Generación de estructuras organoides organoides derivadas de células madre mesenquimales derivadas de islotes de médula ósea a partir de tejido pancreático fresco

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para diferenciar las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) en estructuras organoides similares a islotes pancreáticos utilizando lisado de tejido pancreático porcina. Las estructuras organoides se forman tras 22 días. Este método sencillo y rentable produce estructuras morfológicamente similares a las de los islotes pancreáticos para estudios in vitro y cribado de fármacos.

Resumen

Como una enfermedad crónica prevalente en todo el mundo, la diabetes mellitus (DM) se caracteriza por una alteración del equilibrio de glucosa en el cuerpo. En la diabetes mellitus tipo 1 (DT1), las respuestas autoinmunes destruyen por completo las células β pancreáticas, lo que resulta en insuficiencia total de insulina. Los pacientes con esta condición necesitan tratamiento suplementario de insulina de por vida. El presente estudio pretende crear una plataforma de cultivo fiable y económica para generar estructuras organoides de islotes pancreáticos a partir de células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC). Esta plataforma no solo puede aliviar la escasez de islotes donantes para trasplantes, sino que también puede servir como modelo in vitro para la investigación relacionada con la diabetes.

Optimizando el proceso de preparación del lisado de tejido pancreático porcino (centrifugación a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4 °C, seguida de una filtración de 0,22 μm para esterilización), se indujeron con éxito los BMSC para diferenciarse en estructuras organoides similares a islotes pancreáticos. La validación morfológica confirmó que solo los BMSC inducidos formaban agregados compactos, rechonchos y altamente transparentes similares a islotes, mientras que los BMSC no inducidos exhibían una vacuolización significativa y una transparencia reducida.

La monitorización dinámica mostró que los agregados celulares (de 50–100 μm de diámetro) se formaron en el día 16 de cultivo y evolucionaron hacia estructuras en forma de cápsula (de 200–300 μm de diámetro) para el día 22. Este método es sencillo de operar, rentable y no requiere equipos complejos. Los organoides resultantes son morfológicamente similares a los islotes pancreáticos, proporcionando una herramienta para estudios in vitro y cribado de fármacos relacionados.

Introducción

Como sistemas modelo in vitro tridimensionales (3D), las estructuras organoides de islotes pancreáticos han surgido como herramientas cruciales en la investigación sobre la diabetes y la medicina regenerativa, debido a su capacidad para imitar estrechamente la composición multicelular y la estructura espacial de los islotes pancreáticos^{nativos 1}. Estos modelos no solo proporcionan una plataforma única para comprender la biología del desarrollo de los islotes y los mecanismos patológicos de la diabetes ^2,3, sino que también apoyan el desarrollo de terapias de reemplazo celular y sistemas de cribado de^{fármacos 4}. Con la prevalencia global de la diabetes en constante aumento —especialmente la deficiencia absoluta de insulina causada por daño irreversible a las células β en la diabetes tipo 1— la terapia convencional de reemplazo de insulina puede controlar los síntomas pero no curar la enfermedad. Mientras tanto, el trasplante de islotes enfrenta una grave escasez de donantes, lo que convierte el desarrollo de fuentes alternativas escalables para islotes una prioridad^{urgente 1,5}. Aprovechando el potencial de diferenciación dirigida de las células madre pluripotentes o adultas, la tecnología similar a organoides de islotes pancreáticos puede ayudar a abordar esta^{limitación 6,7,8}.

En los últimos años, se han logrado avances significativos en sistemas de cultivo organoides similares a islotes pancreáticos basados en células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs^). Múltiples estudios han confirmado que, optimizando los protocolos de inducción y las condiciones de cultivo, las células madre pueden diferenciarse en células similares a islotes con funciones de secreción de insulina sensibles^{a la glucosa 10}. Los avances en la tecnología de reprogramación química han permitido la generación de hiPSCs sin manipulación genética, mejorando el potencial^{traslacional 11}. En cuanto a sistemas de cultivo, el cultivo 3D combinado con combinaciones específicas de matriz extracelular y factores de crecimiento puede promover la autoorganización de las células precursoras de islotes en estructuras organoides compuestas por células α, β y δ¹². Sin embargo, las tecnologías existentes aún enfrentan numerosos desafíos, incluyendo una eficiencia de diferenciación inestable, una maduración funcional insuficiente y la falta de redes vasculares y microambientes inmunitarios — factores limitantes^{clave 13} que limitan una aplicación más amplia.

