Síntesis verde de nanopartículas de oro y plata mediante extractos vegetales, filtrados fúngicos y cultivos bacterianos

Resumen

Este protocolo describe métodos reproducibles de síntesis verde para fabricar nanopartículas de oro y plata utilizando extractos de plantas, filtrados fúngicos y cultivos bacterianos, seguidos de la confirmación de nanopartículas mediante espectroscopía ultravioleta-visible y microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

La síntesis ecológica de nanopartículas metálicas (NP) utilizando sistemas biológicos ofrece una alternativa sostenible a los métodos convencionales de fabricación química. Este protocolo presenta procedimientos experimentales y analíticos reproducibles para la síntesis de NPs de oro (Au) y plata (Ag) utilizando cultivos bacterianos, filtrados fúngicos y extractos de hojas vegetales como agentes reductores y estabilizadores. Los AgNPs se sintetizaron utilizando extractos de Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera y Earliella sp., mostrando bandas de absorción características ultravioleta–visible (UV–Vis) entre 405 y 425 nm que confirmaron la formación de NP. Se implementó un enfoque de diseño de experimentos para evaluar la influencia de factores ambientales, incluyendo las condiciones de oxígeno, el pH, la concentración de Au, la concentración celular, el tipo de donante de electrones y la temperatura, en la síntesis de AuNPs por Shewanella oneidensis y Cupriavidus metallidurans. En condiciones ideales (0,2 mM Au y pH 5), S. oneidensis produjo predominantemente AuNPs esféricos con un tamaño medio de 43,6 ± 11,0 nm y un pico característico de absorción en 520 nm. La formación y morfología NP se confirmaron mediante espectroscopía UV–Vis y microscopía electrónica de transmisión. Este flujo de trabajo proporciona una plataforma reproducible para la síntesis de NP biogénicos y apoya aplicaciones en biodetección, biorremediación y tecnologías antimicrobianas.

Introducción

Las nanopartículas metálicas (NP) poseen propiedades fisicoquímicas únicas asociadas a su alta superficie superficial, incluyendo comportamientos electrónicos, magnéticos y catalíticos distintivos, así como una alta reactividad. Estas características han promovido su aplicación en múltiples campos, incluyendo medicina para el diagnóstico de enfermedades y administración^{de fármacos} 1,2,3,4,5,6, cosméticos para formulaciones de protector ^{solar 7}, electrónica para transistores y células^{solares 8}, ingeniería ambiental para tratamiento^{de agua 2,9,10}y la agricultura para fertilizantes y^{pesticidas 11,12}. La expansión continua de las aplicaciones de NP en diversas disciplinas se refleja en el creciente número de publicaciones relacionadas reportadas en los últimos^{años: 13,14}.

Los métodos sintéticos para NPs metálicos permiten un control preciso sobre características importantes como el tamaño de las partículas, la morfología y la estabilidad, haciendo del proceso de síntesis un determinante crítico del rendimiento de las NP. Los métodos convencionales de síntesis química han sido ampliamente optimizados; sin embargo, frecuentemente implican reactivos tóxicos, un alto consumo energético y costes de producción^{elevados 14,15}. Estas limitaciones han motivado el desarrollo de alternativas más ecológicas y sostenibles. Los enfoques de síntesis verde emplean sistemas biológicos como extractos ^{vegetales 16,17}, microorganismos como hongos y^{bacterias 18}, y^{algas 19} como agentes naturales reductores y estabilizadores. Durante estos procesos, las sales metálicas se reducen a formas cero-valentes, generando NPs a través de vías respetuosas con el medio ambiente y rentables. Además, los NP sintetizados biológicamente suelen ser biocompatibles, facilitando su uso en aplicaciones médicas, agrícolas y^{medioambientales 8,14}.

