Artículo de método

Perfusión microvascular monitorizada mediante imagen láser de contraste de speckles durante la lesión por isquemia renal-reperfusión en ratones

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DOI:

10.3791/70762

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27 de febrero de 2026

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1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

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En este artículo

Resumen

Se utilizó un sistema láser de imagen con contraste de motas para monitorizar los cambios en el flujo sanguíneo microvascular renal durante la isquemia-reperfusión unilateral tras la resección del riñón derecho en ratones.

Resumen

La imagen láser con contraste de moteas (LSCI) es una técnica no invasiva para medir la perfusión sanguínea superficial en grandes áreas. Gracias a su alta resolución espaciotemporal, la LSCI semicuantifica los cambios heterogéneos del flujo sanguíneo en diferentes regiones dentro del área visualizada. Aquí demostramos la técnica de la LSCI para registrar el flujo sanguíneo durante una lesión unilateral de isquemia-reperfusión renal (IRI) en ratones. Tras la nefrectomía derecha, se ajustaron la posición del ratón y el punto focal del objetivo del sistema LSCI para asegurar que el riñón izquierdo estuviera en el campo visual. Se realizaron escáneres LSCI antes, durante y después de la isquemia del riñón. Además, seleccionando las regiones de interés (ROI), se monitorizó simultáneamente el flujo sanguíneo en dichas regiones. El método de LSCI visualiza la perfusión microvascular del riñón y permite un mapeo en tiempo real del flujo sanguíneo. Puede utilizarse para monitorizar el flujo sanguíneo microvascular y evaluar el efecto de una intervención sobre la cinética de reperfusión y la homogeneidad espacial durante la IRI renal del ratón u otros modelos animales similares.

Introducción

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) es una de las principales causas de lesión renal aguda (AK), que se asocia con alta morbilidad y alta mortalidad enpacientes 1,2. El cambio en la hemodinámica renal es uno de los factores críticos de laAKI 1 inducida por RI. La disfunción microcirculatoria evocada por RI es una de las principales causas del desarrollo de lesiones, que conduce a la privación de ojigeno y a la disfunción mitocondrial delas células 3,4. Por lo tanto, monitorizar los cambios en el flujo sanguíneo en tiempo real es un método eficaz para asegurar la isquemia o reperfusión exitosa del riñón y evaluar el grado de IRI en modelos animales para el trastorno.

Existen múltiples técnicas para medir la perfusión microvascular de tejidos, incluyendo la fluidmetría Doppler láser (LDF)5, la autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa (NADH) 6,7,8, la imagen infrarroja9 y la angiografía de verde de endocianina(ICG) 10. Entre ellas, la imagen infrarroja y la autofluorescencia NADH miden indirectamente la perfusión microvascular. La LDF, utilizando una sonda óptica, solo monitoriza el flujo sanguíneoregional 5, y el LDF de escaneo no es lo suficientemente rápido para monitorizar los cambios en tiempo real de la perfusión microvascular tisular bajo las condiciones I/R 11. La angiografía ICG también puede identificar los vasos renalesbloqueados 10, pero requiere la administración de un agente de contraste, lo que limita su uso a un número limitado demediciones 12. La imagen láser por contraste de moteas (LSCI) es un método eficiente y no invasivo para monitorizar la microperfusión renal en tiemporeal 13. Se ha utilizado para generar información espacialmente resuelta relacionada con la dinámica del flujo sanguíneo. A medida que un haz coherente se proyecta sobre una superficie rugosa, las ondas de luz reflejadas o dispersadas interfieren entre sí debido a pequeñas diferencias de trayectoria, formando una distribución aleatoria de patrones de manchas brillantes y oscuras, conocida como "mancha". La LSCI mapea la velocidad del flujo sanguíneo en tejidos superficiales analizando el grado de borrosidad de la "mancha dinámica" producida cuando la luz láser irradia eltejido 12,14,15. En este estudio, el sistema LSCI operaba a una longitud de onda láser de 785 nm con una resolución espacial de 3 μm, un campo de visión ajustable entre 6,3 mm × 4,7 mm y 42 mm × 31 mm, y una velocidad de imagen de hasta 120 fotogramas por segundo, lo que permite un mapeo en tiempo real y de alta resolución de la perfusión microvascular cortical. A la luz de estas ventajas, la LSCI se ha aplicado en diversos contextos experimentales y clínicos para el monitoreo del flujo sanguíneo, incluyendo heridas porquemaduras 16, perfusiónretiniana 17, flujo sanguíneo cerebral18, esófago19 eintestino 20.

Cabe señalar que el LSCI evalúa principalmente la perfusión en tejido superficial, proporciona valores relativos de flujo en lugar de absolutos, y puede verse influenciado por propiedades ópticas tisulares y artefactos de movimiento. Estas características inherentes se tienen en cuenta al interpretar los datos de imagen.

