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Artículo de método

Traducción de ARNm in vitro libre de células en lisados de Drosophila

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DOI:

10.3791/70844

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12 de junio de 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

En este artículo

Resumen

Aquí ofrecemos detalles sobre cómo preparar lisados y realizar la traducción in vitro utilizando embriones de Drosophila .

Resumen

La traducción in vitro de ARNm libre de células ha desempeñado un papel crucial en la comprensión del proceso de síntesis proteica durante la expresión génica en eucariotas. El desarrollo de lisados a partir de diferentes sistemas para la traducción in vitro ha sido fundamental para estudiar los roles de la mayoría de los componentes de la maquinaria de traducción y para diseccionar muchos pasos del proceso de síntesis de proteínas. Se han estudiado diferentes aspectos de la traducción y el control traslacional utilizando lisados de Drosophila melanogaster. Este artículo proporciona protocolos detallados para preparar plantillas sintéticas de ARNm, cultivar cultivos de moscas vivas a gran escala, preparar lisados competentes para la traducción a partir de embriones de Drosophila y realizar reacciones de traducción in vitro libres de células. Este protocolo es adecuado para cualquier especie del género Drosophila—melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei, etc. Además, comparamos este protocolo con otros sistemas de traducción y discutimos limitaciones, pasos críticos y la resolución de problemas. Se incluyen resultados representativos para ayudar a evaluar el rendimiento y la reproducibilidad del protocolo. Finalmente, discutimos posibles aplicaciones en biotecnología e investigación.

Introducción

Durante más de un siglo, Drosophila ha demostrado ser un organismo modelo poderoso y genéticamente manejable para estudiar muchos fenómenos y moléculas biológicas, incluyendo el control traslacional y la maquinaria de traducción 1,2,3,4. La traducción in vitro libre de células de Drosophila se ha convertido en una herramienta potente para estudiar la síntesis de proteínas, porque puede recapitular muchos eventos observados in vivo. Así, Drosophila es un sistema ideal para descubrir nuevas funciones y moléculas que realizan el control de la traducción y la traslación. Los primeros estudios establecieron un sistema in vitro y competente en la traducción en el artrópodo emparentado con moscas Artemia salina5 y posteriormente en Drosophila hydei6.

Posteriormente, se desarrollaron lisados sensibles a ARNm exógenos en Drosophila melanogaster. La mayoría de los estudios sobre la traducción in vitro de Drosophila se han realizado en embriones de diferentes edades, aunque algunas variaciones del tampón de reacción de traslación han sido utilizadas por distintos grupos de investigación. Para comparar, los diferentes fenómenos estudiados y las condiciones de la reacción de traslación se enumeran en la Tabla 1. Además de los embriones, también se han desarrollado protocolos para la traducción in vitro libre de células utilizando ovocitos de Drosophila 10,22,23,24,25,26 y lisados de células de Schneider o Kc en cultivo 17,27,28,29,30,31,32. En lasreferencias 33,34 se describe una descripción de los componentes necesarios para la traducción in vitro y una comparación entre lisados de diferentes especies.

Aunque el proceso de traducción de ARNm se conserva entre los eucariotas, las diferencias significativas entre los taxones se encuentran principalmente en la fase de inicio de la traducción, donde diversas moléculas reprimen o promueven la traducción a lo largo del desarrollo de manera específica por taxón oespecie 35,36. Este protocolo es muy adecuado para estudiar la traducción de ARNm en insectos durante todo su desarrollo, para lo cual no se pueden utilizar lisados de Metazoos filogenéticamente distantes, incluidos los lisados comerciales de trigo o conejo. De hecho, este protocolo puede recapitular los eventos de traducción que ocurren durante la embriogénesis, algo que no es posible al usar lisados deovocitos 23. Hasta la fecha, no se ha realizado ninguna comparación entre los sistemas de Drosophila embrionario, ovocito y de células cultivadas. Añadir modificaciones postraduccionales a las proteínas sintetizadas in vitro es una limitación de este protocolo en su estado actual. Además, este método no proporciona cantidades preparativas de proteína en comparación con los métodos para producir proteínas recombinantes en bacterias.

Aquí describimos protocolos detallados para cultivar rutinariamente jaulas a gran escala de moscas de Drosophila , preparar plantillas sintéticas de ARNm, preparar lisados competentes para la traducción a partir de embriones y realizar ensayos de traducción in vitro libres de células. La Tabla de Materiales muestra los reactivos necesarios a lo largo del protocolo.

