Un método para adaptar Euglena gracilis a sustratos basados en yuca para cultivo heterotrófico

Resumen

Este protocolo describe el método paso a paso para adaptar Euglena gracilis a sustratos basados en yuca y la posterior evaluación del crecimiento, viabilidad y producción de biomasa en múltiples productos de yuca bajo condiciones de cultivo heterotróficas.

Resumen

El procesamiento de la yuca genera subproductos ricos en nutrientes que permanecen infrautilizados debido a la composición variable, compuestos cianogénicos y comunidades microbianas activas. Este protocolo presenta una estrategia de adaptación en varias etapas para establecer un linaje tolerante a la yuca de Euglena gracilis adecuado para el cultivo heterotrófico en sustratos derivados de la yuca. El método comienza con la exposición simultánea de cultivos de Euglena a medios de yuca autoclavados y no autoclavados y a un gradiente de concentración garri de 10–30 g/L para evaluar la tolerancia a la complejidad microbiana y la carga del sustrato. A continuación, se someten los cultivos a un gradiente de concentración más alto de 30–50 g/L para evaluar el rendimiento con sustratos más densos. El linaje resultante se compara con una cepa de tipo salvaje no adaptada en cinco productos de yuca; garri, pulpa seca, pellets, cáscaras y pienso para animales para evaluar la consistencia del crecimiento en materiales relevantes para el campo. El protocolo incluye la medición de cambios de pH, niveles de cianuro utilizando tiras colorimétricas y preparación de biomasa seca para análisis de proteínas basados en la cuantificación total de nitrógeno. En conjunto, estos procedimientos proporcionan un marco reproducible para adaptar Euglena gracilis a sustratos derivados de yuca y para evaluar el rendimiento de la deformación en diversos productos de yuca. Este método permite el desarrollo de linajes de algas robustos para su uso en bioprocesamiento y aplicaciones de valoración de residuos centradas en la yuca.

Introducción

La yuca (Manihot esculenta) es un cultivo alimentario e industrial importante en África Occidental, que genera subproductos procesados como garri, pulpa seca, cáscaras y^pellets.

Los sustratos derivados de la yuca están compuestos principalmente por carbohidratos fermentables y nutrientes residuales, así como un contenido menor de proteínas y fibra, aunque la composición puede variar según las condiciones de procesamiento y el material fuente ^2,3. Siguen infrautilizados debido a su composición heterogénea, la presencia de glucósidos cianogénicos y las diversas comunidades microbianas que surgen durante el procesamiento y la fermentación^{tradicionales.} Estas características presentan desafíos para el cultivo microbiano directo y limitan la integración de subproductos de yuca en los flujos de trabajo estandarizados de bioprocesamiento. A pesar de la abundancia de subproductos derivados de la yuca, actualmente hay una escasez de métodos reproducibles y biosostenibles para cultivar sistemas microbianos en estos sustratos químicamente complejos y microbianamente activos. Un sistema de cultivo capaz de enriquecer o desintoxicar una fuente de alimento tan popular mientras opera de forma fiable en estas condiciones apoyaría flujos de trabajo más sostenibles para el procesamiento de yuca y una utilización circular de recursos.

Euglena gracilis es un flagelado unicelular dentro de los Euglenozoa⁵, reconocido por su película flexible, morfología dinámica y capacidades reversibles de cisting en respuesta a fluctuaciones sustanciales en la disponibilidad de nutrientes, la presión osmótica y^{la composición química 6}. Su adaptabilidad metabólica también le permite sintetizar el polisacárido de almacenamiento^{paramilón 6} y regular el pH celular mediante el metabolismo de ácidos orgánicos. Estos rasgos metabólicos, especialmente la acumulación de paramilones, pueden mejorar el almacenamiento de energía y la tolerancia al estrés, apoyando la supervivencia y adaptación bajo las variables condiciones nutritivas y químicas características de los sustratos derivados de la yuca. Estas características permiten que E. gracilis persista bajo condiciones químicamente variables de agua dulce, convirtiéndola en una candidata prometedora para el cultivo en sustratos heterogéneos y no^refinados.

Cuando se exponen a sustratos químicamente complejos o microbianamente activos, los cultivos no adaptados de E. gracilis suelen mostrar respuestas al estrés como aumento de la incisación y una motilidad reducida, mientras que las poblaciones adaptadas pueden mantener una morfología y actividad metabólica más^{estables 8}. Las interacciones con comunidades microbianas asociadas pueden influir aún más en el rendimiento fisiológico durante la exposición prolongada a sustratos complejos. Estas características ponen de manifiesto la relevancia de los enfoques basados en la adaptación al cultivar E. gracilis en materiales derivados de la^{yuca 9}.

Para abordar estos desafíos, este método emplea una estrategia de adaptación por etapas diseñada para aclimatar gradualmente a E. gracilis a sustratos derivados de la yuca. El enfoque incorpora una exposición controlada a la creciente complejidad del sustrato y a la actividad microbiana, permitiendo la selección de poblaciones capaces de mantener la viabilidad y el crecimiento bajo condiciones de cultivo heterogéneas. Este diseño permite a E. gracilis interactuar con la microbiota asociada y potencialmente obtener ventajas de ella, y adaptarse al aumento de las concentraciones del medio.

Tras la adaptación, el protocolo lleva a cabo una evaluación comparativa de linajes adaptados y no adaptados de E. gracilis en múltiples productos derivados de la yuca. Este marco comparativo permite evaluar la consistencia del crecimiento, la estabilidad morfológica y las respuestas fisiológicas bajo condiciones de sustrato relevantes para el campo, ya que el proceso de adaptación prepara gradualmente a E. gracilis para navegar la variabilidad de nutrientes, los factores químicos y la actividad microbiana característicos de los subproductos de la yuca.

El método incorpora un seguimiento estandarizado de los niveles de pH y^{cianuro 10} durante el cultivo, así como la preparación de biomasa cosechada para análisis de proteínas aguas abajo mediante cuantificación total^{de nitrógeno 11}, lo que permite la comparación del potencial nutricional entre sustratos y cepas. En conjunto, estas mediciones apoyan la evaluación de la estabilidad metabólica, las interacciones con sustratos y las características de biomasa durante el cultivo y adaptación basados en yuca, para demostrar que la línea adaptada de E. gracilis puede crecer de forma robusta y consistente en múltiples subproductos de la yuca.

Este método es más adecuado para entornos de laboratorio o investigación aplicada con acceso a infraestructura microbiológica básica y sustratos derivados de yuca localmente disponibles. Las consideraciones prácticas incluyen la necesidad de un manejo consistente de medios heterogéneos, acceso a microscopía para monitorizar la salud del cultivo y un control cuidadoso de la mezcla para evitar esfuerzos cortantes durante el cultivo.

Protocolo

Este protocolo utiliza protistas no patógenos y sustratos vegetales derivados de la yuca. Realizar todos los procedimientos conforme a los requisitos institucionales de bioseguridad y seguridad química para los materiales vegetales cianogénicos.

