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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Científica del Servicio de Salud de Concepción. Se obtuvo tejido óseo humano de cabezas femorales donado por pacientes sometidos a cirugía de reemplazo de cadera en el Hospital de Traumatología de Concepción, Chile, tras consentimiento informado por escrito. Las muestras se almacenaban a −80 °C hasta su uso. Todos los procedimientos cumplieron con las directrices institucionales para el uso ético del tejido humano en la investigación. Todo el tejido óseo humano se obtuvo de las cabezas femorales donadas por pacientes del Hospital de Traumatología de Concepción, Chile, tras consentimiento informado y con la aprobación del Comité de Ética Científica del Servicio de Salud de Concepción. Todos los procedimientos cumplen con las directrices institucionales para el uso de tejidos humanos.
1. Síntesis de GelMA
- Disuelva 10 g de gelatina tipo A A en 100 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,5) a 60 °C bajo agitación constante.
- Reduce la temperatura a 50 °C y añade 5 mL de anhídrido metacrílico a una dosis de 0,5 mL/min, removiendo suavemente durante 1–3 horas.
- Diluye la mezcla de reacción 5× con PBS precalentado a 40 °C para detener la reacción.
- Dialise la solución utilizando una membrana de 12–14 kDa frente a 3–5 L de agua destilada a 40 °C durante 5–7 días, reemplazando el agua diariamente.
NOTA: (Paso crítico) Asegurarse de que el agua sea reemplazo diario completo para eliminar el anhídrido metacrílico no reaccionado.
- Liofilizar la solución diálisa durante 24 horas y almacenar el GelMA liofilizado a 4 °C hasta su uso.
2. Preparación de hidrogel GelMA
- Prepara lotes de 10 mL de hidrogeles GelMA a 5, 10 o 15 p/v%.
- Disuelva 0,5, 1,0 o 1,5 g de GelMA liofilizado en 9,5 mL de agua desionizada a 50 °C.
- Enfría la solución a 37 °C.
- Añade 0,5 mL de solución fotoiniciadora Irgacure 2959 (0,5 w/v% en etanol absoluto).
- Mezcle suavemente y mantenga la solución a 37 °C hasta que se filtre estéril a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa de 0,22 μm.
3. Descelularización ósea
- Deshielo de las cabezas femorales gradualmente hasta 25 °C. Corta cada cabeza femoral por la mitad y luego en trozos más pequeños.
- Sumergir las piezas en agua destilada estéril a 60 °C y sonicar durante 15 minutos (40 kHz, continuo).
- Lava muestras con 300 mL de agua destilada precalentada a 60 °C mientras agitas a 200 rpm durante 5 minutos.
- Centrifugar a 1850 × g durante 15 minutos a 25 °C. Repite los pasos de lavado y centrifugación tres veces.
- Esterilizar el tejido mediante sonicación (40 kHz, continuo) durante 10 minutos a 60 °C en una solución que contenga un 3% de peróxido de hidrógeno y 0,02% de ácido peroxiacético.
- Transfiere el tejido a 300 mL de etanol al 70% y sonica (40 kHz, continuo) durante 10 minutos a 21 °C.
- Lava las muestras dos veces con agua destilada de 300 mL, agita a 200 rpm durante 10 minutos a 60 °C y centrifuga a 1850 × g durante 15 minutos a 25 °C.
- Primero, precongelar el hueso a -80 °C durante 4 horas, luego liofilizar el hueso descelularizado durante 24 horas en una base ancha para asegurar un secado uniforme y evitar una altura excesiva de la muestra a 0,05 mbar entre -40 y -60 °C.
NOTA: (Paso crítico) Asegúrese de que la muestra no supere los 2–3 cm de altura dentro del recipiente para evitar una liofilización incompleta.
4. Preparación de micropartículas óseas
- Colocar los fragmentos óseos descelularizados en matrazas Erlenmeyer de 250 mL en la solución esterilizante y homogeneizar usando un homogeneizador hasta obtener una solución blanca uniforme (Vídeo suplementario 1).
