Construcción de modelos eficientes de blastocistos de ratones derivados de células madre para estudios medioambientales

Summary

Este protocolo describe la generación y el análisis de iGATA4-blastoides, un modelo escalable basado en células madre que recapitula características clave del blastocistos del ratón, incluyendo la organización del linaje y la cavitación, y permite una evaluación reproducible y de alto rendimiento de perturbaciones ambientales y moleculares que afectan al desarrollo embrionario temprano.

Abstract

Los modelos embrionarios basados en células madre ofrecen una plataforma poderosa para investigar el desarrollo temprano de mamíferos y su sensibilidad a las perturbaciones ambientales. Aquí se presenta un protocolo robusto y accesible para generar blastoides de ratón de alta fidelidad utilizando células madre embrionarias (ESCs), células madre trofoblastas (TSC) y células madre embrionarias diseñadas para la expresión inducible de GATA4 (iGATA4-ESC). Este sistema produce blastoides iGATA4 que recapitulan con precisión la morfología natural de los blastocistos E4.5, las proporciones de linaje y las firmas transcripcionales, proporcionando un modelo in vitro fiable de los compartimentos primitivos del endodermo (PE), el epiblasto (EPI) y el trofectodermo (TE). Este protocolo demuestra primero cómo mantener y preparar las tres poblaciones de células madre necesarias para la formación de blastoides. A continuación, se detalla el ensamblaje paso a paso de los blastoides iGATA4 bajo condiciones de cultivo previo a la implantación, destacando parámetros experimentales críticos. Para permitir una caracterización rigurosa, se proporciona un flujo de trabajo probado para la fijación, tinción e imagen de blastoides. Finalmente, se presenta un ejemplo que demuestra cómo los blastoides iGATA4 pueden usarse para ensayos de alto rendimiento. Al exponer grandes cohortes de blastoides a factores ambientales definidos, los cambios en la morfología, la asignación de linaje y la progresión del desarrollo pueden cuantificarse rápida y de forma reproducible. En conjunto, este protocolo establece una plataforma escalable para modelar el desarrollo preimplantación, analizar decisiones tempranas de linaje y realizar cribados multiparamétricos para evaluar las influencias ambientales o moleculares en la formación de blastocistos.

Introduction

Comprender cómo se autoensamblan los embriones de mamíferos tempranos y cómo los factores ambientales comunes pueden afectar negativamente su formación requiere sistemas modelo que sean reproducibles, accesibles experimentalmente y escalables. Los modelos integrados similares a embriones generados combinando células madre embrionarias y extraembrionarias proporcionan tal^{plataforma 1,2}. Este protocolo describe cómo las células madre embrionarias (CES), las células madre trofoblastas (TSC) y las ESC diseñadas para la expresión inducible de GATA4 (iGATA4-ESC) pueden ensamblarse bajo condiciones preimplantacionales para producir blastoides con linajes robustos y proporcionados de endodermo primitivo (PE), epiblastos (EPI) y trofetódermos (TE). Trabajos recientes han demostrado que estas estructuras, denominadas blastoides^{iGATA4 3}, se asemejan al blastocisto E4.5 en proporciones de linaje, firmas transcripcionales y expresión funcional de marcadores. Cuando se cultivan in vitro, el 12,5% de estas estructuras pasan a la morfología postimplantación. Es importante destacar que son susceptibles de detectar toxicología y mediciones ambientales.

El desarrollo de esta técnica estuvo motivado por limitaciones en sistemas blastoides^{preexistentes 2,4,5}. Aunque muchos protocolos 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 generan estructuras cavitadas que se asemejan a los blastocistos tempranos, la mayoría lo hacen con una eficiencia relativamente baja o producen estructuras con formación incompleta de PE, identidades celulares indefinidas o proporciones de linaje incorrectas. Estas inconsistencias reducen su idoneidad para estudios mecanicistas y pantallas de perturbación de alto rendimiento. Debido a que la especificación de PE in vivo sigue a la activación de GATA6, SOX17, GATA4 y SOX7²², y los defectos tanto en el PE como en su derivado, el endodermo visceral (VE), dificultan el desarrollo periimplantacional 23,24,25,26,27, reforzando este programa transcripcional in vitro Mejora la fidelidad del blastoide. Los ESC que portan un transgen GATA4 condicional transdiferencian robustamente en VE y, cuando se combinan con ESCs y TSCs en condiciones post-implantación, generan modelos embrionarios integrados que gastrulan e inician la organogénesis 28,29,30,31. Aquí, este principio se adapta a condiciones preimplantacionales, demostrando que los iGATA4-ESC generan PE de forma fiable y producen blastoides que se parecen mucho a los blastocistos^{naturales 3}.

Este método supera limitaciones previas en el modelado de blastocistos utilizando células madre y ofrece una alta eficiencia en la formación de blastoides (el 80% de las estructuras formadas son blastoides, el 75% de las cuales demuestran una correcta organización y proporciones de linaje) y una alta semejanza embrionaria. Además, el ensamblaje modular de iGATA4-blastoides, en el que cada línea de blastocistos se deriva de una población de células madre cultivadas de forma independiente, proporciona acceso experimental directo a cada compartimento embrionario. Estas propiedades hacen que el sistema sea especialmente adecuado para aplicaciones de cribado multiparamétrico. Debido a que produce grandes cohortes de estructuras morfológicamente consistentes con linajes TE, EPI y PE proporcionados con precisión, permite perturbaciones paralelas y cuantificación de respuestas específicas de linaje con un poder estadístico inalcanzable usando embriones naturales.