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Protocolo

1) Construcción de plásmidos plantilla para transcripción in vitro

  1. Selecciona plásmidos que contengan una región no traducida (UTR) de 5', un cistrón reportero, un UTR de 3' y una cola poli(A) aguas abajo de un promotor de ARN polimerasa T7, T3 o SP6. Asegúrese de que cada constructo contenga un sitio de restricción único inmediatamente aguas abajo de la cola poli(A) para la linearización plásmida antes de la transcripción (Figura 1).
    NOTA: El sitio de la enzima de restricción utilizado debe elegirse cuidadosamente para que el sitio de reconocimiento esté fuera de la secuencia transcrita o que permita que el ADN linealizado termine en A. Además, la enzima de restricción debe dejar un voladizo romo o de 5' en el extremo de 3' de la plantilla. Los voladizos de 3' pueden resultar en productos de transcripción aberrantes. Si se utiliza una enzima con un sobresaliente de 3', el fragmento debe embotarse antes de su uso.
  2. Verifica todos los constructos mediante secuenciación antes de usarlos como plantillas para transcripción in vitro .
    NOTA: Se han utilizado constructos reporteros luciferasa Firefly (FLuc) con una cola poly(A)71 para este flujo de trabajo. Las construcciones FLuc derivan del casetepLUC 12. La información sobre vectores y kits se enumera en la Tabla de Materiales.

2) Transcripción in vitro de ARNm coronados y poliadenilados

  1. Linealiza cada construcción de plásmido usando el sitio de restricción único aguas abajo de la cola poly(A) (aquí, KpnI).
  2. Resuelve el ADN linealizado mediante electroforesis en gel al 1% de agarosa a 100 V durante 1 hora.
  3. Extrae el ADN con gel y comprueba su integridad y correcta linealización mediante electroforesis idéntica en gel de agarosa.
    NOTA: No es necesario purificar el ADN linealizado con gel; si el ADN está completamente cortado, basta con una purificación en columna o una precipitación por extracción de fenol/ETOH.
  4. Transcribe el ADN lineal purificado usando un kit de transcripción in vitro según las instrucciones del fabricante. Incluye un análogo de 5' en la reacción de transcripción para estabilizar el ARN y estimular la traducción.
    NOTA: Un análogo funcional de la capa, como el ARNm 7G(5′)ppp(5′)G, soporta la estabilización de los transcritos y la estimulación por traslación. Un análogo de la capa no funcional, como G(5′)ppp(5′)A, soporta la estabilización de transcritos pero no la estimulación por traslación. Este inhibidor de la traslación se utiliza cuando se traducen transcritos bicistrónicos para comprobar la presencia de sitios de entrada interna de ribosomas (IRES) que impulsan la traducción del segundo cistrón7. Para comprobar la dependencia de una cola poli(A), esta puede eliminarse en el plásmido plantilla antes de realizar la transcripción.
  5. Trata todas las reacciones de transcripción con DNasa libre de RNasa para eliminar la plantilla de ADN tras la transcripción según las instrucciones del fabricante. Todos los kits de transcripción in vitro proporcionan la DNasa libre de RNasa.
  6. Purifica el transcrito mediante precipitación de cloruro de litio o limpieza de ARN en columna según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Todos los kits de transcripción in vitro proporcionan los reactivos de cloruro de litio.
  7. Cuantificar mediante espectroscopía el transcrito purificado y evaluar la integridad del ARNm mediante electroforesis en gel al 1% de agarosa realizada a 100 V durante 1 hora.
  8. Alicuota el ARNm y guarda a -70 °C hasta su uso.

3) Mantenimiento rutinario de un cultivo de Drosophila a gran escala

  1. Utiliza la cepa de referencia Drosophila melanogaster de tipo salvaje Oregon-R.
  2. Prepara la comida para moscas según una receta establecida en un centro de referencia.
    NOTA: Los autores utilizaron la receta37 del Bloomington Drosophila Stock Center como referencia para la preparación de alimentos. Los detalles de esta receta se encuentran en la Tabla 237. La Figura 2 muestra el flujo de trabajo global desde la recogida de embriones hasta la cuantificación de la actividad de la luciferasa.
  3. Coloca una jaula cúbica o cilíndrica de acrílico de aproximadamente 1 m de largo y 50 cm de diámetro.
  4. Haz un agujero de aproximadamente 30 cm de diámetro en la parte superior de la jaula y séllalo con malla (Figura 3).
  5. Coloca papel húmedo encima de la malla para proporcionar agua a las moscas y vuelve a reemplazar el papel húmedo cada día (Figura 3).
  6. Mantén la parte delantera de la jaula abierta y cubierta con tela para permitir el acceso al interior de la jaula. Coloca acrílico en la parte trasera de la jaula de plástico para moscas, totalmente sellado.
  7. Amplifica el stock de moscas antes de la recogida del embrión y coloca ~1.000 moscas jóvenes dentro de la jaula. Mantener la jaula de las moscas a 22–25 °C de forma constante.
    NOTA: Se pueden mantener varias jaulas para moscas de las mismas dimensiones y densidad de moscas al mismo tiempo. Las moscas ponen huevos durante aproximadamente 15 días y comienzan a morir alrededor del día 20.
  8. Alimenta a las moscas cada día con platos de zumo de agar y fruta coronados con una cucharada de levadura de panadería rehidratada que contenga 200 μL de ácido acético o vinagre.
  9. Para establecer la siguiente generación de moscas, recolecta varias placas de embriones de 0 a 12 h. Coloca los embriones en cajas de plástico de 22 cm × 17 cm × 10 cm que contienen alimento para moscas a una profundidad de 3 cm. Asegúrese de que las cajas tengan un agujero sellado con malla para permitir la circulación del aire y evitar que las larvas escapen (Figura 4). Añade levadura seca activa encima del alimento y deja que los embriones crezcan a 25 °C.
  10. Después de 3 días, coloca papel doblado de 5 cm de altura en las cajas para que las larvas de tercer estadio puedan trepar y convertirse en pupas.
  11. Después de 10 días, coloca las cajas que contienen las moscas adultas recién nacidas en la jaula. Deja que las moscas salgan de las cajas y se apareen en la jaula durante 2 días.
  12. Para obtener embriones de una edad específica para la preparación del lisado, abre la jaula con cuidado y coloca placas de jugo de agar dentro de la jaula durante el periodo de puesta de huevos requerido.
  13. Retira los platos y recoge los huevos usando un montón de coladores.
    NOTA: Para lisados embrionarios de 0 a 12 h, coloque dos placas de jugo de agar en la jaula a las 8:00 a.m. y retíralas a las 8:00 p.m. para la recogida del embrión.
    1. Recoge embriones para la preparación del lisado entre los días 3 y 10 después de la eclosión de las moscas adultas.
    2. En paralelo, recoge embriones en los días 2–4 y establece una nueva generación de moscas en cajas que contienen alimento, como se ha descrito anteriormente.