La selección de una ruta biológica adecuada para la síntesis de NP depende de la aplicación prevista, así como de la infraestructura y los requisitos operativos disponibles. La síntesis a base de plantas es generalmente preferida para una producción rápida y de bajo coste de NP porque requiere un manejo estéril mínimo; sin embargo, la variabilidad en la composición del extracto puede afectar la^{reproducibilidad 20,21}. La síntesis mediada por hongos puede proporcionar altos rendimientos de NP y enzimas extracelulares que mejoran la estabilización NP y el procesamiento aguas abajo, aunque este enfoque requiere periodos de cultivo más largos y condiciones de crecimiento^{controladas 22}. En cambio, los sistemas bacterianos permiten la síntesis sintonizable bajo condiciones metabólicas definidas y la rápida producción de biomasa, lo que los hace adecuados para estudios mecanicistas y aplicaciones asociadas a^{NP 22}. Sin embargo, la síntesis bacteriana suele requerir un manejo aséptico estricto, condiciones controladas de biorreactor y procesamiento adicional aguas abajo cuando se recuperan NPs^{intracelulares 21,22}.

A pesar de las ventajas mencionadas, los métodos de síntesis verde siguen enfrentando desafíos asociados con la reproducibilidad y la estandarización. Además, los protocolos visuales detallados paso a paso para la síntesis verde de NPs metálicos siguen siendo^{limitados a 23}, lo que limita la capacidad de los investigadores para reproducir e implementar con éxito metodologías existentes. El objetivo de este trabajo es presentar protocolos reproducibles de síntesis verde para NPs de oro (Au) y plata (Ag) utilizando extractos vegetales, filtrados fúngicos y cultivos bacterianos. Específicamente, se emplearon extractos acuosos de Psidium guayaquilensis y Acanthophora spicefera, filtrados fúngicos extracelulares de Earliella sp. y sistemas bacterianos que involucraban Shewanella oneidensis y Cupriavidus metallidurans para la síntesis de NP. Los protocolos presentados enfatizan los pasos críticos en la preparación de extractos biológicos, la síntesis de NP y la caracterización preliminar de NP. Además, el flujo de trabajo integra el diseño de experimentos, procedimientos de preparación estandarizados y caracterización en línea para apoyar la síntesis reproducible y optimizable de NP biogénicos.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales de la Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ecuador). La biomasa vegetal, algal y fúngica utilizada en este estudio se recogió de entornos accesibles y no involucró especies protegidas ni áreas restringidas. Según la normativa institucional y nacional, no se requerían permisos específicos para la recogida de biomasa disponible libremente bajo estas condiciones. Consulte la Figura 1 para el flujo de trabajo experimental integrado utilizado para la síntesis verde de AgNPs y AuNPs utilizando sistemas biológicos vegetales, algalistas, fúngicos y bacterianos.

Figura 1: Flujo de trabajo integrado para la síntesis verde de nanopartículas (NP) de plata (Ag) y oro (Au) utilizando sistemas biológicos. Esquema del flujo de trabajo experimental para la síntesis verde de AgNPs y AuNPs utilizando sistemas vegetales, algalistas, fúngicos y bacterianos. El flujo de trabajo ilustra la selección de fuentes biológicas, la preparación de extractos o biomasa, la reacción con precursores metálicos (_{AgNO 3} o HAuCl₄), las condiciones de reacción y la formación de NP. Los sistemas biológicos incluyen extracto de hoja de Psidium guayaquilensis , extracto de algas Acanthophora spicifera , filtrado extracelular de Earliella sp. y cultivos bacterianos MR-1 de Shewanella oneidensis . Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

NOTA: Siga todas las directrices de seguridad de los laboratorios institucionales al manipular productos químicos y materiales biológicos. Consulta las hojas de datos de seguridad de todos los reactivos antes de su uso.