Como prueba de principio, se midieron los efectos de factores ambientales comunes presentados en rangos fisiológicos 32,33,34,35,36,37,38 sobre el desarrollo de blastoides. Se evaluó el impacto de las modificaciones de cafeína, nicotina, etanol y aminoácidos en la tasa de cavitación, morfología, aptitud y proporciones de linaje a lo largo de una variedad de concentraciones y ventanas temporales de tratamiento. La mayoría de las condiciones (cafeína, etanol, nicotina y aquellas que imitan dietas bajas en proteínas) resultaron en formación aberrante de blastoides y deterioro de la calidad estructural. En cambio, aumentar la concentración de aminoácidos de cadena ramificada (similar a las dietas ricas en proteínas) mejoró la eficiencia y calidad de la formación de blastoides. Estos resultados reflejaron los efectos observados en blastocistos naturales de ratón^{cultivados in vitro-cultivo 3}, demostrando que este sistema captura fenotipos sutiles y dependientes de la dosis y soporta canales de cribado escalables y multidimensionales que no son factibles con embriones naturales.

Dentro del contexto más amplio de la modelización embrionaria, esta técnica demuestra que las mismas células utilizadas para modelar el desarrollo integrado postimplantación también pueden desplegarse como modelos preimplantacionales. Este método es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren modelado escalable de estructuras similares a blastocistos con formación precisa de PE e integración robusta de linajes. Sin embargo, al igual que en otros modelos basados en células madre del blastocisto del ratón, los blastoides iGATA4 no se implantan ni se desarrollan más tras la transferencia a un ratón huésped, por lo que no son adecuados para estudios de interacciones embrión-madre. En conjunto, este protocolo proporciona un enfoque fiable y accesible para generar blastoides de alta fidelidad que modelan las decisiones tempranas de tipo celular en el embrión de mamíferos.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo implican líneas celulares establecidas y se realizaron conforme a las directrices institucionales de bioseguridad del Instituto de Tecnología de California. No se realizó ningún trabajo con animales vivos ni con humanos.

Se han probado múltiples líneas ESC y TSC que soportan la formación de blastoides iGATA4. Los ESC, iGATA4-ESC y TSCs de estudios^{previos 28} se han utilizado con éxito para completar todos los pasos descritos en este protocolo. Los mismos autores describen la generación de iGATA4-ESC a partir de una línea de ESC para ratones CD1 (ICR) previamente establecida.

Los TSC se cultivan sobre fibroblastos embrionarios (MEFs) de ratón disponibles comercialmente. Todos los productos químicos, reactivos, kits, equipos y software utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo de células madre de ratón para la formación de blastoides

1. Preparación de placas alimentadoras MEF
   1. Recubre una placa de cultivo celular de 6 pozos con 1,5 mL de gelatina al 0,2% (p/v) en agua desionizada (DI) por pozo. Incubar a 37 °C en normoxia durante al menos 45 minutos.
   2. Durante la incubación, prepare un tubo centrífugo de 15 mL con 4 mL de medio FC (Tabla 1) precalentado a 37 °C.
   3. Descongela el vial de MEF en un baño maria usando un movimiento en forma de ocho hasta que solo quede una pequeña bola de hielo. Transfiere el contenido al tubo preparado, luego pipetea arriba y abajo para mezclar bien. Centrifugar a 500 × g durante 4 minutos.
   4. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de medio FC. Ajusta a un volumen suficiente para cubrir ~160.000 celdas por pozo en 1,5 mL por pozo.
   5. Aspira la gelatina y coloca 1,5 mL de MEFs por pozo. Incubar en normoxia durante la noche sin interrupciones.
   6. Sustituye el medio por un medio FC fresco de 1,5 mL por pozo al día siguiente. Cambia el medio cada 48 horas. Usa MEFs entre 2 y 7 días después de emplatar. Los MEF pueden mantenerse sanos durante más tiempo, pero su capacidad para sostener el crecimiento de los TSC podría verse comprometida.

PRECAUCIÓN: Realizar todo el cultivo celular de ratón en armarios de flujo laminar de nivel de bioseguridad (BSL) 1 utilizando la técnica BSL-2.

