Un protocolo estandarizado de metabolómica para analizar cambios metabólicos inducidos por ejercicio en boxeadores de élite mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas

Summary

Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado de metabolómica sérica basado en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas tándema de tiempo de vuelo cuadrupolar (LC-QTOF-MS/MS) y análisis de datos multivariantes para perfilar cambios metabólicos agudos y a corto plazo relacionados con la recuperación en boxeadores masculinos de élite.

Abstract

El boxeo de élite induce cambios metabólicos rápidos que no se capturan completamente con las mediciones fisiológicas convencionales. Se aplicó un flujo de trabajo estandarizado de metabolómica sérica no dirigida basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas tándem de cuadrupolo de tiempo de vuelo (LC-QTOF-MS/MS) a muestras recogidas antes del combate, inmediatamente después del combate y 24 horas después del combate en siete boxeadores masculinos de élite. El flujo de trabajo incluía recogida estandarizada de muestras, monitorización conjunta de control de calidad, perfilado de metabolitos, análisis estadístico multivariante e interpretación de vías. El combate agudo se asoció con cambios en los metabolitos relacionados con la glucólisis y la gluconeogénesis, mientras que el punto temporal de 24 horas se asoció con el metabolismo del azufre.

El fosfatidilinositol PI (16:0/18:2(9Z,12Z)) mostró una fuerte discriminación del estado inmediatamente posterior al combate, y el tiosulfato se asoció con el estado de recuperación de 24 horas. Estos hallazgos respaldan el uso de este flujo de trabajo para el perfilado reproducible de los cambios metabólicos relacionados con el ejercicio en esta cohorte de siete boxeadores masculinos de élite. El protocolo está destinado a estudios controlados de pequeñas cohortes de ejercicio agudo y recuperación a corto plazo, y enfatiza la manipulación reproducible de muestras, el control de calidad agrupado y el análisis interpretable aguas abajo.

Introduction

El boxeo de élite, caracterizado por tres asaltos de 2 minutos de combate de alta intensidad, se basa en una combinación de metabolismo anaeróbico y aeróbico y provoca rápidos cambios en los sustratos energéticos, mediadores de estrés oxidativo y metabolitos relacionados con la reparación tisular. Las evaluaciones tradicionales (lactato sanguíneo y frecuencia cardíaca) solo capturan puntos fisiológicos aislados, sin resolver los cambios metabólicos sistémicos e interconectados que abarcan "el estrés agudo previo al sparring → post-sparring → la recuperación en 24 horas."

La metabolómica no dirigida, habilitada por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolar, aborda esta limitación perfilando de forma exhaustiva metabolitos de moléculas pequeñas en muestras biológicas. Normalmente detecta miles de picos metabólicos y anota cientos o miles de metabolitos mediante la integración con bases de datos^{seleccionadas 1,2,3}. Este enfoque puede revelar dinámicas metabólicas matizadas que los métodos tradicionales pasan por alto, pero los estudios metabolómicos existentes centrados en el boxeo carecen de estandarización: a menudo omiten protocolos controlados de combate, pasos rigurosos de control de calidad (QC) o momentos de recuperación a largo plazo, lo que conduce a resultados irreproducibles y a una traducción limitada a estrategias de entrenamiento o recuperación ^4,5.

Se presenta un flujo de trabajo metabolómico estandarizado basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolar y optimizado para boxeadores élite para capturar tanto respuestas agudas al ejercicio como recuperación retardada. El protocolo incluye tres puntos temporales clave (pre-sparring [T0], inmediatamente post-sparring [T1], 24 horas post-sparring [T2]) para distinguir el estrés transitorio de la adaptación ^{sostenida 6,7,8}. Las características técnicas críticas incluyen: (1) combate controlado (frecuencia cardíaca máxima del 80–85%) para asegurar una intensidad de ejercicio^{consistente 7,9}; (2) LC-QTOF de alta resolución para la detección sensible de metabolitos séricos^{de baja abundancia 2,3,10}; (3) análisis multivariantes y univariantes, incluyendo análisis de componentes principales (PCA), análisis ortogonal parcial de mínimos cuadrados por discriminante (OPLS-DA) y pruebas estadísticas por pares, para identificar metabolitos sensibles al^{ejercicio 6,8,11}; y (4) una única muestra de QC sérica agrupada (mezcla de igual volumen de muestras del estudio) con múltiples inyecciones para evaluar la estabilidad del instrumento frente a la deriva de señal¹².

