuticos y presenten bases sólidas para la evaluación preclínica de estrategias de tratamiento emergentes.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los estándares éticos y las directrices regulatorias establecidas por la Universidad de Washington en St. Louis. Para este protocolo, la corteza de ratones adultos fue microdisecada según la técnica²⁴ descrita previamente por el laboratorio Brossier y utilizada para aislar los NSC murinos primarios para su posterior expansión en cultivos no adherentes según el protocolo^{establecido 24,25,26}. Todos los reactivos utilizados en cultivo se suministran en formato estéril o pasan por un filtro de membrana de 0,2 μM para asegurar la esterilidad. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de células madre neuronales a partir de tejido microdisecado

1. Preparar medios de disociación (DM) y medio digestivo de tripsina (TDM), según las recetas mostradas en la Figura 2.
   1. Añade 200 μL de medio de digestión de tripsina en tubos microcentrífugas de 1,5 mL y déjalos en hielo al menos 20 minutos antes de usarlos. La DM puede dejarse a temperatura ambiente para los pasos posteriores del protocolo.
   2. Mientras los tubos están preenfriados, preparar el Medio Neural de Células Madre (NSC; receta mostrada en la Figura 2) base y colocar el NSC y el Suero Bovino Fetal (FBS) a 37 °C en un baño de agua o de perlas para precalentar. Coloca alicuotas de suplementos (B27, N2) y factores de crecimiento (EGF, FGF) en un cubo de hielo para que se descongelen lentamente.
      NOTA: El TDM debe prepararse fresco cada vez antes de su uso, aunque el NSC y el DM pueden almacenarse a 4 °C entre usos; las recetas se muestran en la Figura 2. Los stocks de N2, B27, EGF y FGF deben ser alicotizados y almacenados a -20 °C hasta su uso; evitar repetidos congelamientos y descongelaciones de los stocks reconstituidos (véase la Tabla de Materiales para más detalles sobre la preparación de los stocks de EGF y FGF).
2. Después de que los tubos microcentrífugas que contienen TDM estén suficientemente refrigerados, se microdiseca el tejido como se describió^{anteriormente 24}. Después de cada microdisección, coloque el tejido en un tubo microcentrífuga. Devuelve el tubo al hielo hasta que se completen todas las disecciones, ya que cualquier calentamiento del tejido puede iniciar el proceso digestivo enzimático antes de tiempo y provocar una sobredigestión.
3. Incuba el/los tubo(s) de la microcentrífuga a 37 °C en un baño de agua o de perlas durante 15 minutos para iniciar la digestión enzimática. Durante la incubación, prepara un 10% de FBS en el NSC añadiendo 0,5 mL FBS a 4,5 mL de NSC.
   1. Tras la incubación, se pipeten suavemente 5–10 veces con una micropipeta de 1 mL para disociar aún más las células, y luego neutraliza la tripsina añadiendo 200 μL de 10% de FBS en NSC a cada muestra. Pipetea suavemente para mezclar.
      NOTA: Es fundamental seguir el tiempo recomendado de incubación a 37 °C. La sobre-tripsinización puede conducir a la muerte celular, mientras que la subtripsinización puede dificultar la disociación de la muestra (véase la Tabla 1, Puntos 1–2 para este y otros consejos de solución de problemas).
      NOTA: Se puede utilizar un baño maria o un baño de cuentas para incubar muestras; esta última puede reducir el riesgo de contaminación²⁷, pero esto puede conllevar el riesgo de una transferencia de calor^{menos eficiente 28}.
4. Centrifuga las celdas primarias aisladas a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar las células en el fondo del pozo. Lava las células añadiendo 2,5 mL de DM al pellet celular y vuelve a suspenderlas pipeteando suavemente arriba y abajo 3–4 veces. Centrifuga de nuevo a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C y aspira cuidadosamente el sobrenadante.
5. Repite el paso 1.3 para realizar un segundo lavado. Durante el lavado final, añade B27, N2, FGF y EGF a un medio base NSC precalentado para crear un medio NSC completo (receta mostrada en la Figura 2).
6. Aspira el sobrenadante. Añade 2 mL de medio NSC completo y tibio a cada pellet celular, luego vuelve a suspender pipeteando suavemente arriba y abajo 3–4 veces. Colocar las células resuspendidas en un pozo de una placa de 6 pozos y baja unión e incubar a 37 °C.
   NOTA: Aunque el medio base de NSC puede almacenarse a 4 °C entre usos, suplementos y factores de crecimiento pueden degradarse a esta temperatura. Por tanto, se deben añadir B27, N2, FGF y EGF al medio NSC para crear un medio NSC completo inmediatamente antes de su uso.