2. Descongelación y paso de células madre embrionarias de ratón (WT ESCs e iGATA4-ESCs)
   1. Descongelar ESCs WT o iGATA4-ESCs siguiendo los pasos 1.1.1–1.1.3. Tras la centrifugación, resuspende las celdas en 1 mL de medio N2B27/2i/LIF (Tabla 1) y sembra ~50.000 celdas por pozo en una placa de 6 pozos recubierta de gelatina con ~1,5 mL por pozo. Incubar a 37 °C en normoxia y cambiar de medio cada 48 horas.
   2. Asegúrate de que las colonias estén compactas y redondas y con protuberancias mínimas antes de pasar. Paso cada 2–3 días.
      NOTA: Las ESCs WT e iGATA4-ESCs son morfológicamente indistinguibles hasta la inducción con doxiciclina (DOX).
   3. Recubre una placa de 6 pozos con 1,5 mL de gelatina al 0,2% en agua DI por pozo. Incuba a 37 °C durante al menos 45 minutos.
   4. Añade 500 μL de reactivo de disociación celular por pozo e incuba durante 3 minutos. Añade 2 mL de medium de FC mientras pipeteas suavemente alrededor de los bordes. Confirma > desprendimiento del 90% bajo un microscopio. Si las células permanecen adheridas, pipetea suavemente para ayudar a la resuspensión.
   5. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifuga a 500 × g durante 4 minutos.
   6. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de medio N2B27/2i/LIF. Determinar la concentración celular usando 10 μL en un hemocitómetro. Ajusta el volumen para sembrar ~50.000 celdas por pozo.
   7. Aspira la gelatina y siembra las células. Incubar en normoxia. Cambia de medio al día siguiente y cada 48 horas después.
3. Descongelación y paso de células madre trofoblastas (TSC) de ratón
   1. Descongelar los TSCs siguiendo los pasos 1.1.1–1.1.3. Tras la centrifugación, resuspende las celdas en 1 mL de medio TSF4H (Tabla 1) y siembra ~20.000 celdas por pozo en una placa de 6 pozos recubierta con MEF. Incubar a 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (hipoxia) y cambiar el medio cada 24 horas.
   2. Asegúrate de que las colonias sean grandes (>75 μm de diámetro) y aplanadas antes de pasar. Añade 500 μL de reactivo de disociación celular por pozo e incuba durante 5 minutos. Añade 2 mL de medium de FC mientras pipeteo suavemente. Confirma >90% de desapego.
   3. Transfiere las células a un tubo centrífugo y centrifuga a 500 × g durante 4 minutos.
   4. Resuspender en un TSF4H medio de 1 mL. Determina la concentración y ajusta a ~20.000 celdas por pozo.
   5. Placar sobre MEFs e incubar en hipoxia. Cambia el medio cada 24 horas y pasa cada 2–3 días antes de la fusión de la colonia.

2. Formación de iGATA4-blastoides

1. Preparación de la placa de agregación de micropozos para la agregación celular
   1. Añade 500 μL de solución de enjuague antiadherente a cada pozo de una placa de agregación Microwell. Centrifugar a 2.000 × g durante 5 minutos con un equilibrio adecuado para eliminar el aire atrapado de los micropozos. Incubar a 37 °C en normoxia durante al menos 1 hora o toda la noche.
2. Preparación de blastoide, día 0 — Preparación y emplatado de WT e iGATA4-ESC
   1. Medios precalentados N2B27/2i/LIF, FC y FCYL (FC + 10 ng/mL de LIF recombinante de ratón (mLIF) + inhibidor de ROCK de 2 μM Y27632) hasta 37 °C. Prepara gelatina al 0,2% en agua DI y ten preparado el reactivo de disociación celular.
   2. Aspira la solución antiadherente sin tocar el fondo del pozo. Lava dos veces con 1 mL PBS y otra con 1 mL de medio FCYL. Haz una pipeta a lo largo de la pared para evitar dañar los micropozos.
   3. Prepara una placa de 6 pozos recubierta de gelatina (incubación ≥45 minutos) para las células de paso.
   4. Extrae WT e iGATA4-ESCs aspirando el medio y añadiendo un reactivo de disociación celular de 500 μL por pozo. Incuba durante 3 minutos a 37 °C. Añade 2 ml de FC medium y pipetea suavemente. Confirma desprendimiento completo bajo un microscopio. Transfiere a un tubo de 15 mL y centrifuga a 500 × g durante 4 minutos.
   5. Resuspende en 1 mL de medio FCYL. Determinar la concentración celular usando 10 μL en un hemocitómetro. Ajusta a 500.000–700.000 celdas/mL. Calcula el volumen necesario para 5 ESC WT y 5 ESC iGATA4-ESC por micropozo (6.000 celdas por pozo).
      NOTA: Optimiza para otras líneas ESC si es necesario. Un rango inicial es de 4–7 ESCs por micropozo, con una proporción de 1:1 de ESCs respecto a iGATA4-ESC.