1. Síntesis de NPag utilizando hojas de P. guayaquilensis

1. Colección de hojas
   1. Recolectar hojas frescas de P. guayaquilensis durante la estación seca en Guayaquil, provincia de Guayas, Ecuador (2°10′S, 80°0′O).
      NOTA: Se depositaron ejemplares de esta especie endémica en el Herbario GUAY, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador, y en el Herbario Steere del Jardín Botánico de Nueva York (NYBG), Nueva York, EE. UU. Información adicional disponible en: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Preparación del extracto de hoja
   1. Lava bien el material vegetal fresco con agua destilada.
      NOTA: Asegurar la eliminación completa de las impurezas superficiales.
   2. Seca las hojas en un secador de bandeja con flujo de aire forzado a 40°C.
      NOTA: Las bajas temperaturas de secado minimizan la degradación de compuestos orgánicos termolábiles implicados en la reducción de Ag⁺ .
   3. Muele el material seco usando un molino manual para obtener un polvo fino.
   4. Suspende 10 g de material en polvo en 200 mL de agua destilada.
   5. Calienta la suspensión a 70°C bajo agitación continua durante 1 hora.
   6. Deja que el extracto se enfríe hasta temperatura ambiente (RT, ~28°C).
   7. Filtrar el extracto al vacío mediante papel filtro cualitativo (Grado 1, tamaño de poro 11 μm, diámetro 110 mm).
      NOTA: Elimina todos los residuos sólidos del material vegetal.
   8. Guarda el extracto filtrado a 4°C en botellas ámbar hasta que se use de nuevo.
3. Fabricación de AGNs fitogénicos mediante extractos de hojas
   NOTA: Durante los experimentos de optimización, varía un parámetro por ensayo manteniendo constantes los parámetros restantes. Evalúa la concentración de nitrato de plata (_{AgNO 3}) (1–5 mM), la fracción de extracción (10%–50% v/v), el tiempo de reacción (0,5–1 h) y la temperatura (25°C–80°C). Optimizar los parámetros de síntesis utilizando una metodología de superficie de respuesta basada en un DoE compuesto central. Estudia cada factor en cinco niveles (-α, -1, 0, +1 y +α). Utiliza la longitud de onda del pico de resonancia plasmónica superficial (SPR) (λ_SPR), que se correlaciona con el tamaño NP, como variable^{de respuesta 24}. El diseño experimental consta de 16 puntos factoriales, 8 puntos axiales y 5 réplicas en puntos centrales, lo que da un total de 29 experimentos.
   1. Preparar soluciones de_{AgNO 3} disolviendo la masa adecuada de_{AgNO 3} en agua destilada para obtener concentraciones entre 1 y 5 mM.
      PRECAUCIÓN: El_{AgNO 3} es corrosivo y un potente agente oxidante que puede causar irritación en la piel y los ojos. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y protección ocular. Evitar la exposición a la luz y desechar los residuos que contengan agricultura según las directrices de seguridad institucionales.
   2. Mezcle la solución de_{AgNO 3} con el extracto vegetal para obtener fracciones de extracto entre el 10% y el 50% (v/v).
   3. Calienta y remueve la mezcla de reacción a la temperatura seleccionada (25°C–80°C) para el tiempo de reacción deseado (0,5–1 h).
   4. Deja que la mezcla de reacción permanezca en RT durante 24 horas.
   5. Centrifuga la mezcla marrón de la reacción a 1660 × g durante 15 minutos en RT. Descarta el sobrenadante y recoge la fracción sólida.
   6. Seca los NPs recuperados en un horno a 60°C.

2. Síntesis de AgNPs utilizando extractos de algas A. spicifera

1. Colección de algas
   1. Recoger algas A. spicifera en Valdivia, provincia de Santa Elena, Ecuador (1°57′23.91′′S, 80°43′51.33′′O).
2. Preparación del extracto de algas
   1. Prepara el extracto de algas siguiendo el procedimiento descrito en el Paso 1.2. Sustituye las hojas de la planta por biomasa de algas de A. spicifera .
3. Fabricación de AgNP Ficogénicos mediante extractos de algas
   NOTA: Realiza una serie de 12 experimentos variando un parámetro a la vez manteniendo constantes los parámetros restantes. Evalúa la concentración de_{AgNO 3} (1–5 mM), la fracción de extracción (5%–25% v/v), el tiempo de reacción (1–4 h) y la temperatura (25°C–70°C).
   1. Preparar las soluciones de_{AgNO 3} y el extracto de algas tal como se describe en los Pasos 1.3.1 y 2.2.
   2. Mezcle la solución de_{AgNO 3} con el extracto de algas para obtener una fracción extractal del 5%–25% (v/v). Calienta y remueve la mezcla de reacción a la temperatura seleccionada (25°C–70°C) para el tiempo de reacción deseado (1–4 h).
   3. Deja que la solución se enfríe en RT durante 24 horas. Recoge la fracción sólida tras la centrifugación y sécala en un horno como se describe en los pasos 1.3.5 y 1.3.6.