1. Preparación y fermentación de medios a base de yuca

PRECAUCIÓN: Los materiales derivados de la yuca pueden contener glucósidos cianogénicos y liberar cianuro de hidrógeno bajo ciertas condiciones. Realiza todos los pasos de pesaje, hidratación, mezcla y muestreo en una campana extractora química. Lleva bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Descontaminar las superficies de trabajo tras manipular sustratos de yuca y eliminar los residuos sólidos y líquidos como residuos químicos peligrosos según las directrices institucionales.

1. Preparar las suspensiones garri
   Nota: El tipo salvaje Euglena gracilis fue cultivado bajo condiciones de oscuridad constante a 28°C con vibraciones orbitales de 120 x g. La composición del medio nutritivo heterotrófico se preparó como una formulación definida compuesta por 1,5% de glucosa, 0,5% extracto de levadura, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% CaCL2,2H2O más 0,4 mL/L de solución de stock vitamínico (vitamina B1: 2,50g/L; Vitamina B12: 12,5 mg/L; Vitamina B6: 0,5 mg/L; Vitamina B7: 0,025 mg/L) y 2,0 mL/L de solución de stock de metales traza (Na2EDTA.2H2O: 25,00 g/L; FeCl3.6H2O: 21,00 g/L; ZnSO4.7H2O: 11,0 g/L; MnCl2.4H2O: 4,0 g/L; CuSO4.5H2O: 0,39 g/L; H3BO3: 0,285 g/L; Na2MoO4.2H2O: 0,9 g/L).
   1. Etiqueta cada matraz estéril de 500 mL con tapa ventilada con el tipo de sustrato (garri), concentración objetivo (10, 20, 30, 40 o 50 g ^L-1), identificación replicada y condición de esterilización planificada (autoclavada o no autoclaveada).
   2. Coloca un báscula sobre la balanza analítica y pulsa TARE/Cero para ajustar la pantalla a 0,000 g.
   3. Pesa el garri para que coincida con el volumen de trabajo final (por ejemplo, para 300 mL, pesa 3,0 g para 10 g ^L-1, 6,0 g para 20 g ^L-1, 9,0 g para 30 g ^L-1, 12,0 g para 40 g ^L-1 o 15,0 g para 50 g ^L-1).
      NOTA: El rango de concentración seleccionado (10–50 g ^L-1) fue diseñado para abarcar condiciones que van desde el crecimiento basal hasta una alta carga de sustrato, permitiendo evaluar la adaptación a través de la creciente complejidad fisicoquímica.
   4. Añade asépticamente el garri pesado en cada matraz estéril de 500 mL que contenga 300 mL de agua desionizada o destilada y vuelva a aplicar la tapa ventilada.
   5. Mezcla cada suspensión durante 3 minutos, hasta que la mezcla se homogeneice usando uno de los siguientes métodos.
      NOTA: E. gracilis es sensible al corte mecánico; Por ello, se seleccionaron condiciones de mezcla para minimizar el estrés inducido por la agitación manteniendo un contacto adecuado entre las células y el sustrato.
      1. Para la mezcla manual, aprieta la tapa ventilada y haz girar el frasco a mano en un movimiento circular durante 3 minutos hasta que los sólidos se dispersen uniformemente.
      2. Para agitar magnéticamente, añade asépticamente una barra agitadora estéril al matraz, coloquelo sobre una placa agitadora y ajusta la velocidad a 200 x g para formar un vórtice poco profundo sin salpicaduras.
   6. Deja que la suspensión se hidrate sin molestar durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 °C).
   7. Inmediatamente antes de la fermentación, homogeneiza suavemente la mezcla apretando primero la tapa de ventilación y girando los frascos a mano durante 5 veces para volver a suspender el material sedimentado.
      NOTA: El garri utilizado en este estudio era un producto comercial derivado de la yuca. Según la información nutricional proporcionada por el fabricante, consistía principalmente en carbohidratos, con cantidades mínimas de proteína y un contenido de grasa insignificante. Esta composición refleja los sustratos procesados típicos de yuca utilizados en contextos alimentarios e industriales.
2. Prepara medios adicionales de productos de yuca
   1. Etiqueta cada matraz estéril de 500 mL con tapa ventilada con el tipo de sustrato (pulpa seca, pellets, cáscaras o pienso animal), concentración (30 g ^L-1), identificación replicada y condición de esterilización (autoclavada o no autoclaveada).
   2. Coloca un báscula sobre la balanza analítica y pulsa TARE/Cero para ajustar la pantalla a 0,000 g.
   3. Pesa el sustrato para obtener 30 g ^L-1 según el volumen de trabajo (por ejemplo, para 300 mL, pesa 9,0 g).
   4. Añade asépticamente el sustrato pesado en cada matraz estéril que contenga 300 mL de agua desionizada o destilada y reaplica la tapa ventilada.
   5. Hidrata y mezcla cada suspensión usando uno de los siguientes métodos.
      1. Para mezclar manualmente, aprieta la tapa de ventilación y agita suavemente el frasco 10 veces cada 3 minutos durante el periodo de hidratación.
      2. Para agitar magnéticamente, añade asépticamente una barra de agitación estéril y remueve a 200 x g hasta que el material esté visiblemente hidratado y distribuido de forma uniforme.
   6. Inspecciona visualmente cada suspensión y confirma que los sólidos están hidratados y que no quedan grandes grumos secos.
      NOTA: No filtre medios de yuca a menos que sea necesario para una medición analítica posterior.
3. Fermentación aeróbica de medios a base de yuca
   1. Confirma que cada matraz está equipado con un tapón ventilado estéril permeable al gas para permitir el intercambio de gases minimizando la contaminación ambiental.
   2. Coloca los frascos en posición vertical a temperatura ambiente (25 °C) en un área designada, alejada de la luz solar directa y del flujo de aire de alto tráfico.
   3. Incubar sin agitación durante un mínimo de 72 horas.
   4. Registra la fecha y hora de inicio de fermentación para cada matraz y condición.
4. Prepara medios autoclavados
   1. Tras la fermentación, asegúrese de que cada matraz de 500 mL contenga ≤300 mL de líquido (≤ dos tercios del volumen total) para evitar el desbordamiento durante la esterilización.
   2. Afloja la tapa ventilada hasta una posición "apretada con los dedos" adecuada para autoclavar y aplica cinta indicadora de autoclave en el frasco.
   3. Carga los frascos en el autoclave en una bandeja segura para autoclave y selecciona el ciclo líquido P13.
   4. Asegura que los parámetros de esterilización estén a 121 °C durante 30 minutos (esterilización líquida) y comienza el ciclo.
   5. Tras completar el ciclo, permite que la presión de la cámara del autoclave vuelva a la presión atmosférica antes de abrir la puerta. Retira los frascos con guantes resistentes al calor y déjalos enfriar a temperatura ambiente.
   6. Guarda los frascos enfriados durante la noche a temperatura ambiente antes de la inoculación.
      PRECAUCIÓN: Los líquidos calientes y el vapor pueden causar quemaduras. Abre la puerta del autoclave despacio y solo retira los frascos cuando la presión se haya igualado y los líquidos se hayan enfriado.
5. Preparar medios no autoclavados
   1. Utiliza medios de yuca fermentados directamente sin autoclave para preservar las comunidades microbianas nativas.
   2. Inocular medios no autoclavados inmediatamente después del periodo de fermentación de 72 horas para minimizar la contaminación ambiental no deseada.
   3. Mantener una manipulación consistente entre réplicas utilizando el mismo tipo de recipiente (matrazos estériles de 500 mL con tapa ventilada), el mismo volumen de trabajo (300 mL) y la misma duración de fermentación (≥72h) para todas las condiciones del sustrato.