   6. Preparar 500 μL de suspensión de celda por pozo. Añade gota a gota a la placa de agregación Microwell usando una pipeta de 1000 μL. Centrifuga a 100 × g durante 3 minutos y verifica la distribución uniforme. Incuba durante 6 horas hasta que se formen los áridos.
   7. Paso de los ESC restantes según se describe en la Sección 1.2.
3. Preparación del blastoide, día 0 — Preparación del medio TX
   1. Preparar un medio basal TX de ~20 mL usando DMEM/F12 (Tabla 2). Prepárate fresco para cada experimento.
      1. Añadir 200 μL y 200 mM de suplemento de L-alanil-L-glutamina (2 mM finales). Guarda el stock a 4 °C.
      2. Añadir 200 μL y 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina (100 U/mL finales cada uno). Guarda a −20 °C.
      3. Añade 40 μL 32 mg/mL de ácido L-ascórbico (final 64 μg/mL). Prepárala en agua DI, filtra la esterilización y guárdala a −20 °C.
      4. Añade 20 μL de selenito sódico (14 ng/mL final). Prepárenlo y almacene a −20 °C.
      5. Añadir 240 μL de NaHCO₃ (final 543 μg/mL). Mezcla bien después de descongelar.
      6. Añadir 20 μL de holo-transferrina (final 10,7 μg/mL). Mezcla después de descongelar.
      7. Añadir ~37,5 μL de insulina (final 19,4 μg/mL; dependiente del lote). Guárdalos a 4 °C.
   2. Inmediatamente antes de su uso, añadir Y27632 a una concentración final de 20 μM, CHIR99021 a 3 μM, IL-11 a 30 ng/mL, FGF4 a 25 ng/mL, heparina a 1 μg/mL, mLIF a 10 ng/mL, TGFβ a 15 ng/mL y 8Br-cAMP a 25 μM.
4. Preparación del blastoide, día 0 — Preparación y recubrimiento de los TSC
   1. TSF4H, FC (Tabla 1) y medios TX precalentados (Sección 2.3). Prepara placas recubiertas de gelatina (≥45 min) para el agotamiento de MEF.
   2. Extrae los TSC añadiendo un reactivo de disociación celular de 500 μL por pozo e incubando durante 5 minutos en hipoxia. Añade 2 ml de FC medium y pipetea suavemente. Confirma desapego. Transfiere a un tubo y centrifuga a 500 × g durante 4 minutos.
      NOTA: Los TSC cultivados >4 días pueden requerir hasta 10 minutos de tratamiento con reactivos de disociación celular.
   3. Resuspende en un medio TSF4H de 1 mL y ajusta al volumen adecuado para el chapado en una división 1:2.
   4. Placar sobre pozos recubiertos de gelatina para el agotamiento de MEF. Incubar ~45 minutos en hipoxia. Asegurarse de que los MEF se fijen mientras los TSC permanecen mayormente sin adherir.
   5. Sustituye el medio de 900 μL de los pozos de placas de agregación de micropozos por medio TX de 500 μL. Vuelve a la hipoxia.
   6. Transfiere el sobrenadante que contiene TSC a un tubo sin perturbar los MEF conectados. Determinar la concentración (objetivo 500.000–700.000 células/mL).
   7. Calcular el volumen para 12 TSCs por micropozo (14.400 celdas por pozo). Centrifuga si se requiere una concentración adicional.
      NOTA: Optimiza para otras líneas TSC (10–15 celdas por micropozo recomendado).
   8. Añade 500 μL de suspensión de celda por pozo en caída. Centrifugar a 100 × g durante 3 minutos. Confirmar la distribución e incubar en hipóxia durante 24 horas.
   9. Aproba los TSC restantes según sea necesario (Sección 1.3).
5. Preparación del blastoide, día 1 — Inducción
   1. Unas 24 horas después de la adición de TSC, añadir 20 μL de 5 mM 8Br-cAMP y 1 μL de 1 μg/mL DOX por pozo. Incubar durante 48–72 horas en caso de hipoxia.
6. Preparación del blastoide, día 3 — Fijación
   1. Resuspende los agregados usando una punta de pipeta cortada de 1000 μL. Transfiere a tubos de 2 mL y deja sedimentar durante 5 minutos.
   2. Retirar el sobrenadante y añadir 250 μL de paraformaldehído (PFA) al 4%. Resuspende suavemente.
      PRECAUCIÓN: Manipula el PVA en una campana extractora con el EPI adecuado.
   3. Incuba 15 minutos, haciendo un movimiento cada 5 minutos.
   4. Elimina PFA y añade 300 μL de PBST (PBS + 0,1% Tween-20). Mezcla suavemente. Guarda a 4 °C durante <1 semana antes de teñir.
7. Inmunofluorescencia de los blastoides
   1. Transfiere 150 μL por muestra a una placa de fondo en U de 96 pozos.
   2. Añade un tampón de permeabilización de 100 μL e incuba 20 minutos. Sustituye por una solución primaria de anticuerpos e incuba durante la noche a 4 °C.
   3. Lava 3× con PBST (5 min cada uno). Añade anticuerpos secundarios.
   4. Incubar 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
   5. Lava 3× y transfiere a la placa de imagen.
   6. Imagen usando microscopía confocal (≥25× objetivo, NA ≥0,8).