A pesar de los avances en la investigación sobre estructuras organoides similares a islotes pancreáticos, quedan por abordar varios temas científicos críticos en este^campo. En primer lugar, la falta de definiciones estandarizadas de organoides y procedimientos de construcción dificulta la comparación directa de los resultados entre diferentes^{laboratorios 15}. Segundo, los sistemas actuales de cultivo no pueden replicar completamente la compleja composición celular y la disposición espacial precisa de los islotes pancreáticos^{nativos 16}. Tercero, cuestiones fundamentales como la estabilidad funcional durante el cultivo de organoides a largo plazo y la supervivencia tras el trasplante siguen siendo insuficientemente^{caracterizadas 17}. Además, la mayoría de los protocolos existentes siguen dependiendo de materiales matriciales de origen animal, que sufren de una composición indefinida y de una gran variación de lote a lote, lo que dificulta el control de calidad para aplicaciones^{clínicas 18}. Estas carencias de conocimiento y técnicas dificultan seriamente la trasladación de estructuras organoides similares a islotes pancreáticos de la investigación básica a la práctica clínica.

Este protocolo está diseñado para construir un enfoque estable, asequible y repetible para generar construcciones organoides similares a islotes pancreáticos utilizando células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC). El método establecido está destinado a la investigación experimental de laboratorio y a aplicaciones preclínicas de cribado de fármacos. Las estrategias actuales para la diferenciación de islotes inducidas por BMSC sufren múltiples limitaciones, incluyendo costes excesivos, estándares operativos inconsistentes y aplicabilidad limitada. La mayoría de los sistemas de inducción existentes dependen de costosas citocinas recombinantes, matrices profesionales de cultivo y dispositivos de cultivo de alta precisión, lo que limita considerablemente su uso generalizado. Para resolver estos inconvenientes, el protocolo actual adopta el lisado de tejido pancreático porcino como factor de inducción central. Esta estrategia de cultivo optimizada y simplificada permite la diferenciación eficiente de los BMSC en estructuras similares a islotes, utilizando solo equipos y condiciones de laboratorio rutinarios.

En comparación con los métodos convencionales que dependen de hESCs, iPSCs o cócteles de factores de crecimiento de alto coste, la estrategia actual ofrece varias ventajas prácticas claras. Elimina la necesidad de reactivos costosos y montajes complejos de cultivo, reduce los costes experimentales y permite resultados consistentes con una variabilidad mínima entre^lotes 10,11,12,13. A diferencia de los sistemas basados en matrices xenogénicas, este protocolo utiliza un lisado tisular simplificado, mejorando la controlabilidad experimental y la reproducibilidad en los^{laboratorios 15, 16, 17 y 18}. Además, las BMSC son fácilmente accesibles, estables en cultivo y libres de restricciones éticas asociadas a las células madre pluripotentes, lo que hace que este enfoque sea especialmente adecuado para el uso rutinario en laboratorio.

Los enfoques de investigación existentes están polarizados en el campo de la modelización de organoides pancreáticos: las plataformas organoides avanzadas para la transformación clínica son costosas y técnicamente complejas, mientras que los modelos alternativos simplificados no permiten un análisis funcional profundo. El protocolo propuesto en este trabajo cubre esta brecha de investigación al ofrecer un esquema técnico estandarizado e intermedio. Este enfoque preserva las propiedades fisiológicas fundamentales de los islotes pancreáticos y es totalmente compatible con los entornos convencionales de laboratorio básico. Sirve como una herramienta práctica para investigadores que se centran en los mecanismos de desarrollo de islotes, modelado de enfermedades diabéticas y evaluación preliminar de candidatos a fármacos, especialmente para equipos equipados con infraestructura rutinaria de cultivo celular pero que carecen de plataformas profesionales de cultivo de células madre. Aunque este método no puede generar organoides totalmente vascularizados o inmunológicamente competentes para investigaciones avanzadas específicas, es muy adecuado para el cribado experimental preliminar, la exploración mecanicista y la formación académica en investigación biológica en islotes.