Este protocolo puede adaptarse a otros deportes de alta intensidad y corta duración (por ejemplo, sprint y lucha), pero dicha transferibilidad requiere validación en cohortes específicas de cada deporte. En el presente estudio, el flujo de trabajo proporciona un marco preliminar para identificar marcadores metabólicos de estrés y recuperación en boxeadores masculinos de élite. Este flujo de trabajo es más adecuado para estudios controlados de ejercicio agudo y recuperación a corto plazo en cohortes atléticas pequeñas y bien caracterizadas, utilizando metabolómica no dirigida basada en suero. Puede ser menos adecuado para extrapolación directa a otros deportes, atletas femeninas, poblaciones heterogéneas más grandes o estudios de adaptación a largo plazo sin validación adicional.

El estudio tenía como objetivo caracterizar los cambios metabólicos séricos inducidos por el combate de boxeo de élite y distinguir las respuestas agudas post-sparring de los cambios relacionados con la recuperación a las 24 horas. Se planteó la hipótesis de que el combate agudo afectaría predominantemente al metabolismo energético, mientras que la recuperación a las 24 horas estaría asociada con metabolitos vinculados al equilibrio redox y a la reparación tisular. El flujo de trabajo general se muestra en la Figura 1.

Protocol

Realizar todos los procedimientos conforme a la aprobación del Comité Institucional de Ética para la Investigación Humana de la Universidad Capital de Educación Física y Deportes (aprobación nº 2025A005).

PRECAUCIÓN: Trata todas las muestras de sangre humana como potencialmente infecciosas. Lleva guantes, bata de laboratorio y protección ocular. Realizar la recogida de sangre venosa, el manejo del suero y la eliminación de residuos conforme a los procedimientos de bioseguridad institucional. Descontamina las superficies de trabajo tras la manipulación de la muestra.

PRECAUCIÓN: El metanol, el acetonitrilo y el ácido fórmico son productos químicos peligrosos. Maneja los pasos de preparación, extracción y reconstitución del disolvente en una campana extractora certificada para químicos. Evita el contacto con la piel e inhalación. Recoge los residuos de disolventes en recipientes aprobados.

1. Reclutamiento y preparación de participantes en el estudio

1. Recluta a siete boxeadores masculinos de élite de entre 20 y 28 años y compiten en las categorías de peso de 60 a 75 kg.
2. Confirma que cada participante tiene al menos 5 años de experiencia profesional en formación y no antecedentes de enfermedades metabólicas.
3. Excluir a los participantes con lesión musculoesquelética durante los 6 meses anteriores.
4. Instruye a los participantes a seguir una dieta estandarizada que contenga 55% de carbohidratos, 25% de proteínas y 20% de grasas durante 3 días antes de la prueba.
5. Instruye a los participantes a evitar ejercicios intensos en o por encima del 60% de la frecuencia cardíaca máxima durante 48 horas antes de la prueba.
6. Instruye a los participantes a ayunar durante 12 horas antes de la extracción de sangre. Permite la ingesta de agua durante el ayuno.
7. Determina la frecuencia cardíaca máxima mediante pruebas de ejercicio graduadas una semana antes del sparring.
8. Aumenta la velocidad de la cinta de correr en 1 km/h cada 3 minutos hasta agotarte. Utiliza la frecuencia cardíaca máxima medida para definir la intensidad objetivo del combate.