3. Síntesis de AgNPs usando Earliella sp.

1. Colección y mantenimiento de la cultura
   1. Transfiere fragmentos miceliales en crecimiento activo de Earliella sp. a placas de agar de patata con dextrosa.
      NOTA: La cepa fúngica utilizada en este estudio fue aislada de muestras ambientales recogidas en el campus de la ESPOL, Ecuador. El aislado fue identificado taxonómicamente en función de características morfológicas y conservado en la colección de cultivos del Centro de Investigación Biotecnológica de Ecuador (CIBE, ESPOL) bajo el código interno E2. Como esta cepa se mantiene en una colección institucional y no ha sido depositada en un repositorio internacional, no existe RRID ni número de acceso externo.
   2. Incubar las placas a 28°C durante 48 horas.
   3. Transfiere un fragmento micelial al caldo de patata con dextrosa e incuba el cultivo bajo agitación constante a 150 rpm durante 5 días.
      NOTA: Este paso promueve la producción de biomasa y la secreción de metabolitos extracelulares.
   4. Filtra el cultivo fúngico a través de papel filtro estéril para separar la biomasa micelial del caldo extracelular. Recoge el filtrado para la síntesis posterior de NP.
      NOTA: El caldo extracelular contiene biomoléculas que actúan como agentes reductores y estabilizadores durante la síntesis de AgNP.
2. Fabricación de AgNP micogénicos
   NOTA: Generar 14 condiciones experimentales variando un parámetro por ensayo manteniendo proporciones de volumen constantes entre el caldo fúngico y la solución de_{AgNO 3} . Evalúa la concentración de_{AgNO 3} (1–10 mM), pH (4–10 ajustado usando HCl o NaOH), tiempo de reacción (1–4 h) y temperatura (25°C–70°C).
   PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico (HCl) y el hidróxido de sodio (NaOH) son altamente corrosivos. Lleva el equipo de protección personal adecuado y realiza ajustes de pH lentamente bajo agitaciones continuas para evitar salpicaduras y sobrecalentamiento localizado. Utiliza 1 M de soluciones ácidas o basas durante el ajuste del pH.
   1. Mezclar el caldo extracelular fúngico con una solución de_{AgNO 3} a la concentración deseada (1–10 mM) utilizando una relación de volumen entre el 2,5% y el 10% (v/v) para obtener un volumen final de reacción de 50 mL. Ajusta el volumen final de reacción según la condición experimental que se esté probando.
   2. Remover la mezcla de reacción a la temperatura seleccionada (25°C–70°C) para el tiempo de reacción deseado (1–4 h). Deja que la solución se enfríe en RT durante 24 horas. Recoge la fracción sólida tras la centrifugación y sécala en un horno como se describe en los pasos 1.3.5 y 1.3.6.