- Centrifugar a 1850 × g durante 15 minutos a 25 °C, descartar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con 300 mL de agua destilada a 25 °C bajo agitación a 200 rpm durante 10 minutos. Realizar una centrifugación final a 1850 × g durante 15 minutos a 25 °C.
- Liofilizar (0,05 mbar a -40 a -60 °C) el material resultante durante 48 horas y almacenarlo a -80 °C hasta su uso.
- Se molerá mecánicamente el hueso cortical o medular liofilizado utilizando un mortero cerámico esterilizado hasta obtener un polvo fino (Figura 1).
- Pasa el polvo por una malla o tamiz de 200 μm, pesa el material final y guarda a -80 °C.
NOTA: (Paso crítico) Asegúrate de que el polvo esté completamente seco antes de tamizar para evitar la agregación y una selección inexacta del tamaño de las partículas.
Vídeo suplementario 1: Procedimiento de homogeneización ósea. Homogeneización de fragmentos óseos descelularizados utilizando un homogeneizador hasta que se produzca una suspensión blanca uniforme. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura 1: Preparación de micropartículas óseas. (A) Fragmentos óseos descelularizados tras la homogeneización con homogeneizador OV5 y almacenamiento a -80 °C. (B,C) Mortero cerámico esterilizado utilizado para moler hueso descelularizado hasta convertirlo en un polvo fino. (D) Micropartículas óseas descelularizadas finales tras el tamizado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
5. Fabricación de gel óseo
- Prepara 10 p/v% de GelMA disolviendo 1 g de GelMA en 9,5 mL de agua desionizada a 50 °C.
- Enfría la solución a 37 °C y añade la solución fotoiniciadora Irgacure 2959.
- Mantener la solución a 37 °C y realizar una filtración estéril usando un filtro de 0,22 μm.
- Añade micropartículas óseas descelularizadas (DBMP) al 1% en peso y volta.
- Mezclar y pipetear arriba y abajo con cuidado, evitando crear burbujas, a 40 °C hasta obtener una suspensión homogénea que forme gel óseo (BG).
- Guarda la glucosa a 4 °C durante hasta 2 semanas.
NOTA: (Paso crítico) Mantener el hidrogel por encima de su temperatura de gelificación (≥37 °C) antes de incorporar la célula para evitar una solidificación prematura.
6. Cultivo primario de osteocitos
- Extracción de médula ósea y lavado inicial
- Extraer y picar tejido de médula ósea del interior de la cabeza femoral utilizando instrumentos quirúrgicos estériles (Figura 2).
- Transfiere el tejido picado a una placa de Petri estéril.
- Lava el tejido tres veces con medio de cultivo α-MEM suplementado con solución antibiótica-antimicótica (100 μg/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina).
- Enjuaga una vez con la Solución Equilibrada de Sal de Hank (HBSS).
NOTA: (Paso crítico) Minimizar el tiempo entre la extracción y el procesamiento del tejido para preservar la viabilidad celular.
- Digestión enzimática
- Incuba el tejido en solución de colágenosa tipo I durante 25 minutos a 37 °C con una agitación suave.
- Lava con HBSS.
- Repite los pasos 6.2.1–6.2.2 dos veces más (tres digestiones totales de colagenasa).
- Incubar el tejido en 0,5 mM de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) durante 25 minutos a 37 °C.
- Lava con HBSS y repite el paso EDTA dos veces más.
- Realiza una última digestión con colagnasa tipo I (25 minutos a 37 °C), seguida de un lavado con HBSS.
NOTA: (Solución de problemas) Una digestión incompleta puede resultar en un bajo rendimiento celular; Extender la incubación enzimática entre 5 y 10 minutos si es necesario.
- Recuperación y cultivo celular
- Recoge la solución de colagenasa y transfiere el lavado final de HBSS a un tubo centrífugo de 50 mL.
- Centrifuga a 1.000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 2 mL de α-EM completo.
- Siembra la suspensión celular en dos frascos de cultivo T75 e incuba a 37 °C con un 5% de CO₂.
NOTA: Cambiar el medio de cultivo cada 2–3 días hasta alcanzar una confluencia adecuada (Figura 3).
