Cápsulas entéricas de cinco sabores de Sophora flavescens alivian la colitis experimental y los cambios relacionados con la ferroptosis

Resumen

En un modelo murino de colitis ulcerosa, las cápsulas de Sophora flavescens con recubrimiento entérico de cinco sabores aliviaron la lesión colónica y mejoraron el estrés oxidativo, el desequilibrio inflamatorio de las citocinas, la señalización JAK2/STAT3 y los cambios en los marcadores relacionados con la ferroptosis.

Resumen

La colitis ulcerosa sigue siendo difícil de manejar porque las opciones terapéuticas eficaces y dirigidas son limitadas, y el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria y las vías reguladas de muerte celular pueden contribuir a la lesión mucosa. Este estudio evaluó si las cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens alivian la colitis experimental y exploró los cambios asociados en el estrés oxidativo, la inflamación y los marcadores de la ferroptosis. Se estableció un modelo murino de colitis ulcerosa mediante exposición cíclica al 2,5% de sulfato de dextrán sodio, combinado con desafío alfa del factor de necrosis tumoral. Los ratones fueron tratados con FSSEC de dosis baja, media o alta o con el antagonista TLR4 CRX-526 como intervención de control positivo. La histopatología del colon fue evaluada mediante tinción de hematoxilina y eosina. Se midieron los niveles de superóxido sérico dismutasa, catalasa, glutatión, mieloperoxidasa y Fe²⁺ mediante ensayos bioquímicos. Las citocinas del tejido de colon se cuantificaron mediante ensayo inmunoenzimático vinculado, la expresión de JAK2 y STAT3 fue evaluada mediante inmunohistoquímica, y la expresión de GPX4, FTH1 y ACSL4 se analizaron mediante western bloting. El tratamiento con FSSEC redujo la lesión mucosa del colon y la infiltración de células inflamatorias, aumentó los índices antioxidantes y disminuyó los niveles de mieloperoxidasa. La FSEC también redujo los niveles de TNF-α e IL-1α, restauró parcialmente los niveles de IL-13 y se asoció con una inmunotinción más débil de JAK2 y STAT3. Paralelamente, FSEC mejoró los cambios en los marcadores relacionados con la ferroptosis, incluyendo la reducción de los niveles de Fe²⁺ y ACSL4 y el aumento de la expresión de GPX4 y FTH1. Estos hallazgos sugieren que la FSEC alivia la colitis ulcerosa experimental en ratones, al menos en parte mejorando el estado de estrés oxidativo, moderando la señalización inflamatoria y restaurando los perfiles de marcadores relacionados con la ferroptosis.

Introducción

La colitis ulcerosa (CU) es un trastorno inflamatorio crónico que afecta principalmente a la mucosa colónica y rectal y se caracteriza por episodios recurrentes de inflamación mucosa, ulceraciones y deterioro de la función de la^{barrera 1,2,3}. Aunque la susceptibilidad genética, los factores ambientales, la disfunción de la barrera epitelial y la desregulación inmunitaria se han implicado en la patogénesis de la CU, los mecanismos subyacentes a la lesión mucosa persistente siguen siendo incompletamente comprendidos. Los tratamientos farmacológicos actuales, incluidos aminosalicilatos, corticosteroides, inmunosupresores y agentes biológicos, pueden reducir la actividad de la enfermedad en muchos pacientes; Sin embargo, su uso clínico puede estar limitado por recaídas tras la interrupción del tratamiento, efectos adversos, alto coste y respuestas terapéuticas^{incompletas 3}.

La ferroptosis, una forma de muerte celular regulada dependiente del hierro caracterizada por la peroxidación lipídica y el metabolismo alterado del hierro, se ha implicado cada vez más en la inflamación intestinal y en la lesión epitelial asociada ^{a la CU} 4,5,6,7,8. Paralelamente, las formulaciones de medicina tradicional china han atraído cada vez más atención como enfoques complementarios para el tratamiento de la CU debido a su potencial terapéutico^{multi-objetivo 9}.