4. Síntesis de AuNPs usando C. metallidurans y S. oneidensis

1. Colección y mantenimiento de la cultura
   1. Inocular stocks celulares congelados preservados en un 20% de glicerol a −80°C de C. metallidurans CH34 o S. oneidensis MR-1 sobre placas de agar de soja trípticos bajo condiciones aeróbicas. Incuba las placas a 28°C durante 24 horas.
   2. Selecciona una colonia individual de cada plato e inocúlala en 250 mL de caldo de soja tríptico en condiciones aeróbicas. Incubar el cultivo a 28°C en un agitador rotatorio que funcione a 120 rpm.
   3. Cosechar las células en la fase estacionaria tras 72 horas de incubación, cuando la densidad óptica a 610 nm (OD₆₁₀) alcanza aproximadamente 1. Centrifuga los cultivos a 10.000 × g durante 10 minutos a ~20°C.
   4. Lava los pellets recogidos dos veces con una solución estéril de NaCl al 0,9% (p/v). Concentra las celdas lavadas a un valor OD₆₁₀ de aproximadamente 7.
   5. Genera stocks de celdas concentradas anóxicas desgasificando las suspensiones y llenando el espacio de cabeza con gas_N2 .
2. Fabricación de AuNPs bacteriogénicos
   NOTA: Utilizar una matriz factorial fraccionaria para evaluar la influencia de factores ambientales en la síntesis de AuNP²⁵. Construye la matriz usando 7 factores en 2 niveles seleccionados según estudios previos^26,27. Organizar los experimentos en una matriz ortogonal y aleatorizar el orden experimental para minimizar el sesgo ensayo-combinación. El orden experimental resultante se presenta en Tabla 1.
   1. Disuelva cloruro de oro trihidrato (HAuCl₄) en agua desionizada para preparar una solución de fondo a 5 g L⁻¹.
      PRECAUCIÓN: HAuCl₄ es tóxico y un agente oxidante fuerte. Manipula todas las soluciones dentro de una campana extractora certificada mientras llevas el equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Evitar el contacto con materiales orgánicos y eliminar los residuos según los protocolos institucionales de residuos peligrosos.
   2. Preparar los reactores experimentales diluyendo la solución original a la concentración objetivo en solución de NaCl al 0,9% (p/v) y ajustando el pH según las condiciones experimentales enumeradas en la Tabla 1.
   3. Dispensa 50 mL de la solución metálica preparada en frascos limpios de 120 mL de suero. Sella inmediatamente cada botella con un tapón de goma butílica.
   4. Asegura el tapón usando un sello de entornado de aluminio y un crimpador de mano. Esteriliza los frascos de suero sellados autoclavándolos a 121°C durante 21 minutos.
   5. Deja que las botellas se enfríen para RT e inspecciona visualmente cada botella para detectar precipitaciones.
      NOTA: Desecha cualquier botella que muestre precipitación visible y prepara reactores de reemplazo.
   6. Establecimiento de condiciones anóxicas
      1. Conecta cada botella de suero esterilizada a un sistema de colectores de gas equipado con una fuente de nitrógeno de alta pureza (N₂) y una bomba de vacío.
      2. Generar un espacio de cabeza anóxico realizando 21 ciclos de purga consecutivos para cada reactor que requiera condiciones anóxicas según la Tabla 1. Durante cada ciclo, aplicar vacío seguido de relleno de nitrógeno durante aproximadamente 30 s hasta que la presión interna vuelva a la presión atmosférica aproximada (~1 atm).
         NOTA: No se requiere verificación directa de condiciones anóxicas; sin embargo, el análisis de gases en espacio de cabeza, como la cromatografía de gases, puede utilizarse para confirmar la eliminación de osígeno cuando sea necesario.
         PRECAUCIÓN: El gas nitrógeno puede desplazar el osígeno y crear un riesgo de asfixia en espacios cerrados. Asegurarse de una ventilación adecuada en el laboratorio y verificar las conexiones seguras de las tuberías de gas antes de su uso.
      3. Mantener los reactores bajo una ligera presión positiva de_{N 2} tras el ciclo final de purga.
      4. Etiqueta los reactores del 1 al 8 según el orden experimental. Por ejemplo, etiqueta la quinta condición experimental como R5.
   7. Adición de donadores de electrones e inoculación
      1. Inyectar el volumen requerido de solución estéril de donante de electrones anóxicos y anóxicos, como lactato sódico, en la fase líquida de los reactores designados según la Tabla 1 utilizando una jeringuilla y aguja estériles.
      2. Inyectar el volumen requerido de donante de electrones gaseosos, como H₂, en el espacio de altura designado del reactor usando una jeringuilla hermética a gases.
      3. Inocular todos los reactores bióticos inyectando asépticamente el volumen requerido de cultivo microbiano anóxico concentrado en la fase líquida.
         NOTA: Almacenar cultivos de stock concentrados a 4°C antes de la inoculación para mantener la viabilidad celular.
   8. Montaje de experimentos de control
      1. Prepara un control abiótico siguiendo todos los pasos descritos en el Paso 4.2 mientras se reemplaza el inóculo microbiano por un volumen equivalente de medio de cultivo anóxico estéril o tampón.
      2. Prepara un control de células muertas siguiendo todos los pasos descritos en el Paso 4.2 utilizando un inóculo esterilizado mediante autoclave.
         NOTA: Utiliza los controles para tener en cuenta la reducción y biosorción de metales abióticos. Preparar el control de células muertas autoclavando stocks celulares viables a 121°C durante 21 minutos para evaluar la contribución de los mecanismos microbianos activos.
   9. Incubación y tiempo de reacción
      1. Coloca todos los frascos de suero en incubadoras con control de temperatura.
      2. Ajustar la temperatura de incubación según las condiciones experimentales especificadas en la Tabla 1.
      3. Coloca las incubadoras sobre plataformas rotatorias agitadoras e incuba los reactores a 120 rpm.
      4. Permite que las reacciones continúen durante 72 horas.
         NOTA: Pausa el experimento tras la incubación y almacena los frascos de suero a 4°C hasta el procesamiento de la muestra.
         NOTA: Opcionalmente, cuantificar el metal disuelto residual tras la biosíntesis de NP utilizando espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente para evaluar la eficiencia de eliminación de metales y distinguir la formación de NP de las especies residuales disueltas.
3. Replicación de condiciones óptimas
   1. Identificar la condición del reactor asociada a la máxima eliminación de metal tras el cribado primario y el análisis de datos.
   2. Replicar la condición óptima seleccionada en tres botellas independientes del reactor para confirmar la reproducibilidad.
   3. Realizar la preparación, montaje del reactor y procedimientos de incubación para los experimentos de verificación triplicada según los Pasos 4.1 y 4.2.
      NOTA: Tras la finalización de los experimentos, almacenar y etiquetar temporalmente todas las soluciones disueltas como residuos acuosos hasta que las eliminen por empresas certificadas de gestión de residuos conforme al Código Nacional Orgánico del Medio Ambiente y las directrices técnicas institucionales.