2. Establecimiento y expansión de la cultura de la neurosfera

1. Administrar de 0,5 a 1 mL de medio fresco de alimentación de NSC (receta mostrada en la Figura 2) a cada pozo de los cultivos de NSC cada 3 días.
2. Monitoriza la formación de la neurosfera. Cuando se ven pequeñas esferas completamente formadas, el cultivo está listo para el paso (normalmente entre 5 y 10 días desde el chapado inicial).
   NOTA: Las células crecen mejor cuando se transmiten con frecuencia y aún en la fase logarítmica. Las neurosferas más grandes son más difíciles de disociar y más propensas a la muerte celular durante este proceso. Por ello, se recomienda un paso más temprano y frecuente para promover la salud celular. Cuando estén listos para el paso, las neurosferas aisladas tendrán un diámetro de ~100–200 μm, con células compactas y bordes lisos y bien definidos bajo microscopía de campo claro. Las neurosferas no mostrarán proyecciones irregulares ni extensiones. El centro de las neurosferas será ligeramente más oscuro que los bordes exteriores, pero no en exceso; núcleos excesivamente oscuros suelen resultar de necrosis de células centrales debido a la privación de nutrientes cuando las neurosferas han sido sobredimensionadas. El paso de neurosferas sobredimensionadas suele provocar altos niveles de muerte celular, lo que puede afectar a las aplicaciones posteriores. Consulta la Tabla 1, Puntos 3–4 para este y otros consejos de solución de problemas.
3. Precalenta el medio NSC, DM, 0,05% de tripsina-EDTA y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C usando un baño de agua o de perlas. Coloca las existencias de B27, N2, FGF, EGF y FBS en hielo hasta que sea necesario.
4. Para el paso, transfiere neurosferas bien desarrolladas a un tubo cónico estéril de 15 mL utilizando una pipeta serológica. Centrifugar a 630 × g durante 1 minuto a 4 °C para calmar las neurosferas. Aspira sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar las neurosferas en pellets. Lava las células resuspendiéndolas en 1x PBS estéril, luego centrifuga de nuevo a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C y aspira el sobrenadante.
5. Añade 1 mL de tripsina/EDTA al 0,05% al pellet celular. Pipetear arriba y abajo 3–5 veces con una micropipeta de 1 mL para mezclar, y luego incubar a 37 °C en un baño de agua o de perlas durante 5–6 minutos.
   1. Tras la incubación, pipetea suavemente arriba y abajo 5–10 veces con una micropipeta de 1 mL para romper las neurosferas. Neutralizar la tripsina añadiendo 1 mL de 10% de FBS en un medio NSC; Haz una pipeta suave para mezclar.
      NOTA: Evitar la sobretripsinización y/o la pipeteación excesivamente vigorosa de las neurosferas, ya que puede dañar los CSN y afectar la viabilidad celular.
6. Añade 2,5 mL de DM y centrifuga a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante. Repite el paso de lavado con otros 2,5 mL de DM, seguido de centrifugación y aspiración de sobrenadante, para eliminar restos de FBS en el medio.
7. Resuspender las células en 1 mL de medio NSC completo y fresco. Suspende la celda de filtro colocando un filtro estéril de 40 μm en un tubo microcentrífuga de 50 mL, luego añadiendo la solución de la celda en la parte superior del filtro y permitiendo que la gravedad drene la solución hacia el tubo. Cualquier célula no disociada restante será capturada por el filtro, mientras que las células individuales pasarán a la solución inferior.
8. De las células resuspendidas y filtradas, toma 10 μL para contar células y mézclalas con azul de tripán de 10 μL. Utilizando un hemocitómetro manual, carga 10 μL de la muestra y cuenta las células viables (es decir, las que no son azules) según la práctica^{estándar 29}. Alternativamente, puede utilizarse un contador de celdas automatizado, aunque puede ser menos preciso en presencia de residuos celulares o agregados^30,31.
   NOTA: Generalmente, menos del 10%–15% del total de células debería mostrar signos de muerte celular (por ejemplo, no poder excluir el azul de tripán). Tasas más altas de muerte celular pueden deberse a la sobretripsinización, a una fuerza mecánica excesiva en la separación de las células o a un mal estado general del cultivo antes de la tripsinización ( véase Tabla 1, Puntos 1–3). Como esto puede afectar negativamente a las aplicaciones posteriores, se recomienda que las células se vuelvan a re-deponer (Paso 2.9) y se expandan de nuevo (por ejemplo, repetir los Pasos 2.1–2.9) si se observan altas tasas de muerte celular en lugar de proceder a la transducción.
9. Diluir 5 x 10^{5 células} en 2 mL de medio NSC fresco completo y placar en un solo pozo de una placa de 6 pozos de unión ultrabaja. Administrar entre 0,5 y 1 mL de alimentación fresca de NSC a cada pozo cada tres días para garantizar una salud óptima del cultivo. Cuando se pueden ver esferas completamente formadas y sanas (véase Tabla 1, Punto número 4), la cultura está lista para su uso en el Paso 3 o 4.
   NOTA: En este punto se pueden almacenar CSN adicionales resuspendiendo un millón de CSN en 1 mL de medio congelante de celdas sin suero en un criovial de 1,5 mL y almacenándolos a -80 °C. Los CSN también pueden ampliarse aún más si es necesario mediante el placado de celdas adicionales en pozos adicionales de la placa de 6 pozos o el rechapado en matrazas T-25.