Este trabajo, utilizando un modelo que involucraba nefrectomía derecha para facilitar la exposición e imagen del riñón contralateral, monitorizó los cambios en la perfusión microvascular antes, durante y después de la isquemia en un modelo ratón unilateral renal I/R utilizando LSCI y demostró la heterogeneidad espacial del flujo sanguíneo en la superficie del riñón.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales cumplían con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou. Para eliminar diferencias basadas en el género y la cepa en los efectos de IRI, solo se utilizaron ratones machos C57BL/6N en el estudio. Todos los ratones fueron emparejados en edad y peso para obtener resultados comparables. Se utilizó un tamaño de muestra de n = 5, consistente con estudios metodológicos previos que utilizaron LSCI para la validacióntécnica 21. Los animales recibieron cuidados humanitarios y fueron sacrificados tras los experimentos por inhalación de CO2 . Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

Antes de comenzar la cirugía, activa el sistema de imagen de contraste con moteado láser. El sistema utilizado en este estudio funciona con un láser de 785 nm. Ajusta la distancia de trabajo a aproximadamente 15-20 cm por encima del campo quirúrgico. El sistema calcula el flujo sanguíneo en Unidades de Perfusión de Láser Speckle (LSPU) basándose en el algoritmo de contraste espacial. Asegúrate de que el instrumento esté calentado y estable antes de continuar.

1. Preparación animal y laparotomía

  1. Esteriliza la mesa quirúrgica antes de cada procedimiento. Prepara y coloca todos los materiales necesarios (instrumentos esterilizados y hisopos de algodón, gasas, anestésicos prediluidos, almohadilla térmica, pinza vascular, solución salina, crema depilatoria, bolas de algodón, puntos, antisépticos cutáneos y sutura) sobre la mesa quirúrgica.
  2. Administrar meloxicam (0,2 mg/kg de peso corporal; inyección subcutánea) al ratón con 30 minutos de antelación para aliviar el dolor.
  3. Vierte una cierta cantidad de solución salina esterilizada en un recipiente limpio. Luego coge una gasa y corta una abertura adecuada en el centro.
  4. Anestesiar a un ratón mediante una inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 2,5% (400 mg/kg de peso corporal; previamente diluido en solución salina estéril).
    NOTA: El tribromoetanol se utilizó como anestésico durante el proceso de nefrectomía derecha. Y se utilizó isoflurano al 1% para anestesia durante procedimientos prolongados de monitorización del flujo sanguíneo.
  5. Coloca el ratón sobre la almohadilla térmica con cinta y usa crema depilatoria para eliminar el vello de la zona del abdomen del ratón. Durante la cirugía, utiliza la almohadilla térmica para mantener la temperatura rectal entre 37 °C ± 0,5 °C.
  6. Desinfecta la piel de la zona quirúrgica primero con alcohol al 75% y luego con iodóforo usando un hisopo de algodón.
  7. Usa pinzas para pellizcar el dedo del pie del ratón. Cuando el ratón no muestre respuesta al dolor, haz una incisión vertical a lo largo de la línea media del abdomen con unas tijeras. Separa suavemente la piel del peritoneo, luego corta el peritoneo y entra en la cavidad abdominal.
  8. Aplica un separador en el ratón para optimizar la visibilidad y cubre el campo operatorio con gasa, alineando el espacio de la gasa con la cavidad abdominal y humedecéndolo con solución salina.

2. Nefrectomía derecha

  1. Utiliza un hisopo de algodón para empujar suavemente el intestino hacia un lado de la gasa, dejando al descubierto el riñón derecho y los tejidos circundantes. Dobla la gasa para cubrir el intestino y humédelo con solución salina normal para evitar que el intestino se seque.
  2. Usa pinzas en ángulo para levantar el uréter derecho. Pasa dos hilos de sutura 6-0 a través del uréter y realiza la ligadura en dos posiciones.
  3. Transecta el uréter entre las dos ligaduras con microtijeras.
  4. Después de humedecer las bolas de algodón con solución fisiológica normal, utiliza pinzas finas para recoger las bolas de algodón, empuja suavemente el hígado hacia arriba y fíjalo con las bolas de algodón, exponiendo los riñones y los vasos sanguíneos de su lado derecho.
  5. Utiliza pinzas angulares para separar de forma sin rodas las almohadillas de grasa perinefrica a lo largo del lateral del riñón derecho hasta que la arteria y la vena renal queden completamente expuestas.
    NOTA: Separar simultáneamente la masa de tejido suprarrenal situada por encima del riñón.
  6. Deslica cuidadosamente las pinzas anguladas bajo la arteria y vena renal para crear un canal. Luego, pasa una sutura trenzada de seda 6-0 alrededor de los recipientes para ligarlos.
  7. Corta la arteria renal y la vena ocluidas situadas cerca del riñón. Retira el riñón junto con el tejido adherido restante.
  8. Quita la bola de algodón que se usa para sujetar el hígado.