Reactor / Bacterias	Temperatura (°C)	Atmósfera	Donador de electrones	Densidad óptica (OD610)	pH	[Gold] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H 5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H 5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H 5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H 5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tabla 1: Diseño experimental factorial fraccionado utilizado para la síntesis de AuNP bacteriogénicos. Esta tabla resume las condiciones experimentales evaluadas para la síntesis de AuNP utilizando S. oneidensis MR-1 (SOM) o C. metallidurans CH34 (CMC). Las variables incluyeron temperatura de incubación, atmósfera de espacio de cabeza, donante de electrones, densidad óptica del inoculo (OD₆₁₀), pH de la solución y concentración inicial de Au³⁺ .

5. Caracterización de AgNPs y AuNPs

NOTA: Utilice espectroscopía ultravioleta–visible (UV–Vis) como método accesible para confirmar la formación de NP mediante resonancia plasmónica superficial. Utiliza microscopía electrónica de transmisión (TEM) para evaluar directamente la morfología y el tamaño de los NP. Se puede realizar caracterización fisicoquímica adicional utilizando técnicas complementarias como la dispersión dinámica de la luz (DLS), la difracción de rayos X (XRD), la espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y la espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS) para evaluar la distribución de tamaño, cristalinidad, química superficial y composición elemental cuando se requiera una caracterización más^{completa 28,29}.