3. Pantallas de alto rendimiento usando el modelo iGATA4-blastoid

1. Preparación y prueba de factores ambientales iGATA4-blastoides
   1. Preparar la placa de agregación de micropozos según lo descrito en la Sección 2.1 y generar blastoides iGATA4 siguiendo las Secciones 2.2–2.4. Preparar suficientes pozos, incluyendo controles adecuados. Incluye un control en blanco (blastoides preparados siguiendo el protocolo estándar), un control de portadora y una o más condiciones experimentales.
   2. Incubar blastoides durante la noche en hipoxia. Aproximadamente 24 horas después de la siembra del TSC, preparar el medio TX suplementado con 8Br-cAMP, doxiciclina (DOX) y el compuesto de interés (o control de portadores). Se han probado las siguientes condiciones:
      1. Cafeína: 3,5 mg/L, diluida de reservas de agua ultrapura.
      2. Nicotina: 330 ng/L, diluida a partir de stocks 100% de etanol (EtOH).
      3. Etanol: 17 mM, diluido a partir de EtOH absoluto.
      4. Aminoácidos de cadena ramificada alta (BCAA): +5%, +25%, +50% en relación con las concentraciones basales (0,45 mM L-leucina, 0,45 mM L-valina, 0,42 mM L-isoleucina), preparados a partir de stocks concentrados en agua ultrapura.
      5. Metionina y leucina bajas: −5%, −25%, −50%, −100% respecto a las concentraciones basales (0,12 mM de L-metionina, 0,45 mM de L-leucina), preparadas usando DMEM/F12 libre de Met/Leu. El DMEM libre de Met/Leu (LM-DMEM) se complementa con 1x la mezcla de nutrientes Ham's F-12 antes de su uso.
         PRECAUCIÓN: Prepara y manipula reservas concentradas de cafeína y nicotina en una campana extractora utilizando el equipo de protección personal adecuado (EPI; guantes, bata de laboratorio, protección ocular). El etanol es inflamable y debe mantenerse alejado de fuentes de calor.
   3. Aspira el medio de cada pozo y añade 1 mL de medio TX que contenga compuesto. Procesa un pozo a la vez para evitar que se seque. Devuelve la placa a la incubadora de hipoxia y cultiva hasta el día 3.
   4. Captura imágenes representativas de campo brillante en el tercer día usando un microscopio de luz transmitida. Fijar las estructuras y realizar inmunofluorescencia según se describe en las secciones 2.6 y 2.7.
      NOTA: Ajusta las ventanas de tratamiento según el objetivo experimental. Los tratamientos pueden aplicarse durante la agregación temprana (día 1) o en etapas posteriores (por ejemplo, expansión de la cavidad). Ejemplos de ventanas incluyen los días 1–3, días 1–2 (seguidos por el reemplazo de soportes) y días 2–3.
2. Análisis multiparamétrico iGATA4-blastoide
   1. Utiliza imágenes de campo claro para cuantificar el porcentaje de pozos que contienen estructuras cavitadas (es decir, estructuras con una cavidad central claramente definida) y medir el diámetro del blastoide.
      1. Imágenes abiertas en el software de análisis de imágenes.
      2. Utiliza la herramienta de línea recta para dibujar una línea a través de cada estructura.
      3. Mide el diámetro usando Analyze > Measure.
   2. Selecciona muestras representativas inmunotinzadas (20–40 estructuras por réplica biológica, con al menos tres réplicas biológicas por condición) y la imagen descrita en la Sección 2.7.
   3. Cuantificar el número total de células y la composición de linaje utilizando marcadores de inmunofluorescencia: TE (CDX2-positivo), EPI (SOX2-positivo y SOX17-negativo) y PE (SOX17-positivo).
   4. Evalúa la organización estructural y la morfología determinando si las células PE están espacialmente segregadas de las células EPI dentro de la masa de células internas (ICM) (clasificación binaria: sí/no).
   5. Clasificar la morfología como buena (estructura clara similar a un blastocisto, cavidad definida y compartimentos TE, EPI y PE bien organizados), mediocre (anomalías menores como forma irregular o cavidad parcialmente formada), o mala (anomalías mayores como ausencia de cavidad o linajes desorganizados/no clasificados).
   6. Cuantifique parámetros adicionales, incluyendo el tamaño o el volumen de la cavidad, cuando corresponda. Utiliza herramientas bioinformáticas u otras para trazar y analizar estadísticamente, y software de análisis de imágenes 3D para contar células y/o preparar imágenes para la visualización.

Results

Mantener las ESCs e iGATA4-ESC (normoxia) y TSCs (hipoxia) bajo condiciones de cultivo adecuadas es esencial para una generación exitosa de blastoides. Cuando se cultivan según lo descrito, los ESC e iGATA4-ESC deberían ser en gran medida indistinguibles, formando colonias de tamaño medio, redondas y bien definidas tras 3 días. La aparición de colonias aplanadas o bordes prominentes indica una diferenciación incipiente, y tales cultivos no deben usarse para la formación de blastoides. Los CST deben formar colonias epiteliales planas con bordes ligeramente elevados y centros más planos. Las colonias de TSC sobrecrecidas o fusionadas (normalmente tras >3 días de cultivo) suelen dar malos resultados blastoides (Figura 1).

Durante el ensamblaje del blastoide iGATA4, varios signos distintivos tempranos indican el éxito del protocolo (Figuras 2A, B). Aproximadamente 6 horas después de la agregación de ESC e iGATA4-ESC, los agregados de celda compacta deberían ser visibles en el fondo de los micropozos. Los agregados sueltos sugieren una exposición excesiva a los reactivos de disociación celular, lo que reduce la adhesión célula-célula. Progresión al siguiente paso (adición de TSC; Sección 2.4) solo debe ocurrir una vez que se observen agregados compactos (Figura 2B, punto temporal D0.5). La inmunotinción en esta etapa debería mostrar agregados homogéneos de SOX2⁺ y GATA4⁻ (Figura 2B, punto temporal D0.5).

Tras la adición de TSC y la incubación nocturna, debería ser evidente un único agregado cohesivo rodeado de células CDX2⁺ (Figura 2B). La presencia de grandes células no agregadas en la superficie de los agregados suele indicar MEFs residuales. La contaminación por MEF puede reducir la eficiencia de formación de blastoides; por lo tanto, un agotamiento adecuado del MEF es fundamental para obtener una población predominantemente TSC antes de la agregación. Se puede usar un colador de celda de 40 μm para eliminar los MEF residuales, aunque esto puede reducir el rendimiento del TSC. La cobertura incompleta o excesiva de CDX2⁺ puede corregirse ajustando el número de TSC añadidos por micropozo (rango recomendado: 10–15).

Tras la adición de DOX y 8Br-cAMP, las caries suelen observarse en el día 2 y pueden persistir hasta el día 3. Bajo la microscopía de campo claro, las cavidades aparecen como espacios claros y vacíos dentro de los blastoides (Figura 2B, C; línea blanca discontinuada). Las células GATA4⁺ aparecen poco después de la inducción de DOX y se clasifican progresivamente hacia la superficie del compartimento tipo ICM (Figura 2B). La formación exitosa de blastoides se caracteriza por una alta eficiencia de cavitación (típicamente ~80% de las estructuras por placa de agregación de micropozos; Figura 2D), un epitelio externo tipo TE de una sola capa de CDX2⁺, una cavidad tipo blastocoel y un compartimento redondeado tipo ICM que contiene células similares a EPI SOX2⁺ superpuestas por células similares a GATA4⁺ tipo PE (Figura 2C–E).