Las cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens se utilizan clínicamente para el tratamiento de la CU activa leve a moderada en la práctica de la medicina tradicional china. Estudios previos sugieren que la FSEC podría mejorar los síntomas de la CU mediante mecanismos multicomponente y^{multi-objetivo 10}. Sin embargo, los efectos de la FSEC sobre el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria, la actividad de JAK2/STAT3 y los cambios relacionados con la ferroptosis en la CU experimental siguen siendo insuficientemente caracterizados.

El estrés oxidativo y la señalización inflamatoria son factores importantes que contribuyen a la lesión mucosa intestinal en la CU. La producción excesiva de especies reactivas de oxígeno puede alterar la integridad epitelial, promover la infiltración de células inflamatorias y afectar los sistemas de defensa antioxidantes. Las vías mediadas por citoquinas, como la señalización JAK2/STAT3, contribuyen a la amplificación inflamatoria y a la lesión^tisular 11,12,13,14,15. Además, el estrés oxidativo y la ferroptosis están estrechamente relacionados mediante alteraciones en las defensas antioxidantes, el metabolismo del hierro y la peroxidación^lipídica 16,17,18,19,20. Por lo tanto, la evaluación simultánea de índices de estrés oxidativo, citocinas inflamatorias, señalización JAK2/STAT3 y marcadores relacionados con la ferroptosis puede proporcionar una comprensión más completa de la lesión mucosa y las respuestas terapéuticas en la CU experimental.

En el presente estudio, se utilizó un modelo murino alfa-desafiado con factor alfa-desafiado con sulfato de dextrano de sodio y necrosis tumoral para evaluar los efectos de FSET en dosis bajas, medias y altas. Una fortaleza metodológica clave de este diseño es la integración de la evaluación histopatológica con mediciones de índices de estrés oxidativo sérico, citocinas del tejido de colon, inmunohistoquímica JAK2/STAT3 y análisis de western blot de proteínas relacionadas con la ferroptosis dentro de un único marco experimental. Este enfoque se utilizó para determinar si la FSEC alivia la CU experimental y para caracterizar los cambios asociados en el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria y los perfiles de marcadores relacionados con la ferroptosis. El diseño experimental general y el flujo de trabajo analítico se resumen en la Figura 1.

Figura 1: Flujo de trabajo experimental del modelo de ratón y análisis posteriores. La colitis ulcerosa experimental crónica fue inducida por exposición cíclica al 2,5% de sulfato de dextrán sódico (DSS) combinada con el desafío del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) durante la última semana del protocolo experimental. Los ratones fueron asignados a grupos de control normal, modelo, FSC de baja dosis, FSAC de dosis media, FSAC de dosis alta y CRX-526 de control positivo. La FSEC se administró por gavage intragástrico en dosis de 108, 216 o 432 mg/kg de peso corporal. CRX-526 se utilizó como intervención de control positivo. Tras el tratamiento final, se recogieron muestras para evaluación histopatológica, ensayos bioquímicos relacionados con el estrés oxidativo, análisis de citocinas mediante ELISA, inmunohistoquímica y análisis de western blot. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Bienestar Animal y Ética del Colegio Médico de Nanchang (nº de aprobación). NY2SC 20250407). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los productos químicos, reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Animales y tratamiento

En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J (tipo salvaje, 8 semanas). Los animales se alojaban bajo condiciones estándar de laboratorio con temperatura y humedad controladas y se les proporcionaba acceso libre a comida y agua. Tras la aclimatación, se indujo colitis crónica administrando tres ciclos de dextrano sulfato sódico (DSS) al 2,5% en el agua potable. Cada ciclo duraba 1 semana y estaba separado por un periodo de recuperación de 2 semanas con agua potable regularmente. Durante la última semana del protocolo experimental, los ratones de los grupos modelo y de tratamiento recibieron factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α; 10 μg/100 g de peso corporal, dos veces al día) mediante gavage intragástrico para agravar aún más la lesión colónica. Los ratones de control normal recibieron solo vehículo y no estuvieron expuestos a DSS ni TNF-α.