Este trabajo se centra en construir un sistema de cultivo económico y estandarizado para estructuras organoides de islotes pancreáticos, con el objetivo de ofrecer un modelo de investigación tridimensional creíble para estudios relacionados con la diabetes. Al analizar sistemáticamente cómo la diversidad de regímenes de inducción y ambientes de cultivo afectan la eficiencia de formación de organoides y las características morfológicas, esta investigación intenta superar los principales obstáculos técnicos que limitan el progreso en este campo. Los objetivos principales de la investigación abarcan tres aspectos clave: establecer un protocolo universal de cultivo aplicable a laboratorios básicos ordinarios sin instrumentos sofisticados, formular estándares cuantitativos de evaluación para evaluar la calidad de los organoides y optimizar las estrategias de cultivo para mantener la estabilidad morfológica y funcional de los organoides durante la incubación a largo plazo. Los hallazgos de este estudio pueden proporcionar un sólido apoyo técnico para la exploración experimental in vitro, al tiempo que construyen un modelo práctico y fiable para la investigación sobre los mecanismos de desarrollo de islotes y el cribado de fármacos hipoglucémicos.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se ajustaron a las directrices para el bienestar de animales de laboratorio aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Guangxi (Nº de aprobación: SYXK 2014-0003), y cumplieron con los códigos éticos para el cuidado y uso animal especificados en los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica que Involucre a Animales, formulados por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS).

Todas las operaciones que impliquen procesamiento de tejidos y preparación de reactivos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de Clase II para evitar la contaminación. Permitir al menos 8 horas para completar el procesamiento de tejido fresco y la preparación del inductor de estructura organoide similar a un organoide de islotes pancreáticos. Mantén todas las muestras y reactivos en hielo durante todo el experimento.

1. Preparación experimental

1. Eutanasiar a ratas lactantes Sprague Dawley (SD) de 7 días mediante dislocación cervical. Anestesiar a los cerdos domésticos mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico a una dosis de 20 mg/kg, y confirmar una anestesia adecuada mediante la desaparición del reflejo de retirada del pedal y la estabilidad de la frecuencia respiratoria.
2. Procesar tejido pancreático porcino en un armario de bioseguridad de Clase II bajo condiciones estériles. Procesar tejido pancreático porcino fresco en un plazo de 24 horas tras la recogida. Almacenar las muestras de tejido recogidas a 4 °C en un medio DMEM completo (como se muestra en la Tabla 1) hasta el procesamiento.
3. Preajusta la centrifugadora refrigerada a 4 °C y selecciona el modo de centrifugación a baja velocidad para evitar dañar las preparaciones de celdas. Guarda puntas de pipeta de 1000 μL, de 200 μL y tubos de centrífuga de 50 mL en un congelador a −20 °C hasta su uso en el experimento. Prepare suficientes filtros estériles de 0,22 μm y jeringuillas estériles desechables de 20 mL. Esteriliza tijeras oftálmicas, pinzas curvas, placas de Petri de cristal y ampollas mediante autoclavado a alta temperatura (121 °C, 20 min).
4. Antes del uso experimental, se aplica alicuota del tejido pancreático completamente preparado. Para lograr una consistencia experimental óptima, se pipeten 100 μL del homogeneado en tubos microcentrífugas individuales de 1,5 mL para almacenamiento y uso posterior por separado.

2. Procesamiento de tejido pancreático fresco para preparar un inductor de estructura similar a un organoide de islote pancreático