2. Establecimiento de culturas iniciadoras de E. gracilis

1. Mantenimiento de las crías de animales de E. gracilis
   1. Inocular E. gracilis en un medio nutritivo fresco heterotrófico e incubar los cultivos en completa oscuridad a 28 °C con agitación orbital continua a 120 x g hasta que los cultivos alcancen un crecimiento logarítmico medio.
   2. Examinar los cultivos utilizando un microscopio óptico compuesto (campo claro) 100×–400× aumento total (10× ocular con objetivos de 10×–40×) para confirmar la motilidad activa, la morfología celular alargada típica y bajos niveles de incistos.
      NOTA: La viabilidad se evaluó en función de la presencia de células intactas con límites celulares definidos y residuos mínimos. La motilidad activa se definió como el movimiento direccional observable de las células dentro del campo de visión. La estabilidad morfológica se evaluó en función de la predominancia de formas celulares características y la baja frecuencia de formas colapsadas o altamente irregulares.
   3. Excluir cultivos que presenten exceso de residuos celulares, morfología anormal o incisación elevada antes de su uso en experimentos de adaptación.
2. Prepara el inóculo para la adaptación
   1. Homogeneiza suavemente los cultivos iniciadores apretando la tapa del ventilador y haciendo girar los frascos a mano durante 15 segundos para asegurar una distribución uniforme de las células sin inducir tensión cortante.
   2. Determinar la densidad celular usando un hemocitómetro de Neubauer.
      1. Mezcla suavemente el cultivo revolviéndolo a mano durante 15 segundos.
      2. Pipete 1,0 mL de cultivo en un tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
      3. Limpia el hemocitómetro y la cubierta con etanol al 70% y deja secar al aire.
      4. Pipetear 10 μL de cultivo sobre las dos rejillas del hemocitómetro y colocar el engobe de cobertura sobre la muestra húmeda.
      5. Utilizando microscopía de campo claro (objetivo 10×), céntrate en la cuadrícula y cuenta las celdas en un conjunto definido de cuadrados (por ejemplo, los 4 cuadrados de las esquinas de la cuadrícula grande).
      6. Aplicar las reglas estándar de límite (contar celdas que tocan los bordes superior e izquierdo; excluir celdas que tocan los bordes inferior y derecho).
      7. Repite los recuentos en la segunda cámara (y/o recarga) y calcula la media de celdas/mL.
      8. Calcular la densidad celular usando la siguiente ecuación: celdas/mL= (medias de celdas por cuadrado × 10⁴× factor de dilución)/1
         Nota: Para mejorar la visualización de las células, diluir la muestra con agua desionizada según sea necesario (por ejemplo, tomar una cuota de 100 μL de la muestra y diluir en 600 μL de agua desionizada, y repetir la evaluación de densidad celular)
   3. Ajustar los volúmenes de inoculación para lograr un inóculo final del 5% (v/v) en todos los medios experimentales.
      NOTA: Las proporciones seleccionadas de inóculo se eligen para asegurar una densidad celular inicial suficiente y el mantenimiento de los cultivos.
   4. Prepara unóculos separados para cada condición de tratamiento para mantener densidades celulares iniciales consistentes entre los grupos experimentales.

3. Adaptación inicial en medios de yuca autoclavados y no autoclave

1. Medios de adaptación inoculados
   NOTA: Se seleccionaron volúmenes de inoculo para equilibrar una densidad celular inicial suficiente con la sensibilidad a los efectos de adaptación, utilizando volúmenes menores durante la adaptación temprana y volúmenes mayores para mantener cultivos estables durante el paso rutinario.
   1. Añadir el inoculo preparado de E. gracilis a medios de yuca autoclavados y no autoclavados preparados a concentraciones finales de garri de 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 y 30 ^gL-1.
   2. Utilizar volúmenes de inoculación iguales en todas las condiciones de tratamiento para estandarizar la densidad celular inicial.
   3. Para mezclar los cultivos, aprieta la tapa ventilada y haz girar el matraz suavemente en un movimiento circular durante 15 segundos para distribuir las células.
   4. Incubar los cultivos en completa oscuridad a 25 °C para iniciar el crecimiento heterotrófico.
2. Mantener las condiciones de cultivo
   1. Para medios no autoclavados, minimizar la agitación para preservar la estructura de la comunidad microbiana nativa y la estratificación del sustrato.
   2. Mezcla todos los cultivos una vez al día usando un giro manual suave durante 15 segundos para mantener el contacto entre las células de E. gracilis y el material de yuca suspendido.
      PRECAUCIÓN: Evite sacudidas vigorosas o agitaciones continuas para evitar esfuerzos cortantes y la interrupción no intencionada de las interacciones microbianas-sustrato.
3. Adaptación temprana de Monitor
   1. Cada 48 horas, recoge asépticamente 1 mL de muestras de cada cultivo usando puntas estériles de pipeta.
      1. Aprieta la tapa ventilada y agita suavemente el matraz de cultivo durante 15 segundos antes de la muestra para asegurar una distribución uniforme de las células y el material en suspensión.
      2. Transfiere una cuota de cultivo a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Diluye la muestra con agua desionizada según sea necesario para mejorar la visualización de las células individuales. (por ejemplo, 100 μL de muestra diluida en 600 μL de agua desionizada).
      4. Prepara el portaobjetos de microscopía de montaje húmedo pipeteando 10 μL de la muestra diluida sobre un portaobjetos limpio y cubre con un portaobjetos de cubierta.
   2. Evaluar cultivos mediante microscopía óptica
      1. Examinar muestras con un microscopio óptico compuesto (campo claro) a un aumento total de 100×–400× (10× ocular con objetivos de 10×–40×).
      2. Evalúa la motilidad celular, la morfología y la frecuencia de los incisaciones como indicadores del estado de adaptación.
         NOTA: La viabilidad se evaluó en función de la presencia de células intactas con límites celulares definidos y residuos mínimos. La motilidad activa se definió como el movimiento direccional observable de las células dentro del campo de visión. La estabilidad morfológica se evaluó en función de la predominancia de formas celulares características y la baja frecuencia de formas colapsadas o altamente irregulares.
4. Realizar pasajes en serie durante la adaptación
   NOTA: Los intervalos de muestreo y transferencia se proporcionan como rangos definidos para acomodar la variabilidad en la dinámica de crecimiento, manteniendo al mismo tiempo un tiempo experimental consistente entre réplicas.
   1. Cada 7 días, transfiere asépticamente el 20% (v/v) de cada cultivo a medios de yuca recién preparados con la misma concentración de garri y condición de esterilización.
   2. Mantener volúmenes de transferencia consistentes entre pasajes para preservar la presión selectiva.
   3. Repite el paso en serie hasta que los cultivos muestren crecimiento constante, motilidad sostenida y baja frecuencia de incidencias en medios de yuca ^L-1 de 30 g.
      Punto de pausa: Los cultivos pueden permanecer sin interrupciones hasta 24 horas entre los pasos rutinarios de mezcla y muestreo.