Las cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens se utilizaron como un medicamento patentado chino comercializado y aprobado. La formulación contenía Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., y Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. El contenido de las cápsulas del mismo lote de producción se pesaba y suspendía en agua destilada estéril para preparar suspensiones de dosificación frescas antes de su administración. Las suspensiones se mezclaban cuidadosamente antes de cada gavage para asegurar una dispersión uniforme. La fuente del producto, el número de aprobación, las especificaciones farmacéuticas y la información sobre control de calidad se proporcionan en la Tabla de Materiales. La calidad del producto se describió de acuerdo con la especificación farmacéutica aprobada y la información proporcionada por el fabricante, incluyendo especificaciones de cápsulas, apariencia, requisitos de liberación y desintegración enterica, requisitos de límite microbiano y estándares de control de calidad.

Los ratones tratados con FSC recibieron FSEC en dosis bajas (108 mg/kg de peso corporal), FSEC de dosis media (216 mg/kg de peso corporal) o FSEC de dosis altas (432 mg/kg de peso corporal) por gavage intragástrico dos veces al día durante la última semana de modelado. Los niveles de dosis se seleccionaron en función de la dosis clínica aprobada, la conversión de área de superficie corporal y consideraciones preliminares de rango de dosis. Los ratones tratados con vehículo recibieron el mismo volumen de agua destilada estéril por gavage intragástrica.

El grupo control positivo recibió el antagonista TLR4 CRX-526 a 1 mg/kg mediante inyección en la vena caudal durante la última semana de modelado. CRX-526 se utilizó como intervención antiinflamatoria de referencia. El estudio incluyó seis grupos (n = 6 por grupo): grupo control normal, modelo, FSC de baja dosis, FSC de dosis media, FSQ de dosis alta y CRX-526 grupo control positivo. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después del último tratamiento del estudio. La eutanasia se realizó mediante dislocación cervical bajo anestesia isoflurana, de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

2. Evaluación histológica mediante tinción de hematoxilina y eosina

Se recogieron tejidos de colon de la región más afectada macroscópicamente entre el ano y la zona ileocecal. Para cada ratón, un segmento representativo de colon de esta región fue fijado en formol tampón neutro al 10%, incrustado en parafina, seccionado y teñido con hematoxilina y eosina. Para la evaluación histológica, se prepararon al menos tres secciones de cada animal y se examinaron cinco campos de alta potencia no solapados por sección. Los campos se seleccionaron sistemáticamente al azar escaneando la sección de un borde al otro, evitando áreas rasgadas, dobladas o con malas manchas. Los cambios histopatológicos, incluyendo ulceración mucosa, destrucción glandular, congestión e infiltración de células inflamatorias, fueron evaluados mediante microscopía óptica.

3. Medición de indicadores bioquímicos relacionados con el estrés oxidativo

Se recogieron muestras de sangre (0,5 mL) en tubos con anticoagulantes y centrifugadas aproximadamente a 1160 × g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y utilizó para medir los niveles de hierro sérico, superóxido dismutasa (SOD), glutatión (GSH), catalasa (CAT) y mieloperoxidasa (MPO) utilizando los correspondientes kits de ensayo listados en la Tabla de Materiales según las instrucciones del fabricante.

4. Análisis inmunohistoquímico de JAK2 y STAT3

Las secciones de tejido de colon incrustadas en parafina (5 μm) se desparafinizaron en xileno, se rehidrataron mediante una serie de etanol graduado y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato. La extracción de antígenos se realizó en un tampón de citrato (pH 6,0) mediante calentamiento por microondas. Tras enfriarse a temperatura ambiente, la actividad endógena de la peroxidasa se bloqueó con un 3% de H₂O₂ durante 10 minutos. Las secciones se bloquearon con suero normal de cabra al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra JAK2 y STAT3 en diluciones de 1:50 y 1:80, respectivamente. Tras lavados salinos tamponados con fosfato, se incubaron secciones con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante según las instrucciones del fabricante. Las señales inmunorreactivas se visualizaron usando 3,3′-diaminobenzidina, y los núcleos se contracoloraron con hematoxilina. Las secciones se deshidrataron, montaron y examinaron bajo un microscopio óptico.

