Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Resumen

La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las principales causas de muerte por un solo agente infeccioso en todo el mundo, con el aumento de las tasas de resistencia a los fármacos que convierte el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos en una prioridad sanitaria global. Este protocolo describe un enfoque fenotípico de cribado para identificar posibles candidatos a fármacos anti-TB a través de tres etapas integradas. Primero, un compuesto de la clase 4-aminoquinolina se sintetiza mediante una vía de tres pasos y se caracteriza completamente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). En segundo lugar, se evalúa la actividad antimicrobiana del compuesto frente a Mycobacterium tuberculosis mediante el ensayo de microplacas de reducción colorimétrica de resazurina (REMA), que determina la concentración inhibitoria mínima (CMI) mediante una simple lectura visual de cambio de color. En tercer lugar, la citotoxicidad del compuesto se evalúa en dos líneas celulares de mamíferos, Vero (riñón de mono verde africano) y HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), utilizando el ensayo MTT (bromuro 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) y el ensayo de captación roja neutra (NRU). Estos dos ensayos complementarios miden parámetros celulares distintos, permitiendo la validación cruzada de los resultados de citotoxicidad. En conjunto, los datos de CIM y citotoxicidad permiten calcular un índice de selectividad (SI) para evaluar el potencial terapéutico de cada compuesto. Este protocolo proporciona un marco reproducible paso a paso para la identificación de hitos anti-TB en fases tempranas y la evaluación preclínica.

Introducción

Causada principalmente por el bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la tuberculosis (TB) es una enfermedad respiratoria infecciosa en humanos que actúa principalmente en los pulmones, aunque también pueden aparecer variantes extrapulmonares. La TB se propaga a través de bacilos MTB en el aire liberados por personas con enfermedad^{activa 1}. Dependiendo de la evolución de la enfermedad, una persona infectada con tuberculosis puede adquirir tuberculosis activa de inmediato. Sin embargo, normalmente un individuo recién infectado desarrollará tuberculosis latente, donde las células Mtb con baja actividad metabólica sobreviven dentro de los granulomas ^1,2. Una persona con tuberculosis latente puede eventualmente desarrollar la forma activa de la enfermedad, manifestando síntomas^{clínicos 3}. Actualmente, se estima que una cuarta parte de la población mundial tiene infección latente de tuberculosis⁴.

A pesar de los muchos avances, la tuberculosis sigue siendo un grave problema de salud pública a nivel mundial. Los datos del Informe Global de Tuberculosis más reciente muestran que 10,7 millones de personas desarrollaron la enfermedad en 2024. Durante ese mismo año, se registraron 1,23 millones de muertes por tuberculosis en todo el mundo, lo que convierte a la TB en la principal causa de muerte por un solo agente^{infeccioso 5}. Además de la patología y la compleja biología del Mtb, los aspectos socioeconómicos como la pobreza y la desnutrición, junto con factores de salud como el tabaquismo, la diabetes y la coinfección por VIH, hacen que el control de enfermedades sea aún más^{complicado 5}. Esto contribuye a la permanencia de la TB como un problema de salud global desde hace tiempo.

Además, los tratamientos actuales para la tuberculosis tienen limitaciones que complican la lucha contra la enfermedad. Contra cepas susceptibles de Mtb, el tratamiento estándar consiste en una terapia combinada de 4 fármacos: isoniazida (INH), rifampicina (RIF), etambutol (EMB) y pirazinamida (PZA). Estos antibióticos se administran durante un mínimo de 6 meses, requiriendo una adherencia estricta durante todo el tratamiento. Este régimen terapéutico, a pesar de ser eficaz en la mayoría de los casos y tener una tasa de éxito de alrededor del 85%, sigue enfrentando muchos desafíos ^5,6. Entre los mayores problemas están los efectos secundarios y la prolongada duración, que a menudo conducen a una interrupción prematura por parte del paciente. Esta interrupción, junto con la administración incorrecta de los antibióticos, favorece la selección de cepas resistentes de Mtb, que requieren regímenes terapéuticos más tóxicos, costosos y^{extensos 7,8}.

Teniendo en cuenta este escenario, el desarrollo de nuevos y potentes fármacos contra la tuberculosis es urgente. Este protocolo describe las primeras etapas de la investigación de nuevos candidatos a fármacos mediante cribado fenotípico. Para ilustrar la aplicación de este protocolo, seleccionamos un compuesto de 4-aminoquinolina derivado de LABIO-17 para su evaluación. LABIO-17 fue identificado previamente por nuestro grupo de investigación como un inhibidor de la enzima enoil-ACP-reductasa (InhA) en Mtb, que es el mismo objetivo molecular que la isoniazida (INH^)9,10. InhA está implicado en la biosíntesis del ácido micólico en M. tuberculosis y es esencial para la supervivencia del bacilo, lo que pone de relieve su relevancia como objetivo molecular^{prometedor 11}

Protocolo

1. Síntesis química y caracterización

NOTA: La síntesis y caracterización del compuesto químico se realiza como se describió^{anteriormente 10}. Todos los pasos desde 1.1 hasta 1.4 deben hacerse en una campana extractora bien ventilada usando guantes de nitrilo.