1. Espectroscopía UV-Vis
   1. Configuración de instrumentos
      1. Enciende el espectrofotómetro UV–Vis y deja que el instrumento se caliente durante al menos 15 minutos para asegurar la estabilidad de la señal.
      2. Selecciona el modo de escaneo espectral y configura el rango de longitudes de onda de 300 a 800 nm usando un intervalo de datos de 1 nm.
2. Preparación de muestras
   1. Recoge alicotas de suspensiones AgNP o AuNP recién sintetizadas. Diluir las muestras con agua destilada cuando sea necesario para mantener los valores de absorbancia dentro del rango de detección lineal.
3. Medición UV–Vis de NPs
   1. Realiza la corrección base usando agua destilada como solución en blanco.
   2. Transfiere la muestra preparada a una cubeta, coloca la cubetas en el portamuestras y registra el espectro UV–Vis en el rango de 300–800 nm.
   3. Identifica la banda SPR correspondiente a la formación NP.
      NOTA: Los AgNP suelen mostrar bandas SPR entre 405 y 425 nm, mientras que los AuNP suelen mostrar bandas SPR entre 520 y 550 nm.
4. Microscopía electrónica de transmisión
   NOTA: Analizar la morfología y tamaño NP usando TEM operado a 80 kV y equipado con una cámara digital de alta resolución.
   1. Transfiere 1,5 mL de suspensión NP a un tubo de centrífuga y centrifuga a 5000 × g durante 5 minutos en RT.
   2. Descarta el sobrenadante y conserva la bola.
   3. Añade 1 mL de solución de fijación que contiene un 4% de paraformaldehído y un 5% de glutaraldehído preparado en un tampón cacodilato de 0,1 M al pellet. Incubar la muestra durante 25 horas en la RT. Luego, lava el pellet toda la noche con un tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M.
   4. Centrifuga la muestra a 5000 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
   5. Añade 1 mL de tetróxido de osmio al 1% (p/v) (_{OsO 4}) preparado en un tampón de cacodilato sódico de 0,1 M para fijar durante 3 horas.
      PRECAUCIÓN: OsO₄ es altamente tóxico y volátil. Manipula todas las soluciones exclusivamente dentro de una campana extractora certificada para productos químicos mientras llevas el equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.
   6. Centrifuga la muestra a 5000 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
   7. Deshidrata la muestra usando una serie de etanol graduado. Añade 50% de etanol y incuba durante 15 minutos. Repite el procedimiento secuencialmente usando un 70% y un 90%. Deshidratación completa con tres incubaciones consecutivas en etanol absoluto durante 30 minutos por incubación.
   8. Incrusta el pellet en resina epoxi en RT según las instrucciones del fabricante.
   9. Prepara secciones semifinas (~1 μm) y tiñe las secciones con azul de toluidina para observación preliminar.
   10. Corta secciones ultrafinas (~60 nm) con un cuchillo de diamante y tiñe las secciones con acetato de uranilo seguido de citrato de plomo.
   11. Monta las secciones en rejillas TEM y cárgalas en el microscopio electrónico de transmisión.
   12. Adquirir imágenes TEM para evaluar la morfología y el tamaño de los NP.

Resultados

Los AgNPs se sintetizaron con éxito mediante vías verdes y biosintéticas utilizando diferentes agentes biológicos reductores, y se identificaron condiciones ideales de síntesis para cada método. En la síntesis verde mediada por extracto de hoja de P. guayaquilensis , las condiciones óptimas consistieron en una concentración de_{AgNO 3} de 5 mM, una relación extracto-solución metálica del 25% (v/v), una temperatura de reacción de 80°C y un tiempo de agitación de 60 minuto...