5. Cuantificación de citocinas mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Los tejidos del colon se cortaron en trozos de 2–^{3 mm,} se homogeneizaron sobre hielo en solución salina tamponada con fosfato y se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Se recogió el sobrenadante y se midieron las concentraciones de TNF-α, IL-1α e IL-13 utilizando los correspondientes kits ELISA según las instrucciones del fabricante. Los valores de absorbancia se midieron usando un lector de microplacas y las concentraciones de citocinas se calcularon a partir de curvas estándar generadas para cada ensayo.

6. Análisis por Western blot de proteínas relacionadas con la ferroptosis

Se extrajeron proteínas totales de los tejidos del colon y se determinaron las concentraciones de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico. Cantidades iguales de proteína de cada muestra se separaron con SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas. Tras bloquear con leche desnatada al 5% o un tampón bloqueador equivalente durante 2 horas a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra GPX4, FTH1, ACSL4 y la proteína de control de carga β-actina, según se indica en la Tabla de Materiales. Al día siguiente, las membranas se lavaron e incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante correspondiente durante 2 horas a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente y se fotografiaron mediante un sistema de imagen quimioluminiscencia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software de densitometría. Los niveles de expresión de GPX4, FTH1 y ACSL4 se normalizaron a β-actina, y se calculó la expresión relativa de proteínas para análisis estadístico.

7. Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). Se realizaron comparaciones entre varios grupos utilizando análisis unidireccional de la varianza, seguidos por la prueba post hoc de Bonferroni cuando se cumplieron las suposiciones de normalidad y homogeneidad de la varianza. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.

Resultados

FSEC alivia la lesión histopatológica y mejora los índices relacionados con el estrés oxidativo en ratones con colitis ulcerosa
Como se muestra en la Figura 2, el grupo control normal mostró una arquitectura mucosa del colon intacta, con glándulas bien organizadas y mínima infiltración celular inflamatoria. En contraste, el grupo modelo mostró lesión mucosa grave caracterizada por alteración epitelial, ulceración mucosa, destrucción gland...