Los resultados subóptimos comunes incluyen estructuras no cavitadas, blastoides de forma irregular con múltiples cavidades o compartimentos similares a ICM, y pozos que contienen pocas estructuras o restos celulares. Aunque se esperan aproximadamente un 20% de estructuras anormales (Figura 2C), tasas más altas pueden indicar problemas como una preparación incorrecta del medio TX, mala calidad de la célula inicial, falta de incorporación de DOX o 8Br-cAMP el día 1, o desplazamiento de estructuras durante cambios de medio.

Para aplicaciones de cribado de alto consumo, los pozos sin tratar y los de control de vehículos deberían producir blastoides comparables a las condiciones de control positivo (Figura 3A,B). Los tratamientos experimentales pueden afectar múltiples métricas de calidad, incluyendo el tamaño del blastoide (Figura 3C), la eficiencia de la cavitación, el número total y específico de células por linaje (Figura 3D), la clasificación PE y la morfología general (Figura 3E). Por ejemplo, el tratamiento con cafeína, nicotina o etanol durante la formación del blastoide resultó en estructuras más pequeñas con menor eficiencia de cavitación, menor número total o de células ICM, deterioro de la clasificación de PE y morfología peor. En contraste, el aumento de concentraciones de aminoácidos de cadena ramificada produjo blastoides más grandes y altamente cavitados, con mayor número celular y una morfología mejorada (Figura 3C–E). Se espera variabilidad biológica entre experimentos, lo que pone de manifiesto la importancia de incluir tanto los controles en blanco como los de portadores en cada experimento.

Figura 1: Ejemplos de ESCs WT de buena y baja calidad, iGATA4-ESC y TSCs. Micrografías de campo claro de los ESC WT, iGATA4-ESC y TSCs que muestran morfologías de colonias esperadas tras 2–3 días de cultivo en N2B27/2i/LIF (ESCs) o medio TSF4H (TSCs). El panel titulado "WT ESCs – mala calidad" muestra células con morfología subóptima, incluyendo colonias aplanadas con bordes salientes (puntas de flecha rojas). El panel "TSC sobrecrecido" muestra colonias TSC fusionadas y agrandadas tras 4 días de cultivo. Barra de escala: 100 μm para todos los paneles. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Morfología esquemática y esperada de los blastoides iGATA4. Reimpreso de Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Modelos eficientes de embrión de ratón derivado de células madre para estudios ambientales, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, con permiso de Elsevier. (A) Representación esquemática del desarrollo natural de blastocistos en ratones (arriba) y modelado de blastocistos basado en células madre utilizando ESCs WT, iGATA4-ESC y TSCs.
(B) Micrografías que muestran la morfología esperada y la expresión de marcadores en diferentes etapas del protocolo. Proyección de máxima intensidad (MIP); líneas discontinuas delimitan la cavidad. Barra de escala: 20 μm. (C) Imagen de campo claro de blastoides iGATA4 en el día 3. Barra de escala: 100 μm.
(D) Tasas de cavitación de iGATA4-blastoides generados mediante TSCs precultivados en normoxia o hipoxia; Los agregados se cultivaron en condiciones hipóxicas. n ≥ 4; Las barras de error representan el error estándar de la media. (E) Inmunotinción de blastocistos E4.5 y blastoides iGATA4 de día 3 para marcadores de linaje (CDX2, ciano; 4 DE OCTUBRE, rojo; GATA4, verde). Proyección de máxima intensidad (MIP); un solo plano Z mostrado donde se indica. Barra de escala: 25 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Efectos de los factores ambientales en la formación y calidad del blastoide. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia 3D (arriba) y reconstrucciones superficiales IMARIS (abajo) de blastoides iGATA4 tratados con factores ambientales (cafeína, nicotina, etanol y condiciones que imitan dietas ricas y bajas en proteínas). Barras de escala: 25 μm para todas las imágenes. (B) Esquema del flujo de trabajo experimental. (C) Diámetro del blastoide bajo diferentes condiciones de tratamiento. El rango representa los percentiles 10 al 90; las casillas indican el rango intercuartiles; la línea indica la mediana. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. (D) Cuantificación del número total de células (grises), trobecectodermo (cian), epiblasto (rojo) y endodermo primitivo (verde) en blastoides de control y tratados. Las barras representan la media; las barras de error representan la desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. (E) Cuantificación de la proporción de blastoides clasificados como "buenos" (ordenamiento adecuado de linaje con mínimas anormalidades morfológicas), "mediocres" (morfología en gran parte correcta con anomalías menores, incluyendo clasificación incompleta de EPI–PE) o "malos" (morfología severamente anormal con alteración de la organización del linaje) bajo condiciones de control y tratamiento. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA bidireccional en relación con las condiciones de control. Para todos los paneles, n ≥ 3. La significación estadística se indica como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Medios de comunicación	Reactivo	Concentración final
FC
	DMEM	N.A.
	FBS inactivada por calor (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoetanol (2-ME)	0,1 mM
	Aminoácidos no esenciales (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Penicilina–estreptomicina	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Suplemento de B27	1x
	Suplemento N2	0,5x
	2-ME	100 μM
	Penicilina–estreptomicina	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	LIF recombinante de ratón	10 ng/mL
TSF4H
	Megacélula RPMI-1640 Medio	N.A.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Penicilina–estreptomicina	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparina	1 μg/mL

Tabla 1: Recetas multimedia para FC, N2B27/2i/LIF y TSF4H. Recetas para preparar medios FC, medios N2B27/2i/LIF y medios TSF4H, con concentraciones finales.