2. Protocolo de combate y recogida de muestras de suero

1. Prepara un ring de boxeo estándar de 6 × 6 m, guantes de 16 oz y un monitor de frecuencia cardíaca con correa torácica.
2. Realiza un calentamiento estandarizado de 10 minutos que consiste en 5 minutos de trote a 8 km/h, 3 minutos de estiramientos dinámicos y 2 minutos de shadowboxing.
3. Ejecuta el protocolo de combate de la siguiente manera.
   1. Realiza tres asaltos de combate de 2 minutos cada uno.
   2. Empareja a los oponentes por categoría de peso y nivel técnico.
   3. Permite un descanso de 1 minuto entre rondas.
   4. Controla la frecuencia cardíaca cada 30 segundos durante la sesión.
   5. Ajusta la intensidad del sparring para mantener la frecuencia cardíaca entre el 80% y el 85% de la salud mental.
   6. Pausa el combate si la frecuencia cardíaca supera el 90% de la salud mental. Reanuda el combate solo cuando la frecuencia cardíaca vuelva al rango objetivo.
4. Recoge muestras de suero en tres momentos de la siguiente manera.
   1. Recoge 5 mL de sangre venosa de la vena antecubital 30 minutos después del calentamiento para T0 usando un tubo de separación sérica (SST) de 8 mL.
   2. Recoge 5 mL de sangre venosa en los 5 minutos posteriores a la ronda final para T1 usando un nuevo SST.
   3. Recoge 5 mL de sangre venosa a la misma hora del día que T0 para T2 usando un nuevo SST. Asegúrate de que los participantes sigan las mismas restricciones de ayuno y actividad que se usan para el T0.
5. Procesa las muestras de sangre de la siguiente manera.
   1. Centrifugar cada SST a 11000 × g. durante 15 minutos a 4 °C en 1 hora tras la recogida.
   2. Transfiere 2–3 mL de la capa suerológica superior a 1,5 mL de crioviales.
   3. Guarda los crioviales inmediatamente a -80 °C.
   4. Limita cada muestra a no más de dos ciclos de congelación-deshielo.
6. Prepara una muestra de control de calidad agrupado.
   1. Descongelar las 21 muestras de suero de estudio (T0, T1 y T2 de siete participantes) sobre hielo antes de la preparación de control de calidad en pool.
   2. Transfiere una alicota igual de cada muestra de estudio a un tubo de 1,5 mL.
   3. Transfiere 20 μL de cada muestra para obtener un volumen final de control de calidad combinado de 420 μL.
   4. Haz un vórtice de la muestra de control de calidad agrupada durante 10 segundos.
   5. Utilizar la muestra de control de calidad agrupada para inyecciones repetidas durante el análisis LC-QTOF-MS para monitorizar la estabilidad instrumental y la deriva de señal.

3. Extracción de metabolitos de muestras de suero

1. Retira las muestras de suero congelado (T0, T1, T2 y QC) de -80 °C. Descongela las muestras sobre hielo durante 30 minutos y pon en vórtice cada muestra durante 10 segundos.
2. Pipetear 100 μL de suero en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL de baja unión a proteínas. Añade 500 μL de disolvente de extracción helado compuesto por metanol:acetonitrilo (1:1, v/v). Vórtice durante 30 s.
   1. No añadas un estándar interno durante la extracción. No aplique corrección de extracción basada en estándares internos ni normalización posterior en el flujo de trabajo finalizado.
3. Sonica el tubo en un baño de agua con hielo a 4 °C durante 10 minutos a 300 W y 40 kHz. Incubar el tubo a -20 °C durante 1 hora para precipitar proteínas.
4. Centrifuga el tubo a 13200 × g . durante 20 minutos a 4 °C. Transfiere aproximadamente 450 μL de sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífuga y descarta el perdigón como residuo biológico peligroso.
5. Seca el sobrenadante en un concentrador al vacío a 37 °C y -0,09 MPa durante 45 minutos o hasta que se alcance la sequedad completa.
6. Reconstituye el extracto seco en 100 μL de acetonitrilo:agua (1:1, v/v). Vórtice durante 30 s.
   Nota: Se utilizó acetonitrilo:agua (1:1, v/v) porque era compatible con la columna de cromatografía de fase inversa utilizada en este flujo de trabajo y no produjo precipitación visible en las pruebas preliminares.
7. Centrifugar la solución reconstituida a 13200 × g . durante 15 minutos a 4 °C. Transfiere aproximadamente 90 μL de sobrenadante a un frasco de vidrio LC-MS equipado con un inserto de 200 μL y sella el vial.