1. Cosecha muestras frescas de páncreas porcinas y transfírelas inmediatamente a hielo seco para mantener la bioactividad tisular. Los tejidos adquiridos se enjuagan repetidamente con solución fisiológica normal estéril mediante pipeteo. Tras los primeros pasos de limpieza, se utilizan 3 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para un lavado exhaustivo adicional y eliminar completamente las manchas residuales de sangre y contaminantes de tejido.
2. Retira y elimina cualquier líquido residual de las placas de cultivo estériles, luego complementa las placas con 2 mL de medio DMEM. Los tejidos pancreáticos pretratados se trituran en fragmentos uniformes de 1 mm³ con tijeras oftálmicas estériles (Figura 1A,B). Todos los trozos de tejido picados se reúnen en un tubo centrífuga de 50 mL, seguido de un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo durante 10 veces para lograr una mezcla homogénea.
3. La homogeneización tisular se realiza con un mano de vidrio estéril (Figura 1C). Durante el proceso de molienda, los fragmentos de tejido pancreático se mezclan uniformemente con el medio DMEM en una proporción de volumen de 1:1. La suspensión de tejido totalmente homogeneizada se transfiere a un tubo centrífuga de 50 mL y se somete a centrifugación refrigerada de alta velocidad a 21.600 × g durante 30 minutos bajo condiciones de 4 °C.
4. Tras la centrifugación, el sobrenadante clarificado se extrae lentamente con una pipeta estéril. El sobrenadante extraído pasa luego por un filtro estéril de 0,22 μm para eliminar pequeños restos tisulares e impurezas no disueltas (Figura 1D). El líquido purificado se divide finalmente en tubos microcentrífugas de 1,5 mL con un volumen fijo de 100 μL por tubo para su preservación sellada y los experimentos posteriores (Figura 1E).
5. Almacena el inductor de estructura organoide tipo islote pancreático alocado a −20 °C.
   NOTA: El inductor permanece estable durante 1 año bajo condiciones adecuadas de almacenamiento. Evalúa la actividad de inducción del lisado preparado mediante inspección visual e inducción funcional. Identificar lisado activo por su aspecto claro y rosa pálido sin precipitación evidente; reconocer la pérdida de actividad por precipitación visible y la falta de inducción de la formación típica de organoides de islotes.

3. Preparación del medio de inducción

1. Prepara el medio de inducción fresco justo antes de las operaciones de cultivo celular. Combinar el inductor organoide de islotes pancreáticos preparado por él mismo con un medio DMEM de alta glucosa que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS-H-DMEM) estrictamente de acuerdo con la proporción indicada en la Tabla 1.
2. Colocar las muestras de organoides pancreáticos cultivadas en una incubadora celular mantenida a una temperatura constante de 37 °C con un 5% de saturación de CO₂ para un cultivo continuo.

4. Observación morfológica y monitorización del crecimiento de organoides

1. La observación microscópica se realiza en los momentos programados durante todo el periodo de cultivo, incluyendo el día 1, día 3, día 7, día 10 y día 15 después de la siembra celular.
2. Se utiliza un microscopio óptico para seguir los cambios morfológicos, las condiciones de crecimiento y la viabilidad celular de las estructuras organoides pancreáticas durante cada sesión de detección, con el fin de registrar las características dinámicas de crecimiento de los constructos.

5. Paso y criopreservación de organoides

1. Paso de semillas 3 BMSC a una densidad de 1 × 10⁵ células por pozo en placas de cultivo de 6 pozos y cultivo en medio completo durante la noche para permitir la unión celular antes de la inducción.
2. Añade 1 mL de tripsina que contiene 0,02% de EDTA al sistema de cultivo. Calipea suavemente la superficie del plato de cultivo 5–8 veces para desprender los organoides pancreáticos del recipiente.
3. Añadir 2 mL de medio H-DMEM-F12 al 10% para terminar la digestión de tripsina. Centrifuga la mezcla a 1.500 × g durante 5 minutos a 4 °C usando una centrífuga refrigerada. Aspira y desecha el sobrenadante tras centrifugar.
4. Añade el doble de volumen de medio fresco al 10% FBS-H-DMEM al pellet celular para lograr una relación de paso 1:2.
5. Realizar la criopreservación de cultivos organoides de la siguiente manera: Resuspender el pastillo celular obtenido en 1 mL de solución de criopreservación sin suero. Almacene los organoides resuspendidos a −80 °C para su conservación a corto plazo (hasta 1 año) y en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Ajusta el volumen del medio fresco para conseguir diferentes proporciones de pasajes. Por ejemplo, usa el mismo volumen de medio que el volumen inicial para un pasaje 1:1, o añade 3 veces el volumen inicial del medio para un pasaje 1:3.

Resultados

Registrar la dinámica de crecimiento de las culturas organoides similares a islotes pancreáticos a lo largo del tiempo es crucial, especialmente en las primeras semanas de cultivo, ya que permite predecir el rendimiento del sistema de cultivo en experimentos posteriores. La Figura 2 muestra un ejemplo de cultivo de 22 días, donde las BMSC fueron aisladas eficientemente de la médula ósea de ratas lactantes de 7 días y utilizadas con éxito p...