3. Curva de muerte de blasticidina en células parentales

NOTA: Una vez que los NSC pasados forman neurosferas sanas, las células están listas para experimentos posteriores. Antes de la transducción, es fundamental determinar la concentración óptima del antibiótico de selección (blasticidina, en este caso). Esto debe realizarse empíricamente, ya que diferentes poblaciones de CSN pueden tener distintas susceptibilidades al antibiótico. Si esto ya se ha determinado para el tipo de célula dado, salta al paso 4.

1. Precalenta el medio base del NSC, DM, 0,05% de tripsina-EDTA y PBS a 37 °C. Descongelan las existencias de B27, N2, FGF, EGF, FBS y blasticidina. Antes de iniciar, o durante los pasos de incubación a continuación, prepara un medio de NSC fresco completo y un 10% de FBS en medio NSC como se ha descrito anteriormente.
2. Utilizando neurosferas recién expandidas (tras el cultivo del Paso 2.9 anterior), tripsinizar y posteriormente separarse según los pasos 2,5–2,6, para luego volver a suspender 1 mL de NSC fresco para el contar. Filtrar las células mediante un filtro estéril de 40 μm como se ha descrito anteriormente para eliminar las células no disociadas, y luego contar las células como se describe en el Paso 2.8.
3. Resuspender 25.000 células viables en 2,5 mL aalícuotas de CSN completo fresco en cónicas de 15 mL, preparando 1 alicota por concentración de antibiótico a analizar. Planea probar al menos entre 4 y 6 concentraciones diferentes, aunque se pueden probar más si se desea.
4. Añadir la cantidad adecuada de blasticidina a cada alícuota de 2,5 mL para lograr la concentración final deseada (véanse los cálculos de muestra en la Tabla 2). Placa de 500 μL de celdas suspendidas (5.000 celdas) por pozo en una placa de unión ultra-baja de 24 pozos, con cada concentración repartida en cuadruplicat.
   NOTA: Para lograr la concentración final correcta, puede ser necesario diluir el fondo de blasticidina antes de añadirlo al medio. La blasticidina puede diluirse en medio NSC o PBS; para un fondo diluido a 1:1000 (10 mg/mL), añadir 1 mL de fondo de blasticidina sin diluir (10 mg/mL) a 999 mL de NSC o PBS. Se recomienda que los investigadores realicen todos los cálculos necesarios para alcanzar las concentraciones deseadas mientras los materiales se están calentando en el Paso 3.1; Cálculos de muestra mostrados en la Tabla 2.
5. Incubar las células a 37 °C. Revisa cuidadosamente las células con microscopía de campo claro cada 24 horas para detectar cambios en la morfología y la muerte celular/neurosfera. Alimentar las células cada 3 días añadiendo entre 0,5 y 1 mL de medio alimenticido fresco de NSC suplementado con la concentración correcta de blasticidina.
6. Determina la concentración adecuada para la selección posterior de blasticidina identificando la concentración más baja que destruye células no transducidas entre 72 y 120 h tras el placaje.
   NOTA: Para los NSC murinos adultos, se identificó 1000 ng/mL (1 mg/mL) de blasticidina como la mejor concentración para la selección del antibiótico (Figura 3). Los pasos siguientes se realizan utilizando blasticidina a esta concentración. Cabe señalar que la concentración óptima de blasticidina puede variar considerablemente entre las preparaciones celulares, oscilando típicamente entre 0,5 y 10 μg/mL dependiendo del tipo de muestra, el número de pasajes y las condiciones de^{cultivo 32,33}; Por tanto, las curvas de kill empíricas son esenciales y no opcionales para cada nuevo tipo de celda. Consulta la Tabla 1, punto número 5 para consejos adicionales de solución de problemas.