1. Preparación de reactivos
   1. Preparación de MeOH/CH₃CN (1:1) con ácido fórmico al 0,1%
      1. Mide volúmenes iguales de metanol (MeOH) y acetonitrilo (CH₃CN) para preparar una mezcla 1:1 (v/v) (grado HPLC).
      2. Combina los disolventes en un recipiente limpio y seco (por ejemplo, un matraz volumétrico). Añade ácido fórmico para lograr una concentración final del 0,1% (v/v) (por ejemplo, añadir 1 mL de ácido fórmico a 1 L de mezcla disolvente).
      3. Mezcla bien revolviendo suavemente o revolviéndolo. Guárdalos en un recipiente bien cerrado a temperatura ambiente, protegido de la luz.
   2. Preparación de ácido acético al 1% (v/v) en agua ultrapura
      1. Enjuaga el matraz volumétrico con agua ultrapura y luego colócalo sobre el banco. Añadir ~80% del volumen final de agua ultrapura al matraz (es decir, 80 mL para un matraz de 100 mL; 800 mL para un matraz de 1 L).
      2. Utilizando una pipeta calibrada, añadir ácido acético glacial para lograr un 1% (v/v): para un volumen final de 100 mL → añadir 1,0 mL de ácido acético; para 1 L de volumen final → añadir 10,0 mL de ácido acético.
      3. Mezcla bien revolviendo o revolviendo. Rellena el frasco hasta la última marca con agua ultrapura y mezcla.
      4. Desgasifica la solución mediante sonicación usando un limpiador ultrasónico (frecuencia del tanque ~40 kHz) configurado en modo de desgasificación durante 20 minutos a temperatura ambiente.
      5. Transfiere a una botella ámbar etiquetada (etiqueta: contenido, concentración, grado disolvente, fecha, preparador). Guárdalo bien cerrado a temperatura ambiente.
   3. Preparación de acetonitrilo: Metanol (1:1, v/v), grado HPLC
      1. Medir volúmenes iguales de acetonitrilo y metanol: para un volumen final de 100 mL → 50,0 mL de acetonitrilo + 50,0 mL de metanol; para 1 L volumen final → 500 mL acetonitrilo + 500 mL metanol.
      2. Combina los disolventes en un matraz o botella volumétrica limpia y mezcla por inversión o revuelta. Filtra la mezcla a través de un filtro de 0,45 μm en un recipiente limpio para eliminar partículas.
      3. Desgasifica la solución mediante sonicación usando un limpiador ultrasónico (frecuencia del tanque ~40 kHz) configurado en modo de desgasificación durante 20 minutos a temperatura ambiente.
      4. Transfiere a una botella ámbar etiquetada (etiqueta: composición, grado disolvente, fecha, preparador). Guárdalo bien cerrado a temperatura ambiente, lejos del calor y la luz.
   4. Preparación de solución 7:3 (v/v) de hexano/acetato de etil para cromatografía en columna
      1. Mide el 70% del volumen final en hexano. Ejemplo: para un volumen final de 100 mL → hexano de 70 mL.
      2. Mide el 30% del volumen final en acetato de etilo. Ejemplo: para un volumen final de 100 mL → 30 mL de acetato de etilo.
      3. Combina ambos disolventes en un recipiente limpio y seco (por ejemplo, un matraz volumétrico o una botella).
      4. Mezcla bien invirtiendo o removiendo hasta que quede homogéneo. Etiqueta el recipiente con composición, fecha, grado disolvente y preparador.
   5. Preparación de solución 1:1 (v/v) de hexano/acetato de etil para cromatografía en columna
      1. Mide el 50% del volumen final en hexano. Ejemplo: para un volumen final de 100 mL → 50 mL de hexano.
      2. Mide el 50% del volumen final en acetato de etilo. Ejemplo: para un volumen final de 100 mL → 50 mL de acetato de etilo.
      3. Combina ambos disolventes en un recipiente limpio y seco (por ejemplo, un matraz volumétrico o una botella). Mezcla bien invirtiendo o removiendo hasta que quede homogéneo.
      4. Etiqueta el recipiente con composición, fecha, grado disolvente y preparador.
   6. Preparación de una solución de bicarbonato de sodio saturado (NaHCO₃)
      1. Pesa una cantidad excesiva de bicarbonato de sodio (NaHCO₃) (aproximadamente 15–20 g por cada 100 mL de agua).
      2. Añadir el bicarbonato de sodio a un vaso limpio que contenga un volumen conocido de agua destilada (por ejemplo, 100 mL). Remueve la mezcla continuamente a temperatura ambiente (20–25 °C) utilizando un agitador magnético o una varilla de vidrio.
      3. Sigue removiendo hasta que no se disuelva más sólido y quede una pequeña cantidad de bicarbonato de sodio sin disuelver en el fondo; esto indica que la solución está saturada.
      4. Deja reposar la suspensión entre 10 y 15 minutos para que el sólido no disuelto se asiente. Filtra la mezcla a través de un filtro de papel o un embudo de vidrio sinterizado para eliminar el exceso de bicarbonato sin disuelto.
      5. Recoge el filtrado transparente, que es la solución saturada de bicarbonato sódico.
      6. Guarda la solución en un frasco bien cerrado, correctamente etiquetado con el nombre del compuesto, concentración (saturado), fecha de preparación y tus iniciales.
      7. Mantén la solución a temperatura ambiente y prepárala fresca cuando sea necesario, ya que el_CO2 puede escapar lentamente y alterar la concentración con el tiempo.
2. Síntesis de 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (3)
   1. Preparar una solución que contenga 4-bromoanilina (1,2 g, 7,3 mmol) y sulfato de magnesio anhidro (1,08 g, 9,0 mmol) en etanol (15 mL).
   2. Añade ácido acético glacial (0,33 mL) y acetoacetato de etil (1,8 mL, 14,1 mmol) a la solución. Remover la mezcla de reacción a 90 °C durante 16 horas.
   3. Filtrar la mezcla de reacción mediante celulosa, retención de 11 μm y papel filtro cualitativo para eliminar el sulfato de magnesio en suspensión.
   4. Evapora el etanol usando un evaporador rotativo para obtener el intermediario de acrilato.
   5. Calienta el intermedio usando un baño de aceite adecuado que contenga un fluido sintético de transferencia de calor de alto rendimiento (véase Tabla de Materiales) (15 mL) a 230–250 °C durante 15 minutos para completar la reacción.
   6. Enfría la mezcla a temperatura ambiente. Filtra el precipitado formado y lávalo con hexano y cloroformo.