4. Selección de alta concentración (30–50 g/L)

1. Preparar sustratos de alta carga
   1. Preparar medios de yuca a base de garri a concentraciones finales de 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 y 50 ^gL-1 siguiendo los procedimientos descritos en el Método 1.
   2. Permitir que los sustratos se hidraten completamente durante el periodo de fermentación para asegurar una exposición uniforme de las células a los componentes disueltos y particulados.
   3. Resuspende suavemente las partículas asentadas haciendo girar los frascos con cuidado a mano durante 10–15 segundos justo antes de la inoculación.
2. Inocular cultivos de alta carga
   1. Inocular cada medio de yuca de alta concentración con un 5% (v/v) de la línea de E. gracilis previamente adaptada a 30 ^gL-1 garri.
   2. Estandarice los volúmenes de inoculación en todas las concentraciones para mantener densidades celulares iniciales comparables.
   3. Incubar los cultivos en completa oscuridad a 25 °C con agitación orbitaria continua a 120 x g para mantener condiciones de crecimiento heterotrófico.
   4. Mezcla cultivos una vez al día mediante un suave giro manual durante 15 segundos para mantener el contacto entre las células y el sustrato suspendido sin inducir esfuerzos cortantes
3. Rendimiento del monitor bajo alta carga de sustrato
   1. Inspeccionar los cultivos cada 48 horas en busca de cambios visibles en la turbidez, pigmentación e interacción entre las células de E. gracilis y el material sedimentado de yuca.
   2. Recoger aseptivamente pequeñas alícuotas y examinar células usando un microscopio óptico compuesto a una magnificación total de 100×–400× (10× ocular con objetivos de 10×–40×).
   3. Evaluar la motilidad, la morfología celular y la frecuencia de la incisación como indicadores de tolerancia fisiológica al aumento de la concentración en el sustrato (Véase el Método 2).
4. Confirmar la adaptación a altas concentraciones de sustrato
   1. Identificar cultivos que mantengan motilidad sostenida, morfología consistente y baja frecuencia de incistos en concentraciones de yuca de ≥40 g ^L-1.
   2. Designa los cultivos que cumplen estos criterios como la línea de graciles adaptada a la yuca para su posterior evaluación experimental.

5. Pruebas comparativas de crecimiento en medios de productos de yuca

1. Preparar condiciones de prueba por pares
   1. Para cada producto de yuca, incluyendo garri, pulpa seca, pellets, cáscaras y pienso animal, prepara dos recipientes idénticos con la misma concentración y volumen de sustrato.
   2. Inocular un vaso con la línea adaptada a la yuca de E. gracilis y el vaso emparejado con la cepa salvaje no adaptada.
   3. Utilizar volúmenes de inoculación iguales para cada condición emparejada para asegurar densidades celulares iniciales comparables entre linajes
2. Mantener culturas emparejadas
   1. Incubar todos los cultivos emparejados en completa oscuridad a 25 °C con agitación orbitaria continua a 120 x g para mantener condiciones de crecimiento heterotrófico.
   2. Mezcla cultivos una vez al día mediante una suave inversión manual para mantener el contacto entre las células y el sustrato suspendido.
   3. Registrar cambios visibles, incluyendo turbidez, pigmentación y patrones de asentamiento, durante todo el periodo de incubación.
3. Registro de diferencias morfológicas observadas
   1. En intervalos de muestreo definidos, recoge asepticamente alicóticas alicotas de cada cultivo para su análisis microscópico (véase el Método 2.2 para la recogida de alicuotas y el análisis microscopio)
   2. Examinar muestras con un microscopio óptico compuesto (campo claro) a un aumento total de 100×–400× (10× ocular con objetivos de 10×–40×).
   3. Documentar las diferencias entre cultivos adaptados y de tipo salvaje en cuanto a motilidad, frecuencia de incisos y morfología celular general.

6. Monitorización del pH

1. Recoger muestras de pH
   1. En los días 0, 3, 6, 9 y 12, retirar asépticamente 1 mL de cultivo de cada condición experimental utilizando puntas estériles de pipeta.
   2. Deja que las muestras permanezcan intactas durante 2 minutos para permitir que los sólidos en suspensión se asienten.
   3. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante clarificado a un tubo de microcentrífuga limpio sin alterar el material sedimentado.
2. Mide el pH
   1. Calibra el medidor de pH según las instrucciones del fabricante utilizando los buffers estándar apropiados antes de la medición.
   2. Inserta la sonda de pH calibrada en el sobrenadante clarificado sin alterar ningún material residual sedimentado.
   3. Registra los valores de pH inmediatamente después de que la lectura del pH se haya estabilizado.
   4. Enjuaga la sonda a fondo con agua desionizada entre muestras para evitar la contaminación cruzada.

7. Pruebas de cianuro usando tiras colorimétricas

PRECAUCIÓN: Los sobrenadantes que contienen cianuro son peligrosos. Realiza todos los pasos de muestreo y prueba en una campana extractora química o en una zona bien ventilada. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y protección ocular. Evitar el contacto directo de la piel con muestras y tiras reactivas y desechar tiras usadas y residuos líquidos según las directrices institucionales para la eliminación de residuos químicos peligrosos.

1. Recoger muestras de cianuro
   1. En los días 0, 4, 8 y 12, extrae asépticamente 1 mL de sobrenadante de cultivo de cada condición experimental utilizando puntas estériles de pipeta.
   2. Deja que las muestras permanezcan intactas durante 2 minutos para permitir que los sólidos en suspensión se asienten.
   3. Recoge cuidadosamente el sobrenadante clarificado sin alterar el material particulado.
2. Realiza un ensayo colorimétrico de cianuro.
   1. Sumergir una prueba de tira reactiva de cianuro colorimétrico en el sobrenadante clarificado durante la duración especificada por el fabricante.
   2. Retira la tira y deja el revelado completo del color durante el tiempo recomendado en condiciones ambientales.
   3. Compare la tira revelada con la escala de referencia proporcionada por el fabricante para determinar la concentración de cianuro.
3. Niveles de cianuro récord
   1. Registrar las concentraciones de cianuro para cada muestra en todos los puntos temporales según la escala de referencia.
   2. Fotografía cada tira de prueba desarrollada junto a la escala de referencia o conserva la tira según las recomendaciones del fabricante para futuras verificaciones.