4. Primera transducción lentiviral

NOTA: Antes de proceder con la transducción, es esencial conocer la multiplicidad óptima de la infección (MOI) a la que se deben transducir las partículas lentivirales (LVPs). Esto debe determinarse empíricamente para diferentes tipos celulares; Los métodos para hacerlo han sido bien descritos anteriormente^34,35. En los resultados ilustrativos representados, se utilizó un MOI de 20 basado en la experiencia previa en la transducción de CSN murinos primarios.

1. Comienza con NSCs expandidos y no transducidos formando neurosferas sanas (generadas tras la expansión de las células en el Paso 2.9 anterior). Dividir, resuspender, filtrar y contar las células según los pasos 2.3–2.8 anteriores, luego colocar las células de placa a una densidad de 1,5 x 10⁶ células por pozo en dos pozos (uno para virus oncogénico y otro para control) de una placa de ultra baja adhesión de 6 pozos. Incuba las placas durante la noche a 37 °C.
2. Al día siguiente, examina las células. Los CSN estarán listos para la infección si forman pequeños grupos.
3. Antes de infectar las células, descongela cuidadosamente la alicota lentiviral sobre hielo, permitiendo un deshielo gradual. Es fundamental no apresurar este proceso.
   NOTA: Para fines ilustrativos, este protocolo describe la transducción lentiviral utilizando dos constructos representativos: (1) un vector de control que expresa GFP bajo el promotor EF1-α con resistencia a blasticidina, y (2) un vector experimental que expresa un mutante oncogénico BRAF V600E marcado con HA en N-terminal bajo el promotor EF1-α, también con resistencia a blasticidina. La generación de lentivirus está fuera del alcance de este protocolo, pero ya ha sido bien descrita^{previamente 36,37}.
4. Tras el descongelamiento, calienta brevemente el virus a 37 °C justo antes de la infección. Determina el volumen de LVP a añadir a cada pozo, usando la fórmula MOI x número de células/título del virus. Usando una micropipeta ajustada al volumen calculado, añadir lentamente los LVP gota a gota a las células cultivadas. Gira la placa suavemente para distribuirla, teniendo cuidado de no derramar el medio en pozos adyacentes. Incuba las células a 37 °C durante 24 horas.
   NOTA: Una vez que la alicota viral ha sido descongelada a temperatura ambiente, no puede volver a congelarse y debe utilizarse en un plazo de 24 horas. Una vez que la alicuota se ha calentado a 37 °C, debe emplearse en un plazo de 30 minutos.
5. Tras este periodo de incubación, centrifugar las neuroesferas a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C y luego aspirar el sobrenadante. Resuspender en 2 mL de un NSC completo y fresco, sin virus ni antibióticos, y placar en un pozo fresco de una placa de 6 pozos de baja adherencia.
6. Al día siguiente, evalúa la eficiencia de transducción en las células de control GFP determinando la proporción de células/agrupaciones marcadas con fluorescencia respecto al total de células/grumos mediante microscopía de fluorescencia en múltiples campos. La expresión reportera esperada (GFP) debería superar el 80% para una transducción exitosa.
   NOTA: Si se observa una eficiencia de transducción subóptima, se puede realizar una segunda ronda de infección (repetiendo los pasos 4.4–4.6). Si la eficiencia no mejora, considera reoptimizar el MOI o probar una preparación diferente del lentivirus. Consulta la Tabla 1, punto número 6 para estos y otros consejos de solución de problemas.
7. Al observar que las neurosferas en desarrollo parecen sanas y que hay evidencia de infección (GFP positivo; ~80%), procede a la división de células según los pasos 2.3–2.6 anteriores. Resuspende las células en 5 mL frescos de medio NSC completo que contenga la concentración adecuada de blasticidina (1000 ng/mL), luego filtra a través de filtros estériles de 40 μm para eliminar los grumos celulares. Cuenta las células, luego placa aproximadamente 5 x^{10 4} células/mL en matrazas T-25 de ultra baja adherencia.
   NOTA: Tras la adición inicial del antibiótico, puede haber una alta tasa de muerte celular a medida que mueren las células no transducidas; Esto es de esperar, y debería mejorar con la selección continua.
8. Expande las células alimentándolas cada 3 días con un suplemento que contenga blasticidina. Cuando las esferas completamente formadas y sanas son visibles, normalmente entre 5 y 10 días después de la separación, el cultivo está listo para su uso en el Paso 5 o 6.
   NOTA: Tras una mayor expansión de los clones resistentes, se pueden recoger células para el Western blot (descrito en el Paso 7) para validar que la construcción oncogénica marcada con HA y marcada no con fluorescencia se está expresando adecuadamente. Si se realiza Western blot en este paso, se recomienda comprobar la expresión tras la^{segunda transducción} (en el Paso 7), para asegurar una expresión adecuada y continua.