   7. Concentrar el producto final a presión reducida usando un evaporador rotatorio hasta eliminar todos los disolventes residuales (véase la Tabla de Materiales).
3. Síntesis de 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (4)
   1. Prepara una solución de 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) en tolueno (10 mL). Añade oxicloruro de fósforo (V) (0,65 mL, 6,9 mmol) a la solución.
   2. Remueve la mezcla de reacción a 110 °C durante 2 horas. Elimina el exceso de oxicloruro de fósforo(V) usando un evaporador rotatorio.
   3. Enfría los residuos en un baño de hielo. Neutraliza la mezcla de reacción con solución saturada de bicarbonato sódico.
   4. Extrae el producto con acetato de etilo (3 x 50 mL). Combina las fases orgánicas y sécalas sobre sulfato de sodio anhidro.
   5. Evapora el disolvente usando un evaporador rotativo para obtener un residuo sólido. Seca el sólido resultante usando un evaporador rotativo para obtener el producto crudo.
   6. Purificar el compuesto mediante cromatografía flash sobre gel de sílice (malla 35–70) utilizando hexano:acetato de etil (7:3) como eluyente.
4. Síntesis de 6-Bromo-2-metil-N-(4-(piperidina-1-il)fenil)quinolina-4-amina (6)
   1. Prepara una mezcla de reacción que contenga 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidina-1-il)anilina (0,57 g, 3 mmol), piridina (0,24 mL) y HCl 37% (0,2 mL) en isopropanol (20 mL).
   2. Remover la mezcla de reacción a 85 °C durante 16 horas. Retira el disolvente usando un evaporador rotatorio.
   3. Trata el residuo con una solución saturada de bicarbonato de sodio.
   4. Filtrar el sólido resultante a través de un papel filtro cualitativo de celulosa de retención de 11 μm y disuelvarlo en cloroformo (50 mL).
   5. Lava la solución de cloroformo con agua (3 x 15 mL). Seca la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro.
   6. Evapora el disolvente usando un evaporador rotatorio para obtener un sólido verde. Purifica el producto con lavados sucesivos con hexano caliente (4 x 10 mL).
   7. Realizar la purificación final mediante cromatografía flash en gel de sílice (malla 35–70) utilizando hexano:acetato de etil (1:1) como eluyente.
5. Cromatografía de capa delgada (TLC)
   1. Monitoriza el progreso de la reacción usando cromatografía de capa fina (TLC) en placas de gel de sílice TLC 60 F254.
   2. Utiliza el material de partida 4 como referencia para monitorizar la reacción y evaluar su consumo.
6. Punto de fusión (m.p.)
   1. Añade la punta de una espátula del compuesto al aparato de punto de fusión. Anota el rango de punto de fusión.
   2. No aplique correcciones a los valores medidos. Realiza el experimento en triplicado.
7. Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
   1. Pesa entre 1 y 2 mg de compuesto 6. Prepara una solución de reserva del compuesto a 1,0 mg/mL en acetonitrilo/metanol (1:1, v/v).
   2. Diluye la solución original a 0,5 mg/mL para su análisis. Analizar las muestras utilizando un sistema HPLC (véase Tabla de Materiales) equipado con doble bomba, inyector automático y detector UV.
   3. Adquirir y procesar datos utilizando software de adquisición de datos para cromatografía (véase Tabla de Materiales).
   4. Establezca las condiciones cromatográficas de la siguiente manera: utilizar una columna C18 de fase inversa, 5 μm (250 x 4,6 mm) (véase Tabla de Materiales). Ajusta el caudal a 1,5 mL/min y monitoriza la detección UV a 254 nm. Mantener la fase móvil al 100% de agua (0,1% ácido acético) de 0 a 7 minutos; aplicar un gradiente lineal desde 100% agua (0,1% ácido acético) hasta 90% acetonitrilo/metanol (1:1, v/v) de 7 a 15 minutos; Vuelve al 100% de agua (0,1% ácido acético) durante 5 minutos y mantenlo durante otros 10 minutos.
8. Resonancia Magnética Nuclear (¹H, ¹³C)
   1. Pesa entre 15 y 20 mg del compuesto 6 en un tubo de RMN. Añade DMSO-d₆ como disolvente.
   2. Adquiere espectros de RMN ^{de 1}H y ¹³C en un espectrómetro de RMN (véase Tabla de Materiales) utilizando secuencias de pulsos estándar.
   3. Operar el instrumento a 400 MHz para núcleos ^{de 1}H y a 100 MHz para ¹³núcleos C. Utiliza tetrametilsilano (TMS) como referencia interna.
   4. Expresa los desplazamientos químicos (δ) en partes por millón (ppm). Utiliza el archivo FID obtenido del experimento para visualizar y procesar los datos de RMN.
9. Espectrometría de Masas de Alta Resolución (HRMS)
   1. Pesa entre 1 y 2 mg de compuesto 6. Prepara la muestra en una mezcla 1:1 de MeOH/CH₃CN que contenga un 0,1% de ácido fórmico.
   2. Realizar el análisis con un espectrómetro de masas Orbitrap de alta resolución (véase Tabla de Materiales), que combina un espectrómetro de masas lineal de trampa iónica con un analizador de masas Orbitrap.
   3. Introduce la muestra por infusión directa a un caudal de 10 μL/min en modo de iones positivos mediante ionización por electropulverización (ESI).
   4. Determina la composición elemental utilizando la herramienta de composición elemental del software de análisis de datos de espectrometría de masas (véase Tabla de Materiales).
10. Cromatografía en columna – Compuesto 4
    1. Prepara una columna de gel de sílice usando gel de sílice de 60 Å (malla 70–230, 0,063–0,200 mm). Embala la columna adecuadamente con gel de sílice.
    2. Usa hexano/acetato de etil (7:3, v/v) como fase móvil. Carga el compuesto crudo 4 sobre la columna. Eluye el compuesto y recoge fracciones.
    3. Monitoriza las fracciones con TLC y combina las que contienen el producto puro.
11. Cromatografía en columna – Compuesto 6
    1. Prepara una columna de gel de sílice usando gel de sílice de 60 Å (malla 70–230, 0,063–0,200 mm). Embala la columna adecuadamente con gel de sílice.
    2. Utiliza hexano/acetato de etil (1:1, v/v) como fase móvil. Carga el compuesto bruto 6 sobre la columna. Eluye el compuesto y recoge fracciones.
    3. Monitoriza las fracciones con TLC y combina las que contienen el producto puro.