8. Mantenimiento y consolidación de culturas adaptadas de E. gracilis

1. Combinar culturas adaptadas
   1. Tras una adaptación exitosa a concentraciones de yuca de ≥40 ^gL-1 garri, se confirma visualmente la presencia de células viables de E. gracilis en cada cultivo replicado.
   2. Combina suavemente todos los frascos replicados del linaje adaptado en un solo recipiente estéril utilizando técnica aséptica para generar un cultivo maestro homogéneo.
2. Preparar el medio de mantenimiento
   1. Preparar medios frescos a base de yuca en la concentración de mantenimiento seleccionada siguiendo los procedimientos descritos en el Método 1.
   2. Selecciona medios con autoclave o no autoclavado según los requisitos experimentales posteriores.
   3. Mantener la misma condición de esterilización en todos los pasajes posteriores para asegurar la consistencia en la exposición microbiana.
3. Cultivos de mantenimiento inoculados
   1. Inocular medios de mantenimiento frescos con un 20% (v/v) del cultivo maestro consolidado.
   2. Mezcla suavemente los cultivos mediante un giro manual para distribuir las células de manera uniforme sin inducir tensión cortante.
   3. Incubar cultivos en completa oscuridad a 25 °C con agitación orbital continua a 120 x g para mantener condiciones de crecimiento heterotrófico.
4. Realizar mantenimiento rutinario y pasar
   1. Mantener los cultivos mediante una suave inversión manual una vez al día para evitar la sedimentación prolongada de células y material sustrato.
   2. Cada 30 días, consolida los cultivos de mantenimiento combinando frascos replicados usando técnica aséptica.
   3. Reinocular los medios de mantenimiento frescos utilizando el cultivo consolidado según se describe en la Sección 8.3.
5. Monitorizar la estabilidad del cultivo
   1. En cada pasaje, evalúa la morfología y motilidad celular usando un microscopio óptico compuesto (campo claro) con una magnificación total de 100×–400× (10× ocular con objetivos de 10×–40×).
   2. Cambios históricos hacia un aumento de la incisación, acumulación de restos celulares o reducción de la motilidad como indicadores de disminución de la estabilidad del cultivo.

9 Aprovechamiento de biomasa para análisis de proteínas aguas abajo

1. Recoger muestras de cultivo
   1. En el extremo deseado, transfiere los volúmenes de cultivo a tubos centrifugadores estériles.
   2. Asegúrate de que las muestras representen el cultivo completo mezclando suavemente los frascos de cultivo antes de la transferencia.
2. Cosecha de biomasa por centrifugación
   1. Centrifugar muestras a ≥3.500 × g durante 10 minutos para pelletar la biomasa. Repite este paso si el sedimento no se ha asentado completamente.
   2. Confirma la formación de un pellet de célula compacta en la parte inferior del tubo.
3. Eliminar el sobrenadante
   1. Decanta o haz una pipeta cuidadosamente del sobrenadante sin mover el pellet.
   2. Deshacerse del sobrenadante según los protocolos de residuos de laboratorio.
4. Preparar biomasa para el análisis aguas abajo
   1. Conserva el pellet celular para su procesamiento posterior (por ejemplo, secado, almacenamiento o análisis de proteínas).
   2. Si no se procesa inmediatamente, almacenar los pellets a 4 °C para uso a corto plazo o congelarlos según corresponda para su almacenamiento a largo plazo.

10. Manejo y archivo de datos

1. Organizar el conjunto de datos
   1. Introduce todas las mediciones cuantitativas, incluyendo pH, concentración de cianuro, evaluaciones de viabilidad, recuento celular y valores de biomasa, en una hoja de cálculo electrónica etiquetada.
   2. Guarda imágenes de microscopía y notas observacionales asociadas usando nombres de archivo estandarizados que indiquen el tipo de sustrato, concentración, identidad de la decepción, número de réplica y fecha de muestreo (por ejemplo, 25-01-NAG40G_WT1_05).
2. Preparar conjuntos de datos para su análisis
   1. Verifica que todas las réplicas experimentales y los puntos de tiempo programados estén representados y completos dentro del conjunto de datos.
   2. Digitaliza cualquier nota de laboratorio escrita a mano y haz copias de seguridad de todos los archivos electrónicos para almacenarlos de forma segura y evitar la pérdida de datos. El análisis de datos y la generación de figuras se realizaron utilizando software de hojas de cálculo (Microsoft Excel) y, cuando era aplicable, R (R Foundation for Statistical Computing). Todos los análisis de núcleo pueden reproducirse usando cálculos basados en hojas de cálculo, usando R solo para visualización complementaria.

Resultados

Los siguientes resultados representativos ilustran los resultados esperados cuando se aplica con éxito el protocolo descrito, así como el rango de resultados observados bajo condiciones subóptimas. Los datos representativos correspondientes a estos resultados se muestran en la Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. En conjunto, estos resultados proporcionan orientación práctica para interpretar la dinámica del crecimiento, la viabilidad, la morfología y los resultados proteicos al adaptar E. gracilis a sustratos basados en yuca bajo condiciones de cultivo heterotróficas y completamente oscuras. Además, estos resultados validan los resultados biológicos clave del protocolo, incluyendo adaptación exitosa, crecimiento sostenido, alta viabilidad, morfología estable, rendimiento consistente entre sustratos y producción medible de proteínas.

A lo largo de los experimentos, se utilizaron tres réplicas por tratamiento (todos los tipos de medios de yuca). Reconocemos que el número de replicaciones depende de la discreción y las limitaciones logísticas de cualquier grupo que siga los protocolos mencionados. La aplicación exitosa de este protocolo resulta en un crecimiento heterotrófico sostenido de E. gracilis en medios basados en garri bajo condiciones completamente oscuras. Los resultados positivos se caracterizan por trayectorias de crecimiento suaves y sigmoidales, divergencia limitada entre réplicas y densidades celulares estables en fase tardía. Los rasgos morfológicos que indicaron resultados positivos y se observaron de forma consistente en poblaciones adaptadas incluyeron la redondez celular y las membranas celulares gruesas. En cambio, las células colapsadas no saludables suelen aparecer irregulares, fragmentadas o estructuralmente comprometidas y se asocian con una viabilidad reducida, distinguiéndolas de formas intactas, redondeadas o semi-encistadas observadas en cultivos adaptados. Como referencia, se incluyen imágenes representativas de E. gracilis tipo salvaje que exhibe una morfología alargada característica (Figura 8) para distinguir la estructura celular base de las formas adaptadas o alteradas. Los cultivos cultivados con 30 g de ^L-1 garri mostraron un mayor crecimiento integrado, medido por el área bajo la curva de crecimiento (AUC), en comparación con concentraciones más bajas, lo que sugiere una utilización más eficiente del sustrato de yuca y una adaptación fisiológica exitosa (Figura 1).