5. Curva de muerte de puromicina en CSN resistentes a blasticidina

NOTA: La concentración óptima de selección para la segunda transducción también debe determinarse empíricamente. En esta etapa se utilizan NSC transducidos resistentes a la blasticidina, y las células se mantienen bajo selección de blasticidina (1000 ng/mL) durante todo el proceso, ya que la transducción y la selección concurrente de blasticidina pueden alterar la sensibilidad a la puromicina.

1. Precalenta el medio base del NSC, DM, 0,05% de tripsina-EDTA y PBS a 37 °C. Descongelan stocks de B27, N2, FGF, EGF, FBS, blasticidina y puromicina. Antes de iniciar, o durante los pasos de incubación a continuación, prepara un medio de NSC fresco completo y un 10% de FBS en medio NSC como se ha descrito anteriormente.
2. Utilizando neurosferas resistentes a blasticidina, tripsinizar y posteriormente separar según los Pasos 2.5–2.7, resuspendiendo en 1 mL de NSC fresco para contar y filtrar y eliminar grumos. Contar las células como se describe en el Paso 2.8, luego resuspender 25.000 células viables en 2,5 mL de alícuotas de NSC completo fresco en cónicas de 15 mL, preparando 1 alicota por concentración de antibiótico a analizar. Planea probar al menos entre 4 y 6 concentraciones diferentes, aunque se pueden probar más si se desea.
3. Añadir blasticidina para alcanzar la concentración previamente optimizada (1000 ng/mL = 0,25 mL de stock sin diluir / 2,5 mL alicuotas). Luego añade la cantidad adecuada de puromicina a cada tubo para alcanzar la concentración final deseada (véanse los cálculos de ejemplo en la Tabla 2).
4. Placa de 500 μL de celdas suspendidas (5.000 celdas) por pozo en una placa de unión ultra-baja de 24 pozos, con cada concentración repartida en cuadruplicat.
5. Incubar las células a 37 °C. Revisa cuidadosamente las células con microscopía de campo claro cada 24 horas para detectar cambios en la morfología y la muerte celular/neurosfera. Alimenta las células cada 3 días añadiendo 0,25 mL de medio alimenticino fresco de NSC suplementado con blasticidina y la concentración correcta de puromicina.
6. Determina la concentración adecuada para la selección posterior de puromicina identificando la concentración más baja que mata células entre 72 y 120 horas tras el desvanecimiento.
   NOTA: Para los NSC murinos adultos transducidos con lentivirus ilustrativos GFP y/o BRAF-V600E, se determinó empíricamente que 100 ng/mL puromicina fue la mejor concentración para la selección del antibiótico (Figura 4). Para las transducciones de ejemplo, los pasos siguientes se realizaron usando 1000 ng/mL de blasticidina (del Paso 3 arriba) y 100 ng/mL puromicina (del Paso 5 arriba). Consulta la Tabla 1, punto número 5 para consejos de solución de problemas.

6. Segunda transducción lentiviral

NOTA: Las células permanecen en medios que contienen blasticidina durante la segunda fase de transducción para asegurar que el constructo oncogénico o control GFP introducido en la primera fase de transducción se mantenga en las células.