Figura 1. Reactivos y condiciones: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 h; ii = C₁₂H₁₀, C₁₂H₁₀O, 230-250 °C, 15 min; iii =_{POCl 3}, Tolueno, 110 °C, 2 h; iv = Piridina, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria

1. Diseño experimental y disposición de placas
   1. Evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir el crecimiento de M. tuberculosis utilizando el ensayo de microplacas de reducción colorimétrica de resazurina (REMA) para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), como se describió^{anteriormente 11,12,13}.
   2. Realizar tres experimentos independientes (tres réplicas biológicas) para cada compuesto probado sin réplicas técnicas (una fila por compuesto y una placa por experimento).
   3. Evalúa los compuestos que actúan como controles positivos junto con compuestos de prueba para asegurar que las condiciones del ensayo permitan la inhibición del crecimiento.
   4. Análisis de isoniazida (INH) y rifampicina (RIF) como controles positivos.
   5. Asigna las filas A y B para compuestos de control (INH y RIF, respectivamente).
   6. Asigna las filas siguientes para los compuestos de prueba (compuestos de la A a la F en la Figura 2).
   7. Preparar las columnas 1 a 10 con diluciones en serie dobles de compuestos de control y prueba, cada compuesto ocupando una fila, con la concentración más alta en la columna 10 y la menor en la columna 1.
   8. Preparar la columna 11 como control de viabilidad que contenga medio de crecimiento y bacterias a una concentración final de DMSO del 2,5%, sin añadir ningún compuesto de control o prueba.
   9. Prepara la columna 12 como control de esterilidad añadiendo compuestos de control o de prueba a mayor concentración de la dilución serial (igual que en la columna 10) al medio de crecimiento sin células bacterianas.
   10. Consulte la Figura 2 para una disposición representativa de una placa MIC.
2. Preparación de reactivos
   1. Preparación del caldo Middlebrook 7H9 complementado con ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa (OADC).
      1. A una botella de cristal de 200 mL que contenga 90 mL de agua ultrapura, añade 0,47 g de polvo 7H9, 0,24 mL de glicerol al 85% y 0,5 mL de 10% Tween-80.
      2. Autoclave el medio durante 10 minutos a 121 °C y 98,07 kPa.
      3. Deja que el medio se enfríe hasta que esté tibio al tacto (aprox. 45–50 °C).
      4. Añadir 10 mL de OADC (nosotros usamos OADC comercialmente disponible; véase la Tabla de Materiales para más detalles).
      5. Guárdalos a 4 °C.
         NOTA: Prepara la cantidad adecuada para el experimento, teniendo en cuenta las proporciones de los reactivos.
   2. Preparación del caldo Middlebrook 7H9 con ADC
      1. A una botella de cristal de 200 mL que contenga 90 mL de agua ultrapura, añade 0,47 g de polvo 7H9. Autoclave el medio durante 10 minutos a 121 °C y 98,07 kPa.
      2. Deja que el medio se enfríe hasta que esté tibio al tacto (aprox. 45–50 °C). Añade 10 mL de ADC. Guárdalos a 4 °C.
         NOTA: Prepara la cantidad adecuada para el experimento, manteniendo las proporciones de los reactivos.
   3. Preparación de soluciones para acciones compuestas
      1. Prepara una solución de reserva de cada compuesto a 2 mg/mL disuelta en DMSO.
      2. Conservar a –20 °C.
         NOTA: Antes del experimento, la concentración máxima en la prueba se define en función de una evaluación de solubilidad. Para determinar el límite de solubilidad, inspecciona visualmente las soluciones en busca de la presencia de cristales. Si se observan cristales, se diluye aún más la alicota a la mitad de la concentración anterior. Realiza esta evaluación utilizando un DMSO al 5%.
   4. Preparación de soluciones de trabajo compuesto
      NOTA: Las soluciones de trabajo deben prepararse frescas en el momento del experimento diluyendo los compuestos originales en caldo 7H9 suplementado con ADC al 10%. La concentración final de DMSO en la solución de trabajo debe ser del 5%, y la concentración del compuesto debe ser el doble de la concentración máxima prevista para la prueba. Cabe destacar que la concentración final de DMSO a la que las bacterias están expuestas durante el ensayo es del 2,5%, ya que el volumen se duplica tras la adición de la suspensión bacteriana (véase la sección 2.3, paso 2.3.8).
      NOTA: El 2,5% de DMSO es tolerado por las cepas bacterianas utilizadas en nuestro laboratorio (M. tuberculosis , H37Ra, H37Rv y aislados clínicos). Si trabajas con otras cepas u otras especies bacterianas, realiza un experimento preliminar de CMI utilizando DMSO como compuesto de prueba para determinar las concentraciones más altas de DMSO que pueden usarse sin favorecer la inhibición del crecimiento.
   5. Preparación de la solución de resazurina
      1. Prepara una solución de resazurina al 0,01% disolviendo 1 mg de resazurina en 10 mL de agua ultrapura.
      2. Esteriliza la solución usando un filtro de 0,22 μm.
         NOTA: La resazurina esterilizada con filtro puede almacenarse a 4 °C durante 1 semana¹⁴. Sin embargo, prepara esta solución inmediatamente antes de usarla como práctica habitual.
3. Preparación de micobacterias
   1. Inocular una sola colonia de M. tuberculosis en un tubo centrífugo de 50 mL que contenga 10 mL de caldo 7H9 suplementado con 10% de OADC, 0,2% de glicerol y 0,05% Tween-80.
   2. Incubar con agitación constante (100 rpm) a 37 °C hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,6 a 0,8 (aproximadamente 3 a 4 semanas).
      PRECAUCIÓN: M. tuberculosis H37Rv está clasificado como patógeno del Grupo de Riesgo 3, capaz de transmitir por vía aérea y causar enfermedades potencialmente letales en humanos. Realizar todas las manipulaciones en un gabinete de bioseguridad certificado dentro de un laboratorio de bioseguridad nivel 3 (BSL-3), utilizando el equipo de protección individual (EPP) adecuado.
   3. Homogeneiza el cultivo bacteriano vórtices con perlas de vidrio estériles (1 mm) durante 3 minutos.
   4. Deja reposar la suspensión 15 minutos para que se asienten los grumos.
   5. Mide el OD₆₀₀ del sobrenadante y almacena las alicotas a −80 °C.
      NOTA: Para experimentos, diluir la suspensión bacteriana a un OD_{teórico de 600} de 0,006 en caldo fresco de 7H9 suplementado con un 10% de ADC. Dispensar 100 μL por pozo en placas de 96 pozos durante el ensayo.
4. Preparación de placas de 96 pozos
   1. Añade 100 μL de caldo 7H9 complementado con ADC al 10% en la columna 12.
   2. Añade 100 μL de caldo 7H9 complementado con ADC al 10% (que contiene 5% de DMSO) a las columnas 11 y 9 a 1.
   3. Añadir 200 μL de la solución compuesta (preparada al doble de la concentración de prueba más alta) a la columna 10 (asignar una fila por compuesto).
   4. Añadir 100 μL de la solución compuesta a la columna 12. Realizar una dilución serial doble: transferir 100 μL de la columna 10 a la columna 9 y mezclar bien pipeteando.
   5. Continúa la dilución en serie desde la columna 9 hasta la columna 1. Descarta los últimos 100 μL de la columna 1.
   6. Añadir 100 μL de la suspensión bacteriana (diámetro exterior_{teórico 600} de 0,006) a las columnas 11 a 1.
   7. Cubre la placa, sella con parafilm y incuba a 37 °C durante 7 días.
      NOTA: La Figura 2 es una disposición representativa de una placa MIC. Consulte esta figura para interpretar los pasos 2.3.1 a 2.3.9.
5. Adición de Resazurin y Análisis de Datos
   1. Añade 60 μL de solución de resazurina al 0,01% en cada pozo de la placa. Cubre la placa, sella con parafilm y incuba a 37 °C durante 48 horas.
   2. Observa el cambio de color de azul (inhibición del crecimiento) a rosa (crecimiento bacteriano).
      NOTA: En algunos experimentos, un cambio de color incompleto da lugar a un pozo morado. Interpreta esto como crecimiento bacteriano.