3. Monitorización del flujo sanguíneo renal con Imagen de Contraste Láser de Speckles (LSCI) durante isquemia-reperfusión

  1. Activa el sistema LSCI y el software dedicado del instrumento.
  2. Haz clic en Imagen original y Previsualización para ver la imagen en bruto y sin procesar del campo quirúrgico.
  3. Cambiar la posición de los ratones, mantener la anestesia usando isoflurano al 1% administrado a 600 mL/min mediante un cono nasal, y ajustar la ampliación de la cámara mientras observas la imagen original para lograr una vista clara del riñón objetivo.
  4. Haz clic en Pantalla Simultánea para ver la imagen del flujo sanguíneo en tiempo real. Ajusta la ampliación a 2,5× y selecciona Ajuste Automático de Flujo Sanguíneo para optimizar la imagen. Luego, bloquea los parámetros de flujo sanguíneo. Además, configurado para grabar un fotograma de la imagen cada 5000 ms.
    NOTA: Se pueden usar bolas de algodón húmedas para asegurar la posición estable del riñón y mantener alejados los órganos y tejidos circundantes, aumentando la distinción entre la zona renal y el fondo.
  5. Ajusta el tamaño de los parámetros del área cuadrada a 112 y organiza las 5 áreas cuadradas de forma uniforme en una orientación fija en la vista renal. Haz clic en Registro y Registro de Imágenes en Tiempo Real para comenzar a registrar datos de flujo sanguíneo.
    NOTA: La máquina registrará automáticamente las unidades de perfusión de speckle láser (LSPU), que representan las unidades de flujo sanguíneo en tiempo real en los ROI y pueden utilizarse para análisis. Durante el proceso de detección, el movimiento relacionado con la respiración o los cambios ambientales pueden hacer que el campo visual se desplace. Si el sistema indica esto en el área de detección, la grabación actual debe detenerse. Luego haz clic en Registro de imagen en tiempo real y vuelve a grabar .
  6. Tras registrar una línea base de 30 minutos, separa el tejido adiposo que rodea los vasos renales izquierdos. Utiliza las pinzas hemostáticas para agarrar una micropinza y colócala sobre la arteria y vena renal izquierda cerca del hilo. Continúa monitorizando en tiempo real otros 30 minutos.
  7. Suelta la micro-pinza para iniciar la reperfusión. Monitoriza y registra la recuperación en tiempo real del flujo sanguíneo microvascular renal.
  8. Una vez que se monitoriza la reperfusión del flujo sanguíneo durante al menos 60 minutos, deja de monitorizar y sutura la incisión abdominal con una sutura trenzada de seda 7-0.

4. Recuperación y atención postoperatoria

  1. Administrar líquidos con una inyección intraperitoneal de 1 mL de solución salina para evitar la deshidratación tras la cirugía.
  2. Mantén los ratones en la almohadilla térmica. Vigila cuidadosamente a los ratones hasta que recuperen la conciencia, parezcan alerta y sean capaces de enderezarse.

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Resultados

Este artículo tenía como objetivo detectar cambios en el flujo sanguíneo renal durante la AKI inducida por IR. Por ello, empleamos un modelo murino común que implica nefrectomía derecha (Figura 1A) seguida de un procedimiento de RI en el riñón contralateral (Figura 1B). Como se requería monitorización en tiempo real del flujo sanguíneo durante la IRI, todas las manipulaciones en los ratones se realizaron en la región del instrum...

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Discusión

Este trabajo describe la aplicación de un sistema LSCI para la visualización en tiempo real y de alta resolución de la dinámica del flujo sanguíneo microvascular renal durante IRI en ratones. El protocolo ofrece una ventaja significativa sobre las mediciones tradicionales de endpoint o métodos con resolución espacial limitada, como el LDF, al proporcionar un mapa de perfusión bidimensional que captura la heterogeneidad regional dentro de la microcirculación renal. La eficiencia y utilida...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Programa de Investigación en Equipo Innovador para Universidades de la Provincia de Guangdong (2022KCXTD009).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Recipiente absorbente (para anestesia)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, China10-0210
Alcohol, médico (75%)HENGLIYA, Xinjiang, ChinaN/ADesinfectante para la piel
Vaporizador anestésicoMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
Hisopos de algodónQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Chinahttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Crema depilatoriaVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
Vendaje de gasaWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Chinahttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
Almohadilla térmicaRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, ChinaHD-1902Para mantener la temperatura corporal
Solución de iodóforoTaixinkang, Jinxian, Chinahttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmAntiséptico para la piel
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd, ChinaR510-22-10Anestésico inhalatorio
Sistema de imagen por contraste de motas láser (LSCI)Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, ChinaSIM BFI HR PROSistema equivalente al MoorFLPI-2
MeloxicamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Chinahttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg por kg de peso corporal; analgésico
Micro-abrazaderaShanghai Medical Instrument(Group) Co., Ltd, ChinaW40140Pinza vascular
Suero fisiológico normal (0,9% cloruro de sodio)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Chinahttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Sutura trenzada de seda (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Chinahttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlPara la ligación de vasos
Sutura trenzada de seda (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Chinahttps://www.weigaoholding.com/Para el cierre de heridas, suturas quirúrgicas no absorbibles con la aguja curva
Jeringuilla (1 mL)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Chinahttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlCon aguja de 26 g
TribromoetanolSigma-AldrichT48402-100Gsolución del 2,5%; Anestésico inyectable

Referencias

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