1. Inicia el procedimiento utilizando CSN resistentes a la blasticidina que proliferan activamente y se transducen de forma estable (generados en el Paso 4). Comienza disociando los NSC en una suspensión de célula única (Pasos 2.3–2.7) para asegurar la uniformidad durante el placado.
2. Las células de placas a una densidad de 1,5 x 10⁶ celdas por pozo en un medio NSC completo con blasticidina (1000 ng/mL, según se determina en el Paso 3) en una placa de 6 pozos de ultra baja adhesión. Incuba las placas durante la noche a 37 °C.
3. Al día siguiente, las células estarán listas para la transducción si forman pequeños grupos. Descongela el lentivirus biquestrónico (que contiene luciferasa y RFP) sobre hielo, y luego se calienta brevemente a 37 °C justo antes de la infección. Determinar el volumen de LVP a añadir a cada pozo, usando la fórmula MOI x número de células/título del virus; aquí se utiliza un MOI de 20.
   1. Usando una micropipeta ajustada al volumen calculado, añadir lentamente los LVP gota a gota a las células cultivadas. Gira la placa suavemente para distribuirla, teniendo cuidado de no derramar el medio en pozos adyacentes. Incuba las células a 37 °C durante 24 horas.
4. Al día siguiente, centrifugar las neurosferas a 630 × g durante 5 minutos a 4 °C y volver a platicarlas en un NSC fresco y completo que contenga blasticidina (1000 ng/mL, según el Paso 3).
5. Al día siguiente, evalúa la eficiencia del segundo paso de transducción determinando la proporción de células/grumos positivos para RFP respecto al total de células/grumos mediante microscopía de fluorescencia en múltiples campos, con una eficiencia óptima de ~60%.
6. Al observar que las neurosferas parecen sanas y que el segundo paso de transducción fue efectivo (por ejemplo, la mayoría de los grupos celulares son RFP+), las células están listas para la selección dual. Comienza disociando los NSC en una suspensión de célula única (Pasos 2.3–2.7), luego vuelve a placar aproximadamente 5 x 10⁴ células/mL en matrazas T-25 de ultra baja unión en NSC completo que contienen blasticidina (1000 ng/mL) y puromicina (100 ng/mL).
   NOTA: Como en el Paso 4.6 anterior, si se observa una eficiencia de transducción subóptima, puede realizarse una segunda ronda de infección (repetiendo los pasos 6.3–6.6). Consulta la Tabla 1 para más consejos de solución de problemas.
7. Alimenta las células cada 3 días con un suplemento que contenga blasticidina y puromicina.
   NOTA: Es esencial una vigilancia vigilante de los cultivos para identificar clones de doble resistencia, que se caracterizarán por su supervivencia bajo ambas presiones selectivas. Cuando se pueden ver esferas completamente formadas y sanas, normalmente entre 5 y 10 días después de la separación, el cultivo está listo para una validación adicional (Paso 7).

7. Validación y caracterización de NSC dualmente transducidos

NOTA: Antes de realizar más experimentos in vitro o in vivo, se recomienda una validación adicional para asegurar que los constructos etiquetados con HA y la luciferasa se expresen adecuadamente.