Figura 2. Representación esquemática de una placa de microdilución de caldo utilizada para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI). Las diluciones en serie de dos partes de los compuestos probados se distribuyeron entre las columnas 1–10; las diluciones posteriores se realizan secuencialmente desde la columna 10 hasta la columna 1, con la mayor concentración de compuestos en la columna 10. Las filas A y B corresponden a controles positivos que contienen los fármacos de referencia isoniazida y rifampicina, respectivamente. Las filas C–H corresponden a los compuestos probados. La columna 11 representa el control de viabilidad (medio que contiene un 2,5% de DMSO e inoculo bacteriano), mientras que la columna 12 corresponde al control de esterilidad (medio que contiene los compuestos en ausencia de inóculo bacteriano). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Evaluación de citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos

NOTA: Realizar todas las manipulaciones de cultivos celulares en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica certificado Clase II.

1. Preparación de líneas celulares de mamíferos
   1. Cultivar líneas celulares de carcinoma hepático humano (HepG2) y riñón de mono verde africano (Vero) en el Medio Modificado para Águilas (DMEM) de Dulbecco.
   2. Suplementar el medio con 1,8 g/L de bicarbonato sódico, suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 0,1% de anfotericina B (denominada medio completo).
   3. Incubar los cultivos celulares a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂.
   4. Extraer células subconfluentes (70%–80%) tratándolas con una solución de tripsina-EDTA al 0,25% durante 5–10 minutos.
   5. Neutraliza la tripsina añadiendo un volumen igual de medio completo. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 200 x g durante 5 minutos.
   6. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender la pastilla en 10 mL de medio fresco completo.
   7. Determinar la concentración y viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro con exclusión de azul de tripán.
      NOTA: Para la exclusión de azul de tripán, mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de solución de azul de tripán al 0,4% y cargue sobre el hemocitómetro (o portaobjetos de conteo). Las células muertas o con membrana comprometida aparecen azules, mientras que las células viables permanecen sin teñir. Calcular la viabilidad como % de viabilidad = (células sin teñir / celdas totales) x 100. Procede con la siembra solo si la viabilidad es ≥ 90%.
   8. Diluye la suspensión de la celda a la densidad de siembra objetivo. Sembra 100 μL de suspensión de celda en cada pozo de columnas 2 a 12 de una placa de fondo plano de 96 pozos.
      Densidades de siembra: 4.000 celdas/pozo para celdas Vero; 5.000 células/pozo para células de HepG2.
      NOTA: Optimizar estas densidades para asegurar que las células permanezcan en la fase de crecimiento logarítmico y no alcancen la confluencia del 100% antes del final del ensayo de 48 horas.
   9. Llena la columna 1 con 100 μL de medio completo (sin celdas) para que sirva como espacio en blanco para mediciones de absorbancia.
   10. Prepara cuatro placas idénticas para cada línea celular: dos para el ensayo MTT y dos para el ensayo NRU.
   11. Incubar las placas durante 24 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir la unión celular.
2. Dilución de compuestos y tratamiento celular
   1. Preparar soluciones estándar para cada compuesto de prueba en el Suero Tamponado de Fosfato (DPBS) de Dulbecco o en un disolvente adecuado (por ejemplo, dimetilsulfóxido; DMSO).
      NOTA: Verifique que el compuesto sea soluble en el medio de cultivo celular y que la concentración del disolvente no sea tóxica (por ejemplo, <0,1% v/v para DMSO) antes del ensayo.
   2. Diseña la disposición de las placas para incluir blanks, controles apropiados y réplicas técnicas. Un diseño representativo para probar hasta 9 compuestos en 8 concentraciones se muestra en la Figura 3.
   3. Preparar diluciones en serie del(los) compuesto(s) de ensayo en medio completo para cubrir el rango de concentración previsto. Asegúrate de que se prepare suficiente volumen para todas las placas replicadas.
      NOTA: Si se utiliza un disolvente (por ejemplo, DMSO), suplemente el medio de dilución para que la concentración final del disolvente permanezca constante a lo largo de toda la serie de dilución en serie.
      NOTA: Los pozos tratados con disolventes (control de vehículos) actúan como control funcional negativo, definiendo la viabilidad del 100% de las células contra los cuales se normalizan los pozos tratados con compuestos. Para la validación del ensayo, incluye un compuesto de referencia citotóxico (por ejemplo, 0,1% Triton X-100 o 1 mM dodecilsulfato de sodio) a una concentración conocida por producir muerte celular completa (0% de viabilidad). Los valores de absorbancia en estos pozos control positivos no deberían diferir significativamente de los pozos en blanco, confirmando así una viabilidad del 0%.
   4. Tras el periodo de unión de las células de 24 horas, inspecciona visualmente las placas bajo un microscopio invertido para confirmar que las células están adheridas, se dispersan y cubren aproximadamente entre el 70% y el 80% de la superficie del pozo con confluencia homogénea. Placas de descarte que muestren contaminación o insuficiente sujeción.
   5. Aspira cuidadosamente el medio de cultivo usando una punta de pipeta, inclinando la punta hacia el lateral de cada pozo para evitar alterar la monocapa celular. Procesa las placas en secciones para evitar la desecación.
   6. Añadir inmediatamente 100 μL de las diluciones o medios de control correspondientes del compuesto de prueba a los pozos correspondientes.
   7. Incubar las placas tratadas durante 48 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
3. Protocolo de ensayo MTT
   1. Prepara una solución de 0,5 mg/mL de MTT en DMEM sin suero. Filtra a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm y protégelo de la luz.
   2. Tras el tratamiento de 48 horas, inspecciona visualmente las células para confirmar los efectos esperados del tratamiento.
   3. Aspira cuidadosamente el medio de las placas MTT. Añade 50 μL de la solución funcional MTT de 0,5 mg/mL a cada pozo.
   4. Incubar durante 3 horas a 37 °C, 5% de CO₂, protegido de la luz.
      NOTA: Aunque es común 2–4 horas, una incubación de 3 horas suele ser suficiente para las células Vero y HepG2. Optimiza si es necesario.
   5. Añade 100 μL de DMSO al 100% a cada pozo para disolver los cristales de formazan. Coloca las placas sobre un agitador orbital a 100 rpm durante 15 minutos, protegidas de la luz. Inspecciona los pozos de control para asegurar la disolución completa de cristales. Lee la absorbancia a 570 nm usando un lector de microplacas. Si está disponible, fija una longitud de onda de referencia de 630–690 nm.
4. Protocolo de Ensayo de Captación Neutral de Rojo (NRU)
   1. Prepara una solución de Rojo Neutro (NR) de 40 μg/mL en DMEM y filtro sin suero. Prepara la solución de desorción de NR: 1% (v/v) de ácido acético glacial, 49% (v/v) de etanol y 50% (v/v) de agua ultrapura.
      PRECAUCIÓN: El ácido acético glacial es corrosivo; Asa en una campana extractora.
   2. Después del tratamiento de 48 horas, inspecciona visualmente las células. Aspira cuidadosamente el medio de las placas NRU.
   3. Añade 100 μL de la solución de trabajo de 40 μg/mL NR a cada pozo. Incubar durante 2 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
      NOTA: Una incubación de 2 horas es suficiente para la máxima absorción de colorantes en estas líneas celulares.
   4. Aspira la solución de trabajo NR. Enjuaga suavemente cada pozo una vez con 150 μL de PBS estéril.
   5. Añade 150 μL de la solución de desorción NR a cada pozo. Colócala sobre un agitador orbital a 150 rpm durante 15 minutos para extraer el tinte.
   6. Inspecciona los pozos de control para asegurar la extracción completa del tinte. Lee la absorbancia a 540 nm usando un lector de microplacas.
5. Análisis de datos
   1. Realiza la resta de fondo calculando la absorbancia media de las columnas en blanco y restando este valor de todos los pozos.
   2. Realizar una comprobación de toxicidad de disolventes comparando pozos de control de disolventes con controles sin tratar. Si la viabilidad está por debajo de un umbral definido (por ejemplo, 80%), considera la citotoxicidad del disolvente.
   3. Calcular el porcentaje de viabilidad relativo a los pozos de control de disolventes:
      % de viabilidad = (absorbancia del pozo tratado / absorbancia media del control del disolvente) x 100.
   4. Graficar el % de viabilidad (eje y) contra_{logaritmate 10} de concentración de compuestos (eje x). Utiliza un modelo de regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidal, pendiente variable) para determinar CC₅₀.
   5. Calcula el Índice de Selectividad (SI) dividiendo CC₅₀ entre MIC.