Los resultados subóptimos se observan comúnmente en concentraciones bajas de garri (10–20 g ^L-1), donde el crecimiento es detectable pero reducido en magnitud y más variable entre réplicas. A concentraciones más altas (40–50 g ^L-1), los cultivos pueden alcanzar densidades celulares máximas elevadas; sin embargo, estas condiciones muestran frecuentemente estabilización tardía o aumento de la variabilidad temporal (Figura 2).

En experimentos exitosos, la viabilidad celular se mantiene alta durante todo el periodo de cultivo, con solo fluctuaciones menores a mitad del experimento. Los ensayos de exclusión de tripán azul indican que los cultivos mantenidos a 30 g de ^L-1 garri conservan una alta proporción de células viables (sin colorear) en relación con las no viables (tintadas de azul) en los momentos muestreados (Figura 3). Las desviaciones respecto a este patrón, incluyendo un aumento de la proporción de células teñidas, una motilidad reducida o cambios hacia morfologías redondeadas o colapsadas, pueden indicar condiciones subóptimas y servir como desencadenantes tempranos para la resolución de problemas. Las evaluaciones de viabilidad y morfología se basaron en criterios observacionales consistentes, incluyendo la integridad celular, la motilidad direccional y la prevalencia relativa de formas alargadas frente a redondeadas o colapsadas.

Los resultados subóptimos se caracterizan por reducciones transitorias en la viabilidad, observadas más comúnmente en concentraciones de garri más altas. La recuperación parcial puede observarse en momentos posteriores; sin embargo, estas condiciones muestran una mayor variabilidad en la viabilidad a lo largo del periodo de cultivo (Figura 4). Estos patrones de crecimiento muestran que las concentraciones intermedias de sustrato (por ejemplo, 30 g ^L-1) proporcionan un equilibrio entre la disponibilidad de nutrientes y el estrés, resultando en un crecimiento más estable. Estas tendencias reflejan el impacto de las condiciones de preprocesamiento y la adaptación por etapas en el rendimiento del cultivo, ya que la exposición gradual a la creciente complejidad del sustrato favorece una mejor estabilidad fisiológica y un comportamiento de crecimiento reproducible. Las concentraciones más bajas limitan la producción de biomasa, mientras que concentraciones más altas conducen a una mayor variabilidad y estabilización retardada.

La evaluación morfológica proporciona un indicador cualitativo del estado de adaptación. Los resultados positivos incluyen la aparición y persistencia de células redondeadas o semi-encistadas con motilidad reducida que permanecen intactas a través de subcultivos repetidos (Figura 5).

En cambio, los cultivos subóptimos, la mayoría asociados con cepas salvajes o adaptaciones en etapas tempranas, presentan transiciones abruptas de células alargadas y móviles a morfologías irregulares o colapsadas que coinciden con una menor estabilidad de crecimiento.

Cuando el protocolo se aplica a sustratos derivados de yuca adicionales, incluyendo pulpa, pellets y peelings, los cultivos adaptados de E. gracilis muestran crecimiento reproducible en múltiples tipos de sustratos. Los resultados positivos se caracterizan por una estabilización más temprana de las curvas de crecimiento y una reducción del declive en etapas avanzadas en comparación con los cultivos de tipo silvestre (Figura 6).

Los resultados subóptimos incluyen un inicio tardío del crecimiento o un aumento de la variabilidad replicada, especialmente en sustratos con mayor heterogeneidad física.

La implementación exitosa del protocolo produce biomasa de E. gracilis con contenido medible de proteína cruda, cuantificado por análisis externos de laboratorio utilizando el método de Combustión (Dumas). Los porcentajes de proteínas observados en cultivos adaptados son comparables a los medidos en cultivos de tipo salvaje, con una mayor producción total de proteínas correspondiente a un aumento de la acumulación de biomasa (Figura 7).

La monitorización de la química del medio apoyó las interacciones cultivo-sustrato durante la adaptación y validó la inclusión de mediciones de pH y cianuro dentro del protocolo. Los valores de pH mostraron cambios graduales a lo largo del tiempo, lo que indica actividad metabólica y utilización de sustratos, con tendencias más estables en cultivos adaptados. Las mediciones con cianuro reforzaron esto aún más, ya que los cultivos adaptados mostraron reducciones en los niveles detectables, mientras que los cultivos salvajes seguían siendo más variables. En conjunto, estos resultados demuestran que estos pasos de monitorización capturan eficazmente los cambios en la química de los medios asociados con la adaptación y apoyan la interpretación del rendimiento cultural. Aunque no se investigaron los mecanismos subyacentes, esto representa un área importante para futuras investigaciones, especialmente para aplicaciones a escala industrial.

El flujo de trabajo de mantenimiento y consolidación a largo plazo apoyó la viabilidad continua de la línea adaptada de Euglena gracilis durante períodos prolongados de cultivo. Los cultivos mantenidos mediante pasos repetidos conservaron consistentemente la motilidad, la morfología característica y un comportamiento de crecimiento estable a lo largo de los ciclos de mantenimiento. Aunque el rendimiento a largo plazo no se evaluó cuantitativamente, estas observaciones proporcionan evidencia representativa de que el linaje adaptado puede mantenerse de forma fiable bajo las condiciones especificadas.

En conjunto, estos resultados confirman que el protocolo de adaptación soporta un crecimiento robusto, viabilidad y producción de biomasa de E. gracilis en sustratos basados en yuca, con un rendimiento consistente y niveles reducidos de cianuro a lo largo del tiempo.

Todas las figuras y tablas se proporcionan como archivos separados y no están incrustadas en el documento manuscrito. Las preferencias de colocación de figuras y tablas se indican dentro del texto del manuscrito mediante notas entre corchetes (por ejemplo, (Figura 1)). Salvo que se especifique lo contrario, todas las cifras y tablas deben aparecer debajo de la sección de Resultados Representativos en la publicación final.

Todas las figuras se envían como archivos individuales, con figuras multipaneladas proporcionadas como una sola imagen combinada. Las imágenes de microscopía incluyen barras de escala en cada panel. Las figuras de datos incluyen ejes etiquetados con unidades de medida definidas, y las barras de error se especifican en las leyendas correspondientes de las figuras.

Todas las tablas se envían como archivos individuales .xls o .xlsx y contienen datos numéricos en bruto o resumidos sin formato decorativo.