Figura 2: Extracción de tejido de médula ósea. (A) Cabeza femoral obtenida mediante cirugía de reemplazo de cadera, mostrando la región medular utilizada para el aislamiento celular. (B) Fragmentos de hueso medular picados colocados en una placa de Petri estéril antes de la digestión enzimática. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Cultivo primario de osteocitos. Osteocitos adheridos y proliferando en una monocapa dentro de un T75 tras el aislamiento del hueso medular humano. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
7. 3D cultivo celular
- Precalienta la cantidad de hidrogel de glucosa a 37 °C.
NOTA: (Paso crítico) Asegúrese de que la zona de trabajo esté libre de corrientes de aire; el enfriamiento acelera el gelado prematuro.
- Despega osteocitos cultivados y centrifuga a 500 × g durante 5 minutos en un tubo de 15 mL.
- Suspende el pellet en 200 μL de medio de cultivo y mézclalo con el hidrogel de glucosa para obtener una densidad celular final de al menos 1000 células/μL (a partir de ahora se denominará biotinta).
- Aspirar 50 μL de la biotinta usando una pipeta de 1000 μL y mantener a 37 °C hasta la deposición.
- Pipeta 50 μL de la biotinta por construcción en cada pozo de la placa de cultivo (Vídeo suplementario 2); Deja aproximadamente 5 minutos para la gelificación física a temperatura ambiente (Figura 4).
- Expone cada pozo a luz ultravioleta de 365 nm durante 1 minuto para lograr una reticulación irreversible (0,30 J/cm 2).
- Añade medio de cultivo e incuba los constructos a 37 °C, 5% de CO2 para los puntos de tiempo requeridos. Usa una placa separada para cada momento de tiempo.
Figura 4: Preparación de constructos de cultivo celular 3D. La placa de pozo que contiene GelMA cargada de células se construye inmediatamente después del pipeteo y tras la reticulación UV (365 nm). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Vídeo suplementario 2: Preparación de constructos 3D cargados de celdas. Deposición de mezclas de celda de hidrogel en una placa de 12 pozos mediante una técnica sencilla de pipeteo antes de la reticulación UV. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
8. Pruebas de biocompatibilidad
- Manchas vivas/muertas
- Cultiva los andamios cargados de células durante los intervalos de tiempo deseados.
- Lava suavemente con PBS estéril.
- Incubar los constructos durante 30 minutos en la oscuridad con una solución viva/muerta que contenga 0,2% de homodímero de etidio-1 (EthD-1) y 0,05% de calceína AM en PBS.
- Imagen inmediata usando un microscopio de fluorescencia con filtros para calceína AM (~495/515 nm) y EthD-1 (~495/635 nm). Los conjuntos estándar de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y Texas Red son compatibles con la detección de calceína AM y EthD-1, respectivamente.
- Identificar células vivas por fluorescencia citoplasmática verde y células muertas por fluorescencia nuclear roja.
NOTA: Las imágenes planares pueden procesarse usando ImageJ (Fiyi). La lente objetivo, el tiempo de exposición, la ganancia y la intensidad de la iluminación se mantuvieron constantes para todas las muestras comparadas y se ajustaron solo para evitar la saturación de la señal. Para minimizar la mala interpretación causada por la autofluorescencia, se mantuvieron los mismos ajustes de adquisición para todas las muestras dentro de cada experimento, y se utilizaron observaciones de control de constructos de andamiaje/micropartículas óseas sin células para reconocer el patrón de fluorescencia de fondo asociado al biomaterial. Estos controles nos permitieron distinguir la señal derivada de partículas de la tinción verdadera de células redondeadas durante la interpretación de imágenes.
- Cuantificación de Alamarblue
- Prepara una solución de trabajo de alamarblue al 5% en medio completo.
- Incubar andamios en solución de alamarBlue durante 2,5 horas a 37 °C y 5% de CO₂, protegidos de la luz.
- Transfiere 100 μL de sobrenadante a una placa de 96 pozos en triplicado, incluyendo los controles.
- Mide la fluorescencia a 360/40 nm de excitación y 460/40 nm de emisión.
- Normaliza los valores de fluorescencia a controles para determinar la actividad metabólica relativa.