Componente	Concentración final	Concentración de stock	Disolvente y almacenamiento	Volumen a ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, almacenar a -20 °C	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, almacenar a -20 °C	6 μL
DMEM/F12	N/A	N/A	Conservar a 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1% BSA en PBS, almacenar a -20 °C	5 μL
Suplemento de L-alanil-L-glutamina	2 mM	200 mM	Conservar a 4 °C	200 μL
Heparina	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, almacenar a -20 °C	20 μL
Holo-transferrina	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	Agua DI, guarda a -20 °C	20 μL
TGF-β1 humano	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1% BSA, almacenar a -20 °C	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1% BSA en PBS, almacenar a -20 °C	24 μL
Insulina	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	La concentración depende del lote, se almacena a 4 °C	33,7–40,8 μL, ajustar el volumen según la concentración del stock.
Magnesio ácido L-ascórbico-2-fosfato	64 μg/mL	32 mg/mL	Agua DI, guarda a -20 °C	40 μL
LIF recombinante de ratón	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1% BSA, almacenar a -20 °C	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	Agua DI, guarda a -20 °C	240 μL
Penicilina/Estreptomicina	1x	100x	Conservar a -20 °C	200 μL
Selenito sódico	14 ng/mL	14 μg/mL	Agua DI, guarda a -20 °C	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, almacenar a -20 °C	20 μL

Tabla 2: Receta de medios para TX. Receta para preparar medios TX, con detalles sobre cómo preparar y almacenar pequeñas moléculas y otros reactivos, y concentraciones finales.

Discussion

Los blastoides iGATA4 proporcionan un modelo altamente eficiente, similar a un embrión, basado en células madre del blastocisto del ratón, autoorganizando tres tipos celulares cultivados in vitro: ESCs, GATA4-ESC inducibles (iGATA4-ESC) y TSCs cultivados por hipoxia. Estas estructuras recapitulan características clave del blastocisto E4.5, incluyendo proporciones apropiadas de linaje e identidad transcripcional, y pueden utilizarse para cribado ambiental multiparamétrico, reflejando de forma fiable defectos del desarrollo en etapa de^blastocisto. Un estudio reciente demuestra además que la agregación de ESCs, iGATA4-ESCs y TSCs en medios blastoides basales también produce formación de blastoides de alta eficiencia, lo que pone de manifiesto la robustez y adaptabilidad de este enfoque en laboratorios y condiciones de^{cultivo 39}. Se ha demostrado previamente que los iGATA4-ESC recapitulan las funciones de las células VE en modelos embrionarios basados en células madre^{postimplantación} 28,29,30,31. En conjunto, estos resultados ilustran cómo los iGATA4-ESC pueden servir como sustitutos flexibles y fiables para las células PE/VE en la modelización embrionaria basada en células madre a través de las etapas del desarrollo.

Varios pasos del protocolo son fundamentales para lograr blastoides de alta calidad. Estos incluyen la calidad de las poblaciones celulares iniciales, especialmente los TSC cultivados con hipoxia (Figura 1); la preparación del medio TX, que debe prepararse fresco en el día 0 (Tabla 2; Sección 2.3); y manejo cuidadoso de las planchas tras la agregación. Las lecturas clave del éxito del protocolo incluyen eficiencia de cavitación (típicamente ~80%), morfología adecuada (estructuras de ~100 μm de diámetro con una cavidad similar a un blastocoel, una capa externa tipo TE-CDX2⁺ y una masa interna de celda SOX2⁺ y GATA4⁺ ordenada con una relación aproximada de 3 TE:1 EPI:1), y la presencia de una capa tipo GATA4⁺ tipo PE correctamente ordenada. Estas son métricas comúnmente utilizadas en el^campo 1,2,4,5. Entre los blastoides cavitados, aproximadamente el 75% de las estructuras presentan todas estas características. Estas métricas pueden utilizarse como indicadores iniciales para la resolución de problemas. La calidad celular subóptima suele reflejarse en la morfología anormal de las colonias, lo que resulta en estructuras mal agregadas o no cavitadas. Una preparación inadecuada del medio puede provocar agregación incompleta o defectos de linaje, mientras que un manejo brusco puede resultar en múltiples agregados por micropozo o pozos vacíos.

Una optimización adicional puede incluir el ajuste del número de celdas sembradas (rangos iniciales recomendados: 4–7 ESCs e iGATA4-ESC, y 10–15 TSCs por micropozo), refinar los métodos de agotamiento de MEF (por ejemplo, filtración mediante un colador de celda de 40 μm) y modificar la composición del medio TX. Por ejemplo, la eliminación de FGF4 y heparina puede seguir apoyando la formación eficiente de blastoides mientras promueve una identidad más mural similar a la TE. Los blastoides iGATA4 pueden mantenerse en cultivo hasta 6 días; sin embargo, las estructuras de los días 4 a 6 suelen aumentar de tamaño mientras conservan proporciones similares a blastocistos del linaje. El protocolo da resultados consistentes entre réplicas biológicas, pero se deben incluir controles adecuados en cada experimento.