Figura 1: Dinámica de crecimiento de E. gracilis cultivada con 10, 20 y 30 ^gL-1 garri en condiciones completamente oscuras. Las densidades medias de las células se muestran a lo largo del tiempo para cada concentración de sustrato. Las barras de error representan el SEM entre réplicas biológicas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Rendimiento de crecimiento de E. gracilis a concentraciones elevadas de garri (30–50 g ^L-1). Las trayectorias de densidad celular ilustran diferencias en la densidad máxima, el momento de estabilización y la variabilidad entre concentraciones más altas en sustratos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Tendencias de viabilidad celular de E. gracilis cultivadas con 30 gL-1 garri medidas mediante exclusión de Trypan Blue. La proporción de celdas viables se muestra a lo largo de los puntos temporales muestreados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Fluctuaciones de viabilidad de E. gracilis cultivadas a concentraciones de garri más altas. Se muestran cambios transitorios en la viabilidad celular a lo largo del periodo experimental. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Morfología representativa de poblaciones adaptadas de E. gracilis . Imágenes representativas de microscopía óptica invertida muestran células redondeadas y semi-encistadas observadas tras la adaptación. Barra de escala = XX μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Rendimiento de crecimiento de E. gracilis adaptado y de tipo salvaje en sustratos derivados de yuca. Se muestran las trayectorias de crecimiento para cultivos adaptados y de tipo salvaje cultivados con múltiples productos de yuca. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Contenido de proteína bruta y producción total de proteínas de biomasa de E. gracilis cultivada en yuca. El contenido de proteínas se cuantificó mediante análisis externos utilizando el método de combustión SGS (Dumas). La producción total de proteínas se muestra junto con la acumulación de biomasa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Morfología representativa de E. gracilis de tipo salvaje bajo condiciones estándar (aumento de 40X). Imagen representativa de Euglena gracilis sana y no adaptada que muestra una morfología característica alargada bajo microscopía óptica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Un determinante central del éxito en este protocolo es el equilibrio entre la concentración de sustrato de yuca y la estabilidad fisiológica durante el cultivo heterotrófico de E. gracilis. Los materiales derivados de la yuca introducen heterogeneidad física, partículas residuales y cinéticas variables de liberación de nutrientes que influyen directamente en el comportamiento de crecimiento y la estabilidad del^{cultivo 2,3}. Entre los pasos del protocolo, la preparación del sustrato y la selección de concentración representan por tanto los puntos de control más sensibles. Como demuestran los Resultados Representativos, las concentraciones intermedias de sustratos apoyan de forma fiable un crecimiento sostenido con divergencia replicada limitada, mientras que concentraciones más bajas limitan la acumulación de biomasa y concentraciones más altas aumentan la variabilidad temporal y las respuestas a tensiones transitorias. Estos resultados subrayan que la carga máxima de sustratos no garantiza necesariamente un rendimiento óptimo o estable en el cultivo al trabajar con materiales agroindustriales heterogéneos. Los pasos seleccionados de preprocesamiento y los rangos de concentración del sustrato fueron diseñados para desafiar progresivamente a E. gracilis bajo una creciente complejidad química y microbiana. Las diferencias observadas en la estabilidad del crecimiento y la viabilidad a través de estas condiciones respaldan la validez de este enfoque por etapas y confirman que las concentraciones intermedias en sustratos proporcionan un equilibrio entre la disponibilidad de nutrientes y el estrés fisiológico.

El manejo de la cultura durante el crecimiento heterotrófico influye aún más en los resultados de adaptación. La mezcla constante pero suave en condiciones completamente oscuras era fundamental para mantener el contacto entre las células de E. gracilis y el material sustrato suspendido, evitando al mismo tiempo un esfuerzo cortante excesivo. La mezcla insuficiente promovió la sedimentación y gradientes de nutrientes localizados, confundiendo tanto las mediciones de crecimiento como de viabilidad, especialmente en medios no^{autoclavados 12}. Estas observaciones coinciden con informes previos que muestran que la heterogeneidad espacial y la exposición desigual al sustrato pueden dificultar las respuestas fisiológicas en los sistemas de cultivo microbiano. Por tanto, el protocolo enfatiza la inversión rutinaria en lugar de la agitación continua como un compromiso práctico entre homogeneidad e integridad del cultivo.

Para acomodar la variabilidad inherente a los sustratos basados en yuca, el protocolo incorpora múltiples puntos de resolución de problemas y flexibilidad. El autoclavado de medios fermentados de yuca mejoró la consistencia a corto plazo al reducir la carga microbiana y alterar la estructura del sustrato, especialmente durante las primeras etapas de adaptación. En cambio, los medios no autoclavados pueden utilizarse eficazmente tras una adaptación exitosa, siempre que la densidad y mezcla del inoculo sean suficientes para mantener un crecimiento estable. Este enfoque por etapas es coherente con estudios previos que demuestran que la presión selectiva gradual permite a las poblaciones microbianas tolerar la creciente complejidad ambiental a lo largo del^{tiempo 13,14}. El seguimiento longitudinal fue esencial en este contexto, ya que las reducciones transitorias en el crecimiento o la viabilidad se recuperaban frecuentemente en pasajes posteriores sin comprometer el éxito global de la adaptación.

Los ensayos de viabilidad y el seguimiento morfológico sirvieron como herramientas diagnósticas rápidas durante todo el proceso de adaptación. La exclusión de Trippan Blue proporcionó un indicador cuantitativo de la robustez fisiológica, mientras que la evaluación basada en microscopía de motilidad y encystamiento ofreció una alerta temprana de condiciones subóptimas como una carga excesiva del sustrato o una aclimatación^{tardía 15}. Es importante destacar que el protocolo enfatiza las tendencias a lo largo del tiempo más que las mediciones puntuales, ya que las fluctuaciones a corto plazo en viabilidad o morfología no siempre predecían el fallo a largo plazo del cultivo. Esta perspectiva longitudinal resultó fundamental para distinguir las respuestas transitorias al estrés del deterioro fisiológico sostenido. Las reducciones en los niveles detectables de cianuro observadas durante el cultivo sugieren una desintoxicación parcial de sustratos derivados de la yuca bajo las condiciones descritas. Estas reducciones pueden deberse a una combinación de degradación, volatilización y actividad microbiana asociadas a la fermentación. Aunque los mecanismos bioquímicos específicos y la cinética de la eliminación del cianuro no se investigaron directamente en este estudio, estas observaciones apoyan la inclusión del monitoreo de cianuros como un indicador práctico de la transformación del sustrato y la viabilidad del cultivo durante la adaptación.

Deben reconocerse varias limitaciones del método. En primer lugar, el porcentaje de proteína bruta por sí solo no captura completamente el valor nutricional ni la calidad funcional de la proteína, y la interpretación debe considerar la producción total de biomasa junto con métricas^{composicionales 16}. En segundo lugar, el uso de sustratos heterogéneos mínimamente procesados introduce variabilidad que no puede eliminarse, ni siquiera con una preparación estandarizada. Este desafío está bien reconocido en el bioprocesamiento agroindustrial¹⁷ y refleja limitaciones del mundo real más que deficiencias experimentales. Tercero, aunque el protocolo está optimizado para cultivo a escala de laboratorio y piloto, la ampliación más allá de los volúmenes a escala de laboratorio requerirá un control adicional de la dinámica de mezcla, la transferencia de osígeno y el manejo de sólidos, así como la consideración de la configuración del reactor y las condiciones hidrodinámicas, como se ha demostrado en otros sistemas microalgales y^{protistas 18}.