4. Cromatografía líquida-detección por espectrometría de masas

1. Instalar una columna de cromatografía de fase inversa adecuada para metabolómica sérica (véase Tabla de Materiales) en el sistema de cromatografía líquida. Ajusta el horno de columna a 40 °C.
2. Preparar la fase móvil A como ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua ultrapura. Preparar la fase B móvil como ácido fórmico al 0,1% (v/v) en acetonitrilo.
3. Filtrar ambas fases móviles a través de una membrana de 0,22 μm.
4. Ajusta el caudal a 400 μL/min y el volumen de inyección a 5 μL.
5. Aplicar el siguiente gradiente: 0,0–0,5 min, 95% A y 5% B; 0,5–5,5 min, gradiente lineal a 50% A y 50% B; 5,5–9,0 min, gradiente lineal a 5% A y 95% B; 9,0–10,5 min, 5% A y 95% B; 10,5–12,0 min, regresa al 95% A y 5% B y vuelve a equilibrarse
6. Acoplar el sistema de cromatografía líquida a un espectrómetro de masas de alta resolución equipado con una fuente de ionización por electrospray.
7. Adquirir datos en modos de iones positivos y negativos en secuencias separadas.
8. En modo de iones positivos, se ajusta el voltaje capilar a 2500 V y el voltaje del cono a 30 V.
9. En modo de iones negativos, se ajusta la tensión capilar a -2000 V y la tensión del cono a 25 V.
10. Ajusta la temperatura del gas de desolvación a 500 °C, el flujo de gases de desolvación a 800 L/h y el flujo de gas cono a 50 L/h.
11. Adquiere datos sobre m/z 50–1200 con un tiempo de escaneo de 0,2 s.
12. Obtener datos de espectrometría de masas en tándem utilizando baja energía de colisión a 0 V y alta energía de colisión a 10–40 V.
13. Analizar muestras en el siguiente orden: Una inyección en blanco de disolvente de reconstitución; Tres inyecciones consecutivas de la muestra de control de calidad agrupada; Todas las muestras del estudio con una inyección de blank y una inyección de control de calidad cada cinco muestras del estudio; Una última inyección de control de calidad; y una última inyección de fogueo
14. Evaluar la calidad de los datos y la estabilidad analítica en ambos modos iónicos mediante análisis de correlación de QC agrupada y agrupación de análisis de componentes principales (PCA).
15. Interpretar los coeficientes de correlación de QC agrupados mayores a 0,8 como indicativos de estabilidad analítica aceptable a lo largo de la secuencia analítica.