1. Western blot para validar la expresión del constructo etiquetado con HA
   1. Cultivo de NSCs (control GFP y BRAF etiquetado con HA. V600E, en el ejemplo proporcionado) en frascos de adhesión ultra baja T-25 hasta que estén listos para partirse (según el Paso 2.2).
      NOTA: Antes de pasar al siguiente paso, se recomienda comprobar dos veces los cultivos para la expresión continua de GFP (en células de control de GFP) y la expresión RFP (en todas las células).
   2. Retirar la mitad del cultivo y separar según los pasos 2.2–2.7, luego volver a recubrir en un medio NSC nuevo y completo con blasticidina (1000 ng/mL) y puromicina (100 ng/mL) para una expansión continua del cultivo. Haz girar el resto de las neurosferas a 630 × g a 4 °C y luego aspira el sobrenadante.
   3. Posteriormente, lava los NSCs en pellets dos veces con PBS bien frío, centrifugando a 630 × g a 4 °C y aspirando el sobrenadante tras cada lavado. Añadir aproximadamente 200 μL de tampón de lisis RIPA helado suplementado con inhibidores de proteasa e fosfatasa a cada muestra.
   4. Deja que los lisados incuben sobre hielo durante 30 minutos, asegurando un vórtice intermitente cada 10 minutos. Centrifugar las muestras a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante, designado como lisado despejado, a un tubo fresco preenfriado. Guarda los lisados a -80 °C en un congelador profundo.
   5. El lisato puede entonces utilizarse para la blot Western (para validar la expresión de constructos) según los protocolos^{previamente establecidos 38}.
      NOTA: Si no se usa inmediatamente, guarda los lisados a -80 °C hasta el uso. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación para mantener la integridad de la muestra (véase Tabla 1, Punto nº 7).
2. Intensidad de bioluminiscencia (BLI) para validar la expresión adecuada de luciferasa luciferasa luciérnaga
   NOTA: Este protocolo valida la expresión de luciferasa mediante monitorización BLI de células vivas mediante hardware y software específicos (véase Tabla de Materiales para más detalles). Si se utiliza un sistema diferente para la detección y cuantificación de la BLI, la metodología puede variar.
   1. Divide los CSN y cuantifica según los pasos 2.2–2.8 anteriores, luego diluye las células en medio y placa completos de CSN a concentraciones variables (por ejemplo, 2,5 x 10⁴ células, 1 x 10⁵ células/pozo) en una placa de adhesión ultrabaja de 24 pozos (500 mL/pozo), con cada concentración de célula placada en cuadruplicado. Las células se mantienen en un medio completo de NSC que contiene blasticidina (1000 ng/mL) y puromicina (100 ng/mL).
      NOTA: Para evitar que la intensidad de luminiscencia secretada por luciferasa de un pozo se filtre a pozos adyacentes durante la medición, evite el blindaje de los NSC en pozos adyacentes.
   2. Encienda el sistema de imagen al menos 30 minutos antes para permitir que la cámara del dispositivo acoplado de carga se enfríe hasta su temperatura óptima de funcionamiento (aproximadamente -90 °C). Inicia el software de cuantificación y desinfecta la cámara de imagen usando un 70 % de etanol, permitiendo que se seque completamente antes de su uso.
      NOTA: Mantener la temperatura de la cámara de imagen en 37 °C para garantizar la viabilidad celular durante sesiones prolongadas de imagen.
   3. Descongela las alicuotas de D-luciferina, asegurando que estén protegidas de la exposición a la luz. Añade suavemente un volumen de 5 μL de solución activa de D-luciferina 15 mg/mL a cada pozo que contiene células para lograr una concentración final de 150 mg/mL. Agita la placa suavemente para asegurar una distribución uniforme de la solución.
   4. Incubar la placa a 37 °C durante 10 minutos para facilitar la difusión del sustrato hacia las células, promoviendo así la máxima producción de luz.
   5. Coloca la placa dentro del sistema de imagen de bioluminiscencia sensible. Coloca una cuadrícula sobre la placa. Selecciona el modo de imagen por luminiscencia , comenzando con la exposición automática durante el tiempo de exposición. Ponle binning a medio y ajusta el paso a 1 para optimizar la recogida de luz.
      1. Ajusta el campo de visión a 'D' para placas de 24 pozos y fija la altura del sujeto en 1,5 cm. Adquiere imágenes usando el software de imagen. Si la señal parece baja, el tiempo de exposición puede ajustarse manualmente (véase Punto nº 8 de la tabla de solución de problemas).
   6. Realizar correcciones de fondo contra los pozos de control y cuantificar las unidades de luz relativa según sea necesario para el análisis posterior utilizando el software de imagen.
      NOTA: Tras la validación del BLI, las células pueden ser trasplantadas ortotópicamente al cerebro de ratones singénicos o inmunodeprimidos, de acuerdo con los protocolos^{previamente establecidos 19}.

Resultados

Los CSN adultos se aislaron de la corteza de ratones adultos C57BL/6 y se cultivaron en cultivo^{no adherente 39}, lo que resultó en la formación de neurosferas primarias (20 – 250 μm) en un plazo de 7 a 10 días (Figura 1). Las células se expandieron in vitro. A continuación, se realizó la optimización de la selección de blasticidina en NSCs no transducidos (Paso 3). Tras 24 horas de selección, concentraciones iguales o...