Discusión

La diabetes mellitus es un trastorno metabólico global, principalmente clasificado en diabetes mellitus tipo 1 (DT1) y diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destrucción selectiva de las células β pancreáticas, lo que resulta en una deficiencia absoluta de insulina¹⁹. Los pacientes requieren terapia con insulina exógena de por vida, pero aún enfrentan riesgos de hipoglucemia grave y complicaciones

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 & mu; Filtro estéril m	Merck Millipore	SLGP033RB	Filtración estéril del lisato del tejido pancreático para eliminar impurezas y residuos
0,25% de tripsina (dentro del 0,02% de EDTA)	Wisent	325-043-CL	Disociación leve de organoides de islotes pancreáticos para operación de paso
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL	Axígeno de Corning	AXY-20-1500	Aliquotación y almacenamiento del lisato de tejido pancreático (100 & mu; L por tubo)
10 & mu; Puntas de la L Pipeta	Eppendorf	22491653	Transferencia líquida para anticuerpos y soluciones enzimáticas de pequeño volumen
1000 y mu; Puntas de la L Pipeta	Eppendorf	22491651	Transferencia de líquidos para reactivos y suspensiones de celdas
-20º; Congelador	Haier	HYC-326	Almacenamiento de reactivos (por ejemplo, FBS, tripsina) y puntas de pipeta
200 & mu; Puntas de la L Pipeta	Eppendorf	22491652	Transferencia precisa de líquidos para reactivos de pequeño volumen (por ejemplo, alicotización de lisato)
10 & mu; Puntas de la L Pipeta	Haier	DW-86L626	Almacenamiento a largo plazo del lisado de tejido pancreático y organoides criopreservados
Tubos centrífugos de 50 mL	Corning	430829	Centrifugación a alta velocidad y baja temperatura del lisado de tejido pancreático y suspensión celular
Placas de cultivo de 6 pozos	Corning	3516	Cultivo de organoides de islotes pancreáticos y BMSC
Armario de Bioseguridad Clase II	Haier	HR40-IIA2	Procesamiento estéril de tejido pancreático porcino y operaciones de cultivo de organoides
Incubadora CO2	Thermo Fisher Scientific	3111	Incubación de organoides de islotes pancreáticos a 37°C; C, 5% CO2 medio ambiente
Pinzas curvas	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1302	Manipulación del tejido pancreático durante el procesamiento, esterilizado a alta temperatura
Medio DMEM (glucosa alta)	Wisent	318-025-CL	Utilizado para el cultivo de organoides de organoides en islotes pancreáticos
Medio DMEM (glucosa baja)	Wisent	319-015-CL	Medio basal para cultivo BMSC y procesamiento de tejidos
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10099141C	Añadido al DMEM con una relación de volumen del 10% para cultivo celular y terminación de la digestión
H-DMEM-F12 medio	Wisent	315-080-CL	Se utiliza para interrumpir la digestión de tripsina durante el paso de organoides
Autoclave de alta temperatura	Haier	GR80DA	Esterilización de instrumentos (121° C, 20 min) y cristalería
Microscopio óptico	Olimpo	CX43	Observación e imagen de organoides de islotes pancreáticos a diferentes aumentos (y tiempos; 4, × 10, y veces; 20)
Tijeras oftálmicas	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1201	Cortar tejido pancreático porcino en 1 mm³ fragmentos, esterilizados mediante autoclave a alta temperatura
Solución de penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Utilizado con una relación de volumen del 1% para prevenir la contaminación bacteriana en el medio de cultivo
Solución salina con fosfato tamponado (PBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010023	Amortiguador de lavado para el tejido pancreático porcino y enjuague celular
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5810R	Centrifugación de alta velocidad a 4&º; C para preparación del lisado pancreático y recogida de pellets celulares
Solución de criopreservación sin suero	Suzhou Xinsaimai Biotechnology Co., Ltd.	#C40050	Usado para la criopreservación de organoides de islotes pancreáticos, resuspendiendo pellets celulares antes de -80°C; Almacenamiento en C