5. Preprocesamiento de datos y análisis estadístico

1. Importar archivos brutos de cromatografía líquida-espectrometría de masas en software de procesamiento de datos para alineación en tiempos de retención, deconvolución, alineación de picos y extracción de características (véase Tabla de Materiales).
   1. Selecciona la primera inyección de QC agrupada como referencia de alineación.
   2. Realiza alineación en tiempo de retención, deconvolución y alineación de picos utilizando el flujo de trabajo predeterminado del software seleccionado. Utiliza una tolerancia de tiempo de retención de ± 0,1 min y una tolerancia de masa de ± 5 ppm.
   3. Realizar picos de picking y mantener características con intensidad superior a 1000 conteos que estén presentes en al menos el 80% de las muestras de al menos un grupo.
   4. No aplique normalización adicional posterior al preprocesamiento en ninguno de los modos iónicos.
   5. Exporta la tabla de características procesadas que contiene m/z, tiempo de retención y valores de área de pico.
   6. La transformada Log2 mantuvo todas las intensidades máximas.
   7. Imputar valores faltantes con una quinta parte del valor positivo mínimo para cada característica.
   8. Centra cada característica en media y divide por su desviación estándar antes del análisis multivariante.
   9. Utiliza la matriz transformada y escalada para análisis de componentes principales (PCA), análisis parcial de mínimos cuadrados por discriminante (PLS-DA), análisis ortogonal parcial de mínimos cuadrados por discriminante (OPLS-DA), agrupación y análisis de correlación. Utiliza las intensidades de características procesadas originales para los gráficos de abundancia.
2. Anota metabolitos comparando características con bases de datos públicas de metabolómica, incluyendo la Human Metabolome Database (HMDB), la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) y LIPID MAPS cuando corresponda.
   1. Puntua cada anotación por error de masa del ion precursor, distribución isotópica y coincidencia de fragmentos en espectrometría de masas en tándem. Asigna un máximo de 20 puntos a cada criterio.
   2. Aplicar una ventana de error de masa de iones precursores de 100 ppm y una ventana de error de masa de fragmentos iones de 50 ppm. No apliques una ventana fija de tiempo de retención.
   3. Conserva anotaciones con una puntuación total de al menos 40 sobre 60. Excluye las anotaciones de puntuación más baja.
3. Define los grupos de comparación explícitamente de la siguiente manera: A = T0 (antes del combate), B = T1 (inmediatamente después del combate) y C = T2 (24 horas después del combate).
4. Realizar análisis estadísticos posteriores utilizando software de computación estadística y paquetes de análisis asociados (véase Tabla de Materiales).
   1. Realiza un análisis de componentes principales (PCA) tras la escala de varianza unitaria y visualiza los gráficos de puntuación.
   2. Construir modelos de análisis parcial de mínimos cuadrados por discriminante (PLS-DA) y análisis ortogonal de mínimos cuadrados parciales por discriminante (OPLS-DA) para A frente a B, B frente a C y A frente a C.
   3. Utiliza la validación cruzada de 7 veces cuando el número de muestra sea al menos 7. Si el número de muestra es menor que 7, se iguala el número de pliegues al número de muestras.
   4. Realizar 200 pruebas de permutación para evaluar la validez del modelo.
   5. Examinar metabolitos diferenciales aplicando los siguientes umbrales: cambio de pliegue (FC) ≥ 2 o FC ≤ 0,5, importancia variable en proyección (VIP) ≥ 1, y prueba t P. < 0,05.
   6. Genera gráficos de volcanes y gráficos estadísticos relacionados para comparaciones por pares.
   7. Genera mapas de calor utilizando la matriz transformada en log2 y escalada por varianza unitaria.
   8. Genera mapas de calor de correlación con un umbral de significación de P ≤ 0,05 y muestra hasta 20 metabolitos.
   9. Determinar el número óptimo de clústeres antes de agrupar k-medias. Realizar agrupamiento k-means tras la escala de varianza unitaria.
   10. Genera gráficos de barras de abundancia a partir de las intensidades de características procesadas originalmente.
   11. Genera diagramas de Venn para resumir la superposición entre comparaciones por pares.
   12. Realizar análisis de características de funcionamiento del receptor (ROC) para metabolitos seleccionados. Evalúa el rendimiento diagnóstico por el área bajo la curva (AUC).
5. Mapea metabolitos diferenciales a las vías KEGG utilizando una función de enriquecimiento de vías en un paquete bioinformático adecuado (véase Tabla de Materiales).
   1. Interpreta las vías con P. < 0,05. No se reportó corrección de pruebas múltiples en el registro final de análisis.