Figura 3. Ejemplo de diseño de placas para el ensayo de viabilidad de células MTT/NRU, configuración temprana de cribado para comprobar la citotoxicidad de hasta 9 compuestos. (A) Esquema de diseño de placas. La columna 1 se asigna como "en blanco", sin celdas, y se llena con DPBS o medio completo. Las columnas 2 y 12 se siembran con células y se tratan con medios completos ("control sin tratar") o medios completos con disolvente ("control por disolvente"). Las columnas 3 a 11 se siembran con células y se tratan con diluciones en serie de los compuestos que se prueban, hasta 9 compuestos con una réplica por concentración testada por compuesto. (B) Fotografías representativas de una placa Vero NRU (arriba) y una placa Vero MTT (abajo) tras el tratamiento de 48 horas y los pasos finales del ensayo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

La síntesis produjo el compuesto objetivo 6 como sólido verde claro (0,53 g, rendimiento del 67%). El compuesto presenta un punto de fusión de 227–229 °C y una pureza UHPLC del 99% (t_R = 14,11 min) (Figura 4). La estructura química fue confirmada mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). El espectro RMN ^{de 1}H (Figura 5) mostró señales correspondientes a la mitad piperidina entre 1,50 y 3,13 ppm. El grupo metilo en la posición 2 apareció como un singlete típico a 2,38 ppm. El hidrógeno en la posición 3 apareció como un singlete a 6,56 ppm. El anillo fenílico mostraba dos dobletes a 6,97 y 7,17 ppm, con una constante de acoplamiento de 8,9 Hz. Los hidrógenos en las posiciones 7 y 8 generaban un multiplet a 7,63–7,75 ppm, mientras que el hidrógeno en la posición 5 del núcleo de quinolina producía un doblete a 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). El hidrógeno aminático se observó como un singlete a 8,66 ppm. El espectro RMN ^{de 13}°C (Figura 6) mostró una señal de 23,81 ppm atribuida al grupo metilo en la posición 2, mientras que las señales entre 24,85 y 49,70 ppm correspondían a la mitad piperidina. El carbono en la posición 3 apareció en 100,52 ppm. Las señales restantes a continuación se atribuyeron al núcleo de quinolina y a los carbonos del anillo fenilo. HRMS confirmó la fórmula molecular del compuesto 6, mostrando un ion [M+H^]+ en m/z 396.1063 (cálculo para C₂₁H₂₃BrN₃: 396.1070).

Figura 4. Cromatografía HPLC y espectros UV del compuesto 6. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5. ¹Espectros H RMN (400 MHz, DMSO-d6) del compuesto 6. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6. Espectros de RMN ^{de 13}C (101 MHz, DMSO-d6) del compuesto 6. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La actividad inhibitoria del compuesto frente a M. tuberculosis se evaluó determinando la CMI, definida como la concentración más baja de un compuesto que previene completamente el crecimiento bacteriano visible. En el ensayo REMA, la ausencia de cambio de color (permanecer azul) indica inhibición del crecimiento, mientras que un cambio al rosa indica crecimiento bacteriano. La isoniazida (INH) y la rifampicina (RIF) sirvieron como controles de drogas. Los resultados se presentan en la Figura 7. Cada placa incluía un control de crecimiento (columna 11, sin fármacos) y un control de esterilidad (columna 12, sin micobacterias). Los compuestos se diluyeron en serie desde la columna 10 (concentración más alta) hasta la columna 1 (concentración más baja). Como se muestra en la Figura 7, el valor de CMI para el compuesto de la fila A (isoniazida) se observa en la columna 4, mientras que los valores de CMI para los compuestos de las filas B (rifampicina) y C (compuesto sintetizado) se observan en la columna 5. En nuestras manos, los valores de CMI para INH son 0,31 μg/mL para la deformación H37Rv y 0,16 μg/mL para H37Ra, mientras que para RIF obtenemos 0,08 μg/mL para H37Rv y 0,01 μg/mL para la deformación H37Ra.

Figura 7. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CMI) en Mycobacterium tuberculosis mediante el ensayo de microplacas de resazurina (REMA). Filas A–C, columnas 1–10: Diluciones en serie dobles de isoniazida (fila A), rifampicina (fila B) y el compuesto sintetizado (fila C). Columna 11: Control de viabilidad (medio que contiene 2,5% de DMSO + bacterias). Columna 12: Control de esterilidad (medio + compuesto). Un color azul indica inhibición del crecimiento bacteriano, mientras que un color rosado indica viabilidad bacteriana debido a la reducción de resazurina a resorufín. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Una placa representativa de 96 pozos tanto para el ensayo NRU (Vero, arriba) como para el MTT (Vero, abajo) se muestra en la Figura 3B. En la placa MTT, se observa un gradiente de color claro, que pasa de translúcido (sin células viables) a altas concentraciones de compuestos a un púrpura intenso (alta viabilidad celular) a bajas concentraciones. De manera similar, la placa NRU muestra un gradiente de translúcido a rosa intenso, indicando la absorción del tinte rojo neutro en los lisosomas de las células viables.