En comparación con otros sistemas blastoides de ratón, que varían en poblaciones celulares iniciales y condiciones^{de cultivo} 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , los blastoides iGATA4 alcanzan tanto alta eficiencia en formación como una representación precisa del linaje. Aunque muchos protocolos existentes generan estructuras cavitadas y son valiosos para aplicaciones biológicas específicas, a menudo presentan formación incompleta de EP, identidades celulares heterogéneas o indefinidas, o proporciones de linaje incorrectas. Al combinar tres poblaciones de células madre dirigidas por linajes de manera progresiva, los blastoides iGATA4 superan estas limitaciones y proporcionan un sistema reproducible, modular y accesible experimentalmente.

A pesar de estas ventajas, persisten varias limitaciones. El cultivo in vitro prolongado en medio TX más de 4–6 días provoca un crecimiento excesivo, aunque las proporciones de linaje permanezcan similares a las de un blastocisto. Aproximadamente el 12,5% de los blastoides iGATA4 transicionan a morfologías similares a la periimplantación in vitro, caracterizadas por un epiblasto pseudoestratificado en forma de copa que rodea una cavidad pro-amniótica, un compartimento extraembrionario expandido similar a un ectodermo adyacente al epiblasto proximal y una capa externa visceral similar a un endodermo. Sin embargo, los blastoides iGATA4 no logran implantarse y se desarrollan más tras la transferencia a un ratón huésped. Por lo tanto, los blastoides iGATA4, y los blastoides en general, no son adecuados para estudiar la implantación ni las interacciones embrión-madre.

La base molecular del fracaso de los blastoides para implantarse sigue sin estar clara, aunque la evidencia actual sugiere que la modelización incompleta del trofeectodermo podría ser un factor contribuyente. Las células tipo TE en los blastoides iGATA4 presentan una identidad molecular excesivamente polar. Los futuros esfuerzos para diseñar TSCs que se parezcan más a las células TE murales, o para introducir líneas celulares alternativas que recapitulen mejor la TE competente para implantación, representan direcciones prometedoras para superar estas limitaciones. La naturaleza modular de los blastoides iGATA4, en los que las modificaciones específicas para TE pueden implementarse independientemente de la formación de EPI y PE, hace que este sistema sea especialmente adecuado para tales desarrollos.

En conjunto, el protocolo iGATA4-blastoide proporciona una plataforma robusta y escalable para estudiar la especificación de linaje y los procesos tempranos de desarrollo en el embrión de mamíferos. Su reproducibilidad y adaptabilidad la hacen adecuada para aplicaciones de cribado ambiental, farmacológico y genético de alto consumo. Por ello, los blastoides iGATA4 representan un sistema poderoso para investigar los mecanismos tempranos del desarrollo y evaluar cómo diversas perturbaciones influyen en el desarrollo preimplantacional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Usado para la preparación de medios generales
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Usado para la preparación de medios TX y cavitación blastoide
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Placa de agregación en micropocillo; Usado para la preparación de blastoides
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Usado para la preparación de blastoides
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Pipetas de bore ancho para el movimiento de blastoides durante la inmunotinción.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Usado para la preparación de medios
Caffeine	Sigma	58-08-2	Usado como factor ambiental para probar en iGATA4-blastoides
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Para inmunofluorescencia, usado a 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	Otras marcas/modelos también pueden funcionar.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Usado para la preparación de medios
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Usado para fines generales de cultivo de tejidos
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Usado para la preparación de medios FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Usado para la preparación de N2B27 y medios TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Supplementar DMEM-LM con polvo de Mezcla de Nutrientes Ham's F-12 hasta una concentración final de 1x para obtener DMEM/F12 libre de Met y Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Usado para inmunofluorescencia. Descongelar a 4°C;, y almacenar en alicuotas a -20°C;.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Para la inducción de iGATA4 durante la preparación de blastoides
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	usado en nuestro laboratorio, otros funcionarán. Requiere adaptadores de tubos y placas.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Usado para inmunofluorescencia
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Usado para la preparación de medios
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Usado para el análisis de imágenes
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Usado para inmunofluorescencia, usado a 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Usado para fines generales de cultivo de tejidos
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Para inmunofluorescencia e imagen
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Suplemento de L-alanil-L-glutamina; Usado para la preparación de medios
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Usado como suplemento para DMEM-LM, para condiciones de dieta baja en proteínas.
Heparin	Sigma	H3149	Usado para la preparación de medios
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Otras marcas/modelos también pueden funcionar.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Usado para la preparación de medios TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Usado para la preparación de medios TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Usado para la preparación de medios TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Usado para el análisis de imágenes y la preparación de imágenes.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Usado para la preparación de medios
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Línea celular disponible en el laboratorio Zernicka-Goetz bajo petición
Insulin	Sigma	I9278	Usado para la preparación de medios TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Usado como capa alimenticia para el cultivo de TSC. Descongelar según se indica en el protocolo y usar dentro de una semana.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Usado para la preparación de medios TX.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Usado para complementar los medios TX.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Usado para complementar los medios TX.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Usado para complementar los medios TX.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	Usado para la preparación de medios
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	NA	Para el manejo general de líquidos
Mouse recombinant LIF	STEMCELL Technologies	78056	Usado para la preparación de medios
N2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	1750204