Results

Control de calidad (QC) Validación de datos LC-QTOF-MS/MS

Para evaluar la estabilidad y reproducibilidad de la señal, se analizaron inyecciones repetidas de la muestra de control de calidad agrupada en ambos modos iónicos. Los coeficientes de correlación de Spearman entre las inyecciones de QC agrupada superaron 0,8 en ambos modos iónicos, lo que indicaba un rendimiento estable del instrumento a lo largo de la secuencia analítica. La PCA de to...

Discussion

Este flujo de trabajo estandarizado caracterizó los cambios de metabolitos asociados al combate de boxeo élite y la recuperación a corto plazo en una cohorte pequeña y controlada. Las inyecciones de QC agrupado, el análisis de correlación basado en QC, el agrupamiento de PCA y los análisis multivariantes apoyaron una estabilidad analítica aceptable. El éxito del protocolo dependía principalmente de cuatro factores: mantener la intensidad del combate dentro del 80%–85% de la frecuencia ca...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivos	Acetonitrilo	Merck	Grado LC-MS, CAS 75-05-8
Reactivos	Metanol	Merck	Grado LC-MS, CAS 67-56-1
Reactivos	Ácido fórmico	TCI	Grado LC-MS, CAS 64-18-6
Consumibles	VACUETTE TUBE Activador de coágulos séricos para gatos	Greiner Bio-One	Tubo activador de coágulos séricos de 8 mL
Consumibles	Vial criogénico de Nalgene	Thermo Fisher Scientific	1,5 mL, rosca externa
Consumibles	Tubo de unión a lodos de proteínas	Eppendorf	Gato. Nº 0030108442, 1,5 mL
Cristalería	Vial de vidrio con tapa de rosca y inserto	Agilent	Vial de 2 mL con 200 y mu; Inserto de vidrio en L; Inserta a Cat. Nº 5183-2090
Consumibles	Filtro Millex-GP	Merck	Gato. No. SLGP033RS, 0,22 y mu; Membrana m
Instrumentos	Ring de boxeo personalizado 6x6 m	Muay Thai Deporte	6 y veces; Anillo de entrenamiento de 6 m
Consumibles	Guantes de boxeo estilo Pro 2	Everlast	16 oz
Instrumentos	Polar H10	Polar	Sensor de frecuencia cardíaca con correa torácica
Instrumentos	Cuásar	h/p/cosmos	Cinta de correr motorizada
Instrumentos	Centrífuga 5425 R	Eppendorf	Microcentrífuga refrigerada
Instrumentos	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	Baño ultrasónico digital de 40 kHz
Instrumentos	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Concentrador de vacío integrado
Instrumentos	Mezclador VWR Mini Vortex	Avantor / VWR	Gato. Nº 10153-688
Instrumentos	Congelador TSX ULT	Thermo Fisher Scientific	Modelo TSX50086A
Instrumentos	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Aguas	Sistema UHPLC
Instrumentos	Xevo G2-XS QTof	Aguas	Espectrómetro de masas QTOF
Instrumentos	Columna T3 ACQUITY UPLC HSS	Aguas	P/N 176001132, 1,8 y mu; m, 2.1 y veces; 100 mm
Software	MassLynx	Aguas	Versión 4.2
Software	QI de Progénesis	Aguas	Versión 2.3
Software	R	Fundación R para la Computación Estadística	Versión 3.6.1
Software	PRCOMP	R base	Función base R
Software	ROPLS	Bioconductor	Paquete R
Software	pheatmap	CRAN	Paquete R
Software	Corrplot	CRAN	Paquete R
Software	kmeans	R base	Función base R
Software	NbClust	CRAN	Paquete R
Software	venn	CRAN	Paquete R
Software	MetaboAnalystR	CRAN / Laboratorio Xia	Versión 1.0
Software	pROC	CRAN	Versión 1.15.0
Software	clusterProfiler	Bioconductor	Paquete Bioconductor
Bases de datos	Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB)	HMDB	Base de datos en línea
Bases de datos	Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)	KEGG	Base de datos en línea
Bases de datos	MAPAS LIPÍDICOS	MAPAS LIPÍDICOS	Base de datos en línea