Discusión

Este estudio investigó los efectos de las cápsulas entéricas (FSEC) de cinco sabores de Sophora flavescens en un modelo murino de colitis ulcerosa experimental (CU) y evaluó los cambios asociados en los índices relacionados con el estrés oxidativo, citocinas inflamatorias, señalización JAK2/STAT3 y marcadores relacionados con la ferroptosis. Los principales hallazgos fueron que el tratamiento con FSEC alivió la lesión histopatológica del colon, mejoró los índices bioquímicos rel...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Sustituto cromogénico para inmunohistoquímica basada en HRP.
Anticuerpo ACSL4 (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Anticuerpo primario monoclonal de ratón para western blot; utilizado a 1:500; RRID: AB_10842002.
Solución de recuperación de antígeno, tampón citrato, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Tampon de recuperación de epítopo inducido por calor para inmunohistoquímica de sección de parafina.
Kit de ensayo de proteína BCA	Beyotime Biotechnology	P0012	Cuantificación de proteínas antes del western blotting.
Ratas C57BL/6J	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Ratas SPF macho, de 8 semanas de edad; fuente animal consistente con los materiales de aprobación ética presentados.
Kit de ensayo de catalasa (CAT)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Kit colorimétrico para la medición de la actividad de CAT en suero.
Sistema de imagen ChemiDoc XRS+	Bio-Rad Laboratories	1708265	Sistema de imagen por quimioluminiscencia para la detección de western blot.
CRX-526	TargetMol	T27090	Antagonista de TLR4 utilizado como la intervención de control positivo; número CAS 245515-64-4.
Sulfato de dextrano de sodio (DSS), grado colitis	MP Biomedicals	160110	DSS, grado colitis, peso molecular 36,000–50,000 Da; utilizado al 2.5% en agua potable.
Sustituto quimioluminiscente ECL	Bio-Rad Laboratories	1705061	Sustituto Clarity Western ECL para la detección de la señal de western blot basada en HRP.
Kit ELISA, IL-13 de ratón	Abcam	ab219634	Kit ELISA colorimétrico sandwich para la cuantificación de IL-13 de ratón; lectura a 450 nm.
Kit ELISA, IL-1α de ratón	Abcam	ab199076	Kit ELISA colorimétrico sandwich para la cuantificación de IL-1α de ratón; lectura a 450 nm.
Kit ELISA, TNF-α de ratón	Abcam	ab208348	Kit ELISA colorimétrico sandwich para la cuantificación de TNF-α de ratón; lectura a 450 nm.
Etanol, absoluto	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Utilizado para el procesamiento de tejidos, deshidratación y preparación de reactivos.
Kit de ensayo de hierro ferroso (Fe2+)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Kit colorimétrico para la medición de Fe2+ en muestras de suero o tejido.
Cápsulas entéricas de cinco sabores de Sophora flavescens	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	Número de aprobación NMPA Z20150002	Medicina patentada china; 0.4 g/cápsula; la formulación incluye Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., y Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; especificación farmacéutica YBZ00152015
Kit de ensayo de glutatión (GSH)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Kit de ensayo de glutatión reducido para la medición de GSH en suero.
Anticuerpo GPX4 (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Anticuerpo primario monoclonal de ratón para western blot; utilizado a 1:500; RRID: no listado en la hoja de datos del proveedor.
Kit de tinción de hematoxilina y eosina	Solarbio	G1120	Tinción H&E de secciones de tejido de colon embebidas en parafina.
Anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Anticuerpo secundario para western blot; utilizado a 1:50,000; RRID: AB_631736.
Software ImageJ	Institutos Nacionales de Salud	Versión 1.54	Software de análisis de imágenes y densitometría utilizado para la cuantificación de bandas de western blot.
Kit de detección de inmunohistoquímica	ZSGB-BIO	PV-9000	Kit de detección HRP basado en polímeros para inmunohistoquímica de sección de parafina.
Anticuerpo JAK2 (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Anticuerpo primario monoclonal de conejo para inmunohistoquímica de JAK2 en secciones de parafina; RRID: AB_2128522.
Lector de microplacas	BioTek Instruments	Synergy H1	Lector de placas para la medición de absorbancia ELISA a 450 nm.
Kit de ensayo de actividad de mioperoxidasa (MPO)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Kit colorimétrico para la medición de la actividad de MPO en suero.
Formalina tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fijación del tejido de colon antes de la inclusión en parafina.
Suero de cabra normal	Solarbio	SL038	Reactivo de bloqueo para inmunohistoquímica.
Parafina	Leica Biosystems	39601006	Medio de inclusión para el procesamiento del tejido de colon.
Salinas tamponadas con fosfato (PBS)	Solarbio	P1020	Tampon para homogeneización de tejidos, lavado y procedimientos de inmunotinción.
Membrana PVDF	MilliporeSigma	IPVH00010	Membrana de transferencia de proteínas para western blotting.
Proteína recombinante de TNF-α de ratón	R&D Systems	410-MT	TNF-α recombinante de ratón utilizado para el desafío inflamatorio de la última semana.
Sistema de SDS-PAGE y transferencia	Bio-Rad Laboratories	1658004	Sistema Mini-PROTEAN Tetra para el flujo de trabajo de SDS-PAGE y transferencia de western blot.
Software SPSS Statistics	IBM	Versión 24.0	Software de análisis estadístico para ANOVA de una vía y pruebas post-hoc de Bonferroni.
Anticuerpo STAT3 (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Anticuerpo primario monoclonal de ratón para inmunohistoquímica de STAT3; RRID: AB_331757.
Kit de ensayo de superóxido dismutasa (SOD)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	Kit del método WST-1 para la medición de la actividad de SOD en suero.
Xileno	Sinopharm Chemical Reagent