Discusión

Este método de transducción lentiviral en dos pasos generó con éxito CSN genéticamente modificados adecuados para la investigación oncológica. Aquí se ilustró la integración efectiva de la mutación oncogénica BRAF V600E (encontrada en un subconjunto de gliomas adultos de alto grado y utilizada aquí como prueba de concepto) o el control GFP con sistemas de doble reportero para imagen de bioluminiscencia (luciferasa) y detección por microscopía de fluorescencia (RFP). La transducc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
& beta;-mercaptoetanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Utilizar dentro de un gabinete de seguridad biológica. Preparar reservas de 50 mM añadiendo 35 mL BME a 10 mL DMEM de baja glucosa, filtrar de forma estéril y alícuotar en 500 mL para su uso en la preparación de medios.
Anti-IgG de ratón, anticuerpo unido a HRP	Cell Signal Technology	7076	Utilizado a una dilución de 1: 2000 en leche desnatada al 1%
Suplemento B-27 (50X),	Gibco	17504-044	En el primer uso, descongelar y hacer alícuotas de 1 ml para uso futuro; almacenar las alícuotas a -20 & deg; C. Mantener los suplementos en hielo después de descongelarlos hasta que estén listos para añadirse a los medios
Blasticidina S HCl (10 mg / mL)	Gibco	A1113903	Hacer alícuotas del stock de 10 mg / mL; colocar en tubos pequeños de 200 mL y almacenar a -20 & deg; C hasta su uso.
Albúmina sérica bovina (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Utilizado como BSA al 10% peso / volumen en 1x PBS. La BSA es pegajosa; asegúrese de pesarla correctamente y agregar un volumen apropiado de diluyente para hacer la solución exacta.
Colador de células (40 & micro; m)	Midsci	40ICS	Pre-esterilizado y envuelto individualmente. Debe abrirse dentro del gabinete de seguridad biológica. No tocar con las manos desnudas
D-Luciferina, sal de potasio	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Hacer una solución de trabajo de 15 mg / mL (diluida en agua de grado molecular) y filtrar de forma estéril antes de su uso. Prepare un stock fresco cada vez y agregue directamente a los medios para lograr una concentración de trabajo final de 150 mg / mL (por ejemplo, 5 mL de solución de trabajo por cada 500 mL de cultivo)
DMEM, glucosa baja	Gibco	11885-084	Utilizado para hacer el medio NSC base
Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF)	Corning	354001	Se suministra como un polvo liofilizado estéril; para reconstituir el stock 1000X, añada 4,95 mL de PBS y 50 & micro; L de BSA al 10% (en PBS 1x) a 100 & micro; g de polvo de EGF liofilizado, y pipete para combinar. Hacer alícuotas de 500 & micro; L o más pequeñas en tubos pequeños y almacenar a -20° C hasta su uso para medios NSC completos y suplemento de alimentación NSC. Evite repetidos ciclos de congelación-descongelación.
Factor de Crecimiento de Fibroblastos, Básico (FGF)	R&D systems	233-FB	Se suministra como un polvo liofilizado estéril; para reconstituir el stock 1000X, añada 1,24 mL de PBS y 12,5  & micro; L de BSA al 10% (en PBS 1x) a 25 & micro; g de polvo de FGF liofilizado, y pipete para combinar. Hacer alícuotas de 500 & micro; L o más pequeñas en tubos pequeños y almacenar a -20° C hasta su uso para medios NSC completos y suplemento de alimentación NSC. Evite repetidos ciclos de congelación-descongelación.
Glucosa, 45%	Corning	25-037-CI	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
HA-Tag (C29F4) mAb de conejo	Cell Signal Technology	3724	Utilizado a una dilución de 1: 1000 en albúmina sérica bovina al 3% (Western blotting, para verificar la expresión de la etiqueta HA)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
IVIS 50	PerkinElmer		El instrumento debe encenderse 30 minutos antes de su uso para permitir que la cámara se enfríe a la temperatura óptima. El software Living Image (versión 4.3.1) se utiliza para la cuantificación.
Lentivirus-Luciferasa (Firefly) -2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	El LVP debe alícuotarse y almacenarse en un refrigerador a -80 & deg; C
L-Glutamina, 200 mM	Corning	25-005-CI	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
Agua de grado molecular	Corning	46-000-CM	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
Suplemento N-2 (100x)	Gibco	17502-048	En el primer uso, descongelar y hacer alícuotas de 1 ml para uso futuro; almacenar las alícuotas a -20 & deg; C. Mantener los suplementos en hielo después de descongelarlos hasta que estén listos para añadirse a los medios
Nestin (E5C7I) mAb de conejo	Cell Signal Technology	89529	Utilizado a una dilución de 1: 1000 en albúmina sérica bovina al 3% (Western blotting, para verificar la expresión del marcador NSC)
Medio Neurobasal	Gibco	21103-049	Utilizado para hacer el medio NSC base
Penicilina-estreptomicina (10,000 U / mL)	Gibco	15140-122	Se suministra como solución estéril; alícuota y almacenar a -20°C hasta su uso.
Solución salina tamponada con fosfato, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	Se suministra como solución estéril. No abra fuera del gabinete de seguridad biológica
Inhibidor de proteasa/fosfatasa	Cell Signal Technology	5872S	Debe almacenarse a -20 & deg; C
Dihidrocloruro de puromicina	Gibco	A1113803	Hacer alícuotas del stock de 10mg / ml; colocar en tubos pequeños de 200 mL y almacenar a -20 & deg; C hasta su uso.
Buffer de lisis RIPA, 10x	Millipore-Sigma	20-188	Almacenar a -80 & deg; C y hacer alícuotas de 1x en agua estéril destilada doble
Medio de congelación celular libre de suero	Bambanker (Nippon Genetics)