La microscopía proporciona una confirmación visual del estado del ensayo tras el tiempo de incubación de 48 horas (Figura 8). La Figura 8A compara células de control sanas y no tratadas (Vero y HepG2) con células tratadas con una concentración citotóxica del compuesto. Las células tratadas parecen redondeadas, desprendidas e inviables. La Figura 8B proporciona un punto de control visual crítico antes del paso final de solubilización. Muestra la formación esperada de cristales de formazan de color púrpura oscuro dentro de células viables (ensayo MTT) y la acumulación de tinte rojo dentro de los lisosomas (ensayo NRU) en ambos tipos celulares.

Los datos de absorbancia en bruto se normalizaron al control del vehículo y se analizaron mediante regresión no lineal para generar curvas dosis-respuesta según se detalla en el paso 3.5 del protocolo. Para el compuesto objetivo 6 (derivado de LABIO-17), este análisis arrojó un CC₅₀ de 12,2 μM (Vero) y 18,3 μM (HepG2) en el ensayo NRU, y un CC₅₀ >20 μM para ambas líneas celulares en el ensayo MTT. Esto dio lugar a un índice de selectividad (IS) que oscilaba entre 30,5 y >50, como se había informado^{previamente de 10}.

Figura 8. Imágenes microscopísticas representativas de ensayos de citotoxicidad en células Vero y HepG2. Todas las imágenes se tomaron con una ampliación de 100x. (A) Comparación de la morfología celular tras 48 horas de tratamiento. Los pozos de control sin tratar para células Vero (arriba) y HepG2 (abajo) muestran una monocapa sana y confluente. En cambio, las células tratadas con una concentración citotóxica de un compuesto parecen redondeadas, encogidas y desprendidas de la superficie de la placa. (B) Puntos de control visuales críticos tras la adición de reactivos y antes de la solubilización. En el ensayo MTT (paneles izquierdos para cada línea celular), las células viables contienen cristales de formazan de color púrpura oscuro visibles. En el ensayo NRU (paneles derechos para cada línea celular), las células viables muestran una acumulación de colorante rojo dentro de lisosomas intactos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Un enfoque fenotípico de cribado, que se basa en la actividad celular completa en lugar de enzimas aisladas, es una estrategia eficaz para identificar compuestos activos contra M. tuberculosis. Aquí describimos los pasos iniciales de este enfoque, que abarcan la síntesis química de un compuesto candidato, la evaluación de su actividad inhibitoria mediante la determinación de concentración inhibidora mínima (CMI) y la evaluación de su citotoxicidad en células mamíferas (Vero y HepG2) mediante ensayos MTT y NRU.

La ruta sintética constaba de tres pasos principales (Figura 1), que proporcionaban el compuesto objetivo en alta pureza mediante transformaciones operativamente directas. Se identificaron varios pasos críticos como determinantes para la reproducibilidad y la eficiencia. La condensación inicial requiere un control estequiométrico preciso y un reflujo sostenido para asegurar una formación intermedia completa. La eliminación incompleta del disolvente antes de la ciclización térmica puede afectar negativamente la eficiencia del cierre del anillo. El propio paso de ciclización exige un control estricto de la temperatura, ya que un calentamiento insuficiente provoca una aromatización incompleta, mientras que un calentamiento excesivo o prolongado puede favorecer la formación de subproductos. Durante la cloración, se recomienda un control cuidadoso de la temperatura de reacción y la adición gradual de cloruro de fosforilo para minimizar las reacciones secundarias y asegurar la activación selectiva en la posición 4. Durante la optimización del método, pequeños ajustes procedimentales mejoraron la robustez. En casos de precipitación incompleta tras la ciclización, el enfriamiento gradual en lugar del temple rápido mejoró la recuperación de sólidos. Si se observaron rendimientos reducidos en la fase de sustitución nucleofílica, extender el tiempo de reacción o verificar la pureza de las aminas resultó beneficioso.

Las principales limitaciones del método son la necesidad de ciclización a alta temperatura y reactivos clorados corrosivos como el cloruro de fosforilo, que requieren infraestructuras y seguridad específicas de laboratorio. Los efectos electrónicos sustituyentes pueden requerir una nueva optimización para diferentes anilinas o aminas, limitando la amplia diversificación del andamiaje sin adaptación. Sin embargo, el enfoque Conrad–Limpach es operativamente más sencillo que las síntesis tipo Skraup (oxidantes agresivos) o los protocolos catalizados por metales de transición (catalizadores especializados/atmósferas inertes). Esta estrategia sin metales produce eficientemente intermediarios de quinolina funcionalizados para la química medicinal.

El protocolo utilizado para determinar la CIM es un ensayo colorimétrico que se basa en la inspección visual. Un posible desafío con este método es el cambio de color incompleto, que resulta en un pozo morado en lugar de azul distintivo (inhibición) o rosa (crecimiento). Si esto ocurre, debe interpretarse como un fallo en inhibir el crecimiento de micobacterias. Además, a medida que el compuesto se evalúa mediante dilución en serie, la concentración máxima testable está dictada por la solubilidad del compuesto. Como resultado, en algunos casos, el resultado puede ser inconcluso si no se observa inhibición en la concentración soluble máxima. Además, es importante reconocer que otros laboratorios pueden adaptar ciertos pasos del protocolo a sus condiciones específicas, lo que puede provocar variaciones en los resultados obtenidos. Para aumentar el rendimiento, este protocolo puede adaptarse para la automatización. Implementar sistemas de manipulación de líquidos para la preparación de placas de 96 pozos reduciría los errores de pipeteo, mejorando así la precisión y la reproducibilidad.

El protocolo de evaluación de citotoxicidad utiliza dos líneas celulares de mamíferos distintas (Vero y HepG2) y dos ensayos complementarios de viabilidad (MTT y NRU). Varios pasos dentro de este protocolo son fundamentales para garantizar la reproducibilidad y precisión de los datos, y cada laboratorio debe realizar su propia validación. Por ejemplo, la densidad inicial de siembra celular debe optimizarse cuidadosamente, ya que la sobreconfluencia puede provocar inhibición por contacto y alteraciones en estados metabólicos, confundiendo los resultados, mientras que la subsiembra puede hacer que las células sean más susceptibles a pequeños insultos, lo que puede sobreestimar la^{toxicidad 15}. Además, la concentración más alta testada suele estar limitada por la solubilidad del compuesto, y la precipitación puede dar lugar a resultados inexactos. Además, la disposición sugerida de placas (Figura 3A) está diseñada para el cribado primario, maximizando el número de compuestos probados al prescindir de réplicas técnicas e ignorar los efectos de borde en favor de la validación mediante réplicas biológicas independientes.