En comparación con los métodos existentes de cultivo de E. gracilis que dependen de azúcares refinados o sistemas fototróficos estrictamente controlados, este protocolo ofrece una ventaja metodológica clara al permitir el crecimiento en sustratos derivados de la yuca de bajo coste bajo condiciones totalmente heterotróficas. El enfoque evita la dependencia de fuentes de carbono^{purificadas 19,20} y no requiere infraestructura de iluminación especializada, ampliando la flexibilidad operativa del cultivo de E. gracilis. Esto es especialmente relevante para aplicaciones centradas en la eficiencia de recursos, la valoración de residuos y la producción descentralizada en regiones productoras de yuca.

La importancia más amplia de este método radica en su aplicabilidad a áreas de investigación centradas en la adaptación microbiana, el bioprocesamiento sostenible y la valoración de la biomasa. Al combinar la exposición incremental de sustratos con herramientas de monitorización simples y de bajo coste, el protocolo proporciona un marco reproducible para integrar sustratos no tradicionales en los flujos de trabajo de cultivo microbiano. Aunque se desarrollaron para E. gracilis, los principios subyacentes de adaptación por etapas, evaluación longitudinal del rendimiento y toma de decisiones informada por morfología son ampliamente transferibles a otros sistemas microalgales y protistas que se están explorando para aplicaciones de bioeconomía circular^21,22. Como tal, este protocolo sirve no solo como método de cultivo, sino también como un marco generalizable para la adaptación microbiana aplicada bajo restricciones reales del sustrato. Este método fue diseñado teniendo la accesibilidad como objetivo principal y, por tanto, es más adecuado para laboratorios o entornos de investigación aplicada con infraestructura microbiológica básica y acceso a recursos biológicos clave, específicamente cultivos de Euglena gracilis y sustratos derivados de la yuca. Además, el sistema ofrece flexibilidad temporal, ya que los medios basados en yuca pueden prepararse y fermentarse durante todo el año sin restricciones estacionales. Aunque este protocolo fue desarrollado y validado a escala de laboratorio, su uso de sustratos derivados de yuca de bajo coste y requisitos mínimos de procesamiento apoyan una posible escalabilidad a sistemas de cultivo de mayor tamaño.

Aunque este protocolo establece un marco reproducible para la adaptación y el cultivo, serán importantes análisis cuantitativos adicionales de la cinética del crecimiento, la productividad de la biomasa y la eficiencia de conversión de sustratos para optimizar el rendimiento en aplicaciones a gran escala o industriales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Autoclave - 533LS Steam Esterilizador	Getinge	533LS	Esterilización por vapor de medios de yuca. Esterilice los medios usando el ciclo líquido.
Bright-Line™ Hemacitómetro reemplazo cubreobjetos	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Cubreobjetos gruesos especializados diseñados para uso en hemacitómetro.
Pulpa seca de yuca	Psaltry International	N/A	Sustrato de yuca proporcionado
Pellets de yuca	Psaltry International	N/A	Sustrato de yuca proporcionado
Pellas de yuca	Psaltry International	N/A	Sustrato de yuca proporcionado
Sustrato de yuca (garri)	Proveedor local	N/A	Garri derivado de la yuca fuente de carbono preparado con agua desionizada.
Centrífuga Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugadora	Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugadora	75004241	Capaz de ≥3,500 × g, usada para recolección de biomasa.
Tubos de centrífuga Ej. Axygen (A Marca Corning)	Corning	MCT-150-C-S	Estéreo, mínimo 1.5 mL de volumen
Agua limpia Ej. UltraPure™ Agua desionizada libre de DNasa/RNasa	ThermoFisher Scientific	10977035	Desionizada o destilada. Usada para la preparación de medios
Microscopio de luz compuesta	Olympus	N/A	Microscopio compuesto estándar adecuado para observación y conteo rutinario de células.
Prueba de cianuro Tiras, colorimétrico. CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	Detección semi-cuantitativa de cianuro. Elimínelas como desperdicios peligrosos
Barquilla de pesaje estándar estéril	Fisher Scientific	01-549-750	Usada para pesar sustratos de yuca y biomasa seca.
Euglena gracilis (linaje adaptado )	N/A	N/A	Cepa adaptada a la yuca generada en este estudio
Euglena gracilis (tipo salvaje)	N/A	N/A	Cepas de referencia no adaptadas. Mantenga las mismas condiciones estándar.
Componentes del medio de crecimiento de Euglena	Varios	N/A	Medio basal de Euglena preparado según formulaciones estándar de laboratorio.
Secador de congelación FreeZone 6 litros	Labconco	70061xxxx	Usado para la deshidratación de biomasa
Hemacitómetro con líneas estándar	Weber Scientific	NC1587539	Usado para el conteo manual de células.
Agitador magnético con placa caliente	IKA	N/A	Opcional; mejora la consistencia durante la preparación de medios y suspensión de sustratos.
Micropipetas (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Pipetas de volumen ajustable usadas para transferencias líquidas asépticas.
Minicentrífuga	Eppendorf	N/A	Opcional; facilita la sedimentación rápida durante la recolección de biomasa.
Parafilm	Bemis	PM996	Usado para el sellado temporal de matraces o placas cuando no hay disponibles tapas con ventilación.
Tiras indicadoras de pH	Fisher Scientific	13-640-520	Alternativa al medidor de pH para la evaluación cualitativa rápida de los medios de cultivo.
Medidor de pH con sonda Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de sobremesa	Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de sobremesa	13-645-519	Calibrado antes de su uso. Para medir el pH del sobrenadante del cultivo
Almacenamiento refrigerado (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Almacenamiento a corto plazo de los medios
Incubadora de agitación (oscura)	Thermolyne	M49235	Incubadora de agitación orbital capaz de 100–150 RPM, rango de temperatura 24–28 °C; usada en condiciones oscuras para apoyar el crecimiento heterotrófico de Euglena.
Botella de spray (32oz)	Boardwalk	BWK03010	Usada para esterilización en bancada y manejo aséptico rutinario (solución de etanol al 70%)
Software de hoja de cálculo	Microsoft Excel	N/A	Recolección, organización y análisis de datos
Puntas de pipeta estériles	Eppendorf	N/A	Puntas estériles y desechables compatibles con pipetas P20, P200 y P1000.
Pipetas serológicas estériles (5, 10, 25 mL)	Corning	N/A	Pipetas estériles envueltas individualmente, usadas para transferencias y muestreo de cultivos.
Solución de azul de tripán 0.4%, líquida, estéril filtrada, adecuada para cultivo celular	Sigma-Aldrich	T8154	Colorante vital usado para la evaluación de viabilidad celular mediante el ensayo de exclusión de azul de tripán.
Tubos para recolección de muestras (50 mL)	Falcon	14-432-22	Para muestras de pH y cianuro
Matraces Erlenmeyer con tapa de ventilación (250–500 mL)	Matraces Erlenmeyer de policarbonato Corning® de 250 mL con tapa de ventilación	431144	Matraces Erlenmeyer de policarbonato con tapas ventiladas; autoclavables; usados tanto para cultivos líquidos estériles como no estériles.
Contenedor de desechos	Varios - en cumplimiento con los estándares de laboratorio establecidos	N/A	Bolsas de autoclave y contenedores de desechos de material punzante o vidrio para eliminación conforme a la bioseguridad.