Discusión

Al comparar las rutas de síntesis evaluadas en términos de viabilidad, control del tamaño de NP, coste operativo, reproducibilidad y eficiencia global del proceso, la síntesis mediada por plantas utilizando extracto de hoja de P. guayaquilensis demostró el equilibrio más favorable entre los métodos de síntesis de AgNP investigados. Este protocolo proporcionaba un mejor control sobre el tamaño del NP mediante una optimización sistemática y caracterización microscópica directa, op...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Absolute ethanol	Merck	E7023	Serie de deshidratación TEM
Sellos de crimpado de aluminio	Dwk Wheaton	224178-01	Para frascos de suero
Botellas de vidrio ámbar	Duran	2180154	Almacenamiento protegido de la luz
Espectrómetro ATR-FTIR	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Rango espectral: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Esterilización a 121 °C
Tapones de goma de butilo	Dwk Kimble	73827-21	Sello hermético
Centrífuga	BIOBASE	BKC-TH20RL	Centrífuga de sobremesa
Ácido cloroáurico trihidrato (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Precursor de oro
Cuchillo de diamante	Aurion	Dyatom 45	Cortes ultradelgados TEM
Agua destilada o desionizada	Methrom	N/A	Preparación de solución
Resina epoxi (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	Medio de incrustación TEM
Papel filtro, grado cualitativo 1	Merck Whatman	WHA1001110	Tamaño de poro: 11 µm; diámetro: 110 mm
Espectrómetro de transformada de Fourier de infrarrojos (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Rango espectral: 300–3600 cm-1
Sistema de red de gas	Construido a medida	N/A	Para ciclos de purga
Jeringa hermética	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehído	VWR	219859510	Glutaraldehído al 5%, paraformaldehído al 4% en tampón de cacodilato de sodio 0.1 M
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Preservación en stock al 20%
Crimpadora de mano	Biomed	USYGQ-20Z	Sello de crimpado de frascos de suero
Molino/trituradora manual	Corona	L10000	Molienda de biomasa vegetal
Ácido clorhídrico (HCl)	Merck	320331	Ajuste de pH
Gas hidrógeno (H2)	Linde	Grado industrial	Gas donador de electrones
Sistema ICP-OES	Varian	Vista-MPX	Cuantificación de metales
Incubadora	Memmert	SM 400	Incubación a temperatura controlada
Horno de laboratorio	Barnstead	M100	Secado de nanopartículas
Citrato de plomo	Merck	7398	Tinción TEM
Ácido nítrico (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Reactivo ácido
Gas nitrógeno (N2)	Linde	Grado industrial	Condiciones anóxicas
Tetróxido de osmio (OsO4)	Merck	201030	Fijación TEM
Paraformaldehído	VWR	101176-014	Glutaraldehído al 5%, paraformaldehído al 4% en tampón de cacodilato de sodio 0.1 M
Agar Dextrosa de Patata (PDA)	Merck	110130	Cultivo de hongos
Caldo Dextrosa de Patata (PDB)	Merck	P6685	Medio microbiológico
Agitador orbital	JoanLab	OS-20Pro	Incubación a agitación controlada
Frascos de suero (120 mL)	Wheaton	223748	Vidrio borosilicato
Nitrato de plata (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	Reactivo ACS, ≥99.0%
Tampón de cacodilato de sodio	VWR	11650	Glutaraldehído al 5%, paraformaldehído al 4% en tampón de cacodilato de sodio 0.1 M
Cloruro de sodio (NaCl)	Carl Roth	3957.1	Solución de lavado al 0.9%
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Ajuste de pH
Lactato de sodio	Sigma-Aldrich	L7022	Donador de electrones/fuente de carbono
Jeringas y agujas estériles	BD	Varios	Manipulación estéril de líquidos
Plato calefactor con agitación	Biologix	01-310X	Calentamiento y agitación
Azul de toluidina	EMS	DcU-10	Tinción de secciones semidelgadas
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Equipado con cámara digital de alta resolución
Secador de bandeja con flujo de aire forzado	Hecho a mano	N/A	Secado de biomasa a 40 °C
Agar Trypticasa de Soja (TSA)	Oxoid	CM01301	Medio microbiológico
Caldo Trypticasa de Soja (TSB)	Carl Roth	X938.1	Medio microbiológico
Acetato de uranilo	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	Tinción TEM
Espectrómetro UV–Vis	Thermo Scientific	Genesys 10S	Análisis espectral UV–Vis
Bomba de vacío	KNF o equivalente	N 820 G	Para condiciones anóxicas
Materiales Biológicos
Material Biológico	Fuente	Identificador	Comentarios/Descripción
Acanthophora spicifera	Colección local	N/A	Biomasa de algas marinas
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Cepa bacteriana
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Colección fúngica institucional
Psidium guayaquilensis	Colección local	N/A	Biomasa de plantas silvestres
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Cepa de colección de cultivo