Una fortaleza clave de este protocolo es la implementación paralela tanto de ensayos MTT como NRU. Aunque ambos están bien establecidos, miden diferentes parámetros celulares. El ensayo MTT cuantifica la actividad metabólica de las deshidrogenasas mitocondriales, que generalmente se correlaciona con la viabilidad celular¹⁶. Sin embargo, este ensayo es susceptible a interferencias de compuestos con propiedades reductoras u oxidantes o aquellos que perturban la respiración mitocondrial, lo que puede dar lugar a posibles resultados^{falsos 15}. Ejecutar el ensayo NRU en paralelo ayuda a solucionar estos artefactos. El ensayo NRU mide la capacidad de las células viables para mantener la integridad lisosomal y los gradientes de pH necesarios para la absorción de^{tinte 17}. Las discrepancias entre los resultados de MTT y NRU pueden revelar mecanismos específicos de toxicidad, como la disfunción mitocondrial, lo que requiere una investigación más profunda.

En resumen, este protocolo detalla los pasos fundamentales para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos. Los compuestos que demuestran selectividad y potencia prometedoras pueden avanzar posteriormente hacia modelos de infección más complejos, como los estudios in vivo .

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LÍNEAS CELULARES
HepG2 (carcinoma hepatocelular humano)	ATCC	HB-8065	Línea celular de carcinoma hepático humano
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (riñón de mono verde africano)	ATCC	CCL-81	Línea celular epitelial de riñón de primate
QUÍMICOS – SÍNTESIS
4-(Piperidin-1-il)anilina	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Precursor de amina para el compuesto 5/6
4-Bromoanilina	Sigma-Aldrich	108-67-8	Material de partida para la síntesis de quinolín
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	695092	Reactivo en la síntesis y preparación de la fase móvil
Acetonitril (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34967	Componente de la fase móvil HPLC y solvente NMR
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432	Solvente para la extracción del producto
DMSO-d6 (deuteriado)	Sigma-Aldrich	175641	Solvente NMR
Dowtherm A (fluido de transferencia de calor)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Solvente de alto punto de ebullición para ciclización térmica (230–250 °C); anteriormente listado como Dowtherm® A
Etanol (absoluto)	Sigma-Aldrich	459836	Solvente de reacción para el paso Conrad–Limpach
Etil acetato (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	270989	Componente del eluyente de columna
Etil acetoacetato	Sigma-Aldrich	E12806	Reactivo ß-cetoéster para la formación del anillo de quinolín
Ácido fórmico (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	F0507	Aditivo al 0,1% en la fase móvil para HPLC y HRMS
Perlas de vidrio (1 mm, estériles)	Sigma-Aldrich	G8772	Para la homogeneización de la cultura de M. tuberculosis
HCl (ácido clorhídrico, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Catalizador ácido en la sustitución nucleofílica
Hexano (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34859	Eluente no polar para cromatografía en columna
Isopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Solvente de reacción para la síntesis del compuesto 6
Sulfato de magnesio (MgSO4, anhidro)	Sigma-Aldrich	M7506	Agente de secado y catalizador de reacción
Metanol (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34860	Fase móvil HPLC y componente del solvente NMR
Oxiclorofosforo(V) (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Reactivo de cloración para el intermedio 4
Piridina	Sigma-Aldrich	270970	Catalizador básico en la sustitución nucleofílica
Gel de sílice (35–70 malla) para cromatografía flash	Macherey-Nagel	815349	Fase estacionaria para pasos de cromatografía flash
Gel de sílice 60 Å (70–230 malla) para cromatografía en columna	Macherey-Nagel	815381	Fase estacionaria para cromatografía en columna
Sulfato de sodio (Na2SO4, anhidro)	Sigma-Aldrich	239313	Agente de secado para la fase orgánica
Placas de gel de sílice TLC 60 F254	Merck	1.05554	Monitoreo por cromatografía en capa delgada
Tolueno	Sigma-Aldrich	244511	Solvente para el paso de cloración
Agua ultrapura	Millipore / equivalente	N/A	Usado en la preparación de la fase móvil; anteriormente referenciado como agua Milli-Q en el texto
EQUIPAMIENTO & INSTRUMENTOS
Filtro de jeringa de 0,22 µm	Millipore / cualquier	SLGP033RS	Esterilización de la solución de resazurina (2.1.4); filtración de la solución de trabajo de MTT (3.3); filtración de la solución de trabajo de Neutral Red (3.4)
Filtro de jeringa de 0,45 µm	Millipore / cualquier	SLHA033SS	Filtración de las soluciones de la fase móvil
Tubo cónico de 15 mL (estéril)	Falcon / cualquier	352097 o equivalente	Recolección y centrifugación de la suspensión celular después de la tripsinización
Placa de 96 pocillos (fondo plano, tratada para cultivo de tejidos)	Corning / cualquier	3596	Para ensayos de citotoxicidad y MIC
Papel de aluminio	Cualquier	—	Protección contra la luz de las placas durante los pasos de incubación y agitación de MTT y NRU
Autoclave	Cualquier	—	Esterilización de los medios (121 °C, 98.07 kPa, 10 min)
Gabinete de bioseguridad (Clase II, certificado)	Cualquier (certificado BSL-3)	—	Requerido para manipulaciones de M. tuberculosis (BSL-3)
Contador de células (automatizado) o hemocitómetro	Ej., Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Para la determinación de concentración celular y viabilidad
Centrífuga (capaz de 200 × g)	Cualquier	—	Paso de sedimentación celular
Incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, humidificado)	Cualquier	—	Incubación para cultivo celular y tratamiento
Manto calefactor	Fisotom	12M	Manto calefactor con control de temperatura con Dowtherm® A
Sistema HPLC (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Inyector automático, detector UV, bomba doble; para el análisis de pureza del compuesto 6
Microscopio invertido (o equivalente)	Cualquier	—	Inspección visual de las células en el momento de adhesión (3.2), durante el punto de control de tratamiento (3.3, 3.4) y para la verificación del estado del ensayo
Agitador magnético / placa caliente	Cualquier	—	Preparación de soluciones y mezcla de reacciones
Espectrómetro de masas (