4) Preparación de lisados de traducción a partir de embriones de Drosophila de 0 a 12 h

NOTA: Este protocolo no incluye el tratamiento con nucleasas microcócicas. Este paso se omitió para evitar la posible degradación del ARNm reportero exógeno si la inactivación de la nucleasa es incompleta. La traducción de fondo debe monitorizarse en cada experimento utilizando un control sin ARNm.
NOTA: Este método deriva de los protocolospreviamente descritos 7,12,14,15,16,17,22.

  1. Preparar el tampón de lisis embrionaria tal como se describe en la Tabla 2 y almacenarlo a -20 °C en 1 mL de alicotas.
    NOTA: Descongela cada alicuota hasta 2x para uso inmediato.
  2. Recoge embriones usando un colador.
    NOTA: El protocolo estándar utiliza embriones de 0 a 12 h-old (h-12), pero otras edades embrionales también pueden ser adecuadas para la preparación del lisado.
  3. Lava los embriones extensamente con agua del grifo y luego con un tampón embrionario que contiene 0,9% de NaCl + 0,03% de Triton X-100.
    NOTA: Los embriones pueden almacenarse a 4 °C durante hasta 24 horas antes del proceso.
  4. Descorionar embriones durante 5 minutos en 50% de tampón embrionario y 50% de lejía doméstica (hipoclorito de sodio [NaOCl] 4–6% e hidróxido de sodio [NaOH] 0,02–0,1%).
    PRECAUCIÓN: Usa guantes y gafas de plástico transparente al manipular lejía.
  5. Lava a fondo con agua del grifo. Seca embriones con papel y pesa.
  6. Transfiere embriones empaquetados a un triturador de tejidos de vidrio homogeneizador sobre hielo. Añade 1 mL de tampón de lisis embrional por cada 1 g de embriones. Homogeneiza los embriones sobre hielo con 20 vasculadas.
  7. Transfiere el homogenado a tubos microcentrífugas de 1,5 mL. Centrifugar a 15.900 × g durante 20 minutos a 4 °C.
  8. Recuperar la interfase en alicotas de 50 μL sobre hielo. Congela las alicuotas en nitrógeno líquido y guarda a -80 °C.
    NOTA: La interfase es una solución líquida turbia situada entre las fases superior e inferior. La fase superior es una capa de lípidos blancos opacos y viscosos. La fase inferior es una pellet sólida.
    PRECAUCIÓN: Evite contaminar la solución de interfase de fases adyacentes.
    PRECAUCIÓN: Utiliza guantes y gafas de plástico transparente al manipular nitrógeno líquido.

5) Reacción de traducción in vitro

  1. Configura las reacciones de traslación en una placa de 96 pozos o en tubos individuales de PCR de 0,2 mL en un termociclador de PCR. Preparar cada reacción de traslación en un volumen final de 17 μL, incluyendo 5 μL de lisato embrionario y los componentes restantes de la reacción descritos en la Tabla 2.
    NOTA: El lisato embrionario representa el 30% vol./vol. del volumen total de la reacción.
  2. Si se añaden proteínas recombinantes a la reacción de traducción, diálisa la proteína contra un pH de 20 mM HEPES-KOH 7,4. Seleccione el corte de volumen y peso molecular del casete de diálisis según el volumen de la muestra y el tamaño de la proteína.
    NOTA: La adición de proteínas recombinantes es relevante para estudiar los represores traslacionales o ensayos dependientes de la dosis con factores de iniciación. Evita añadir PBS a proteínas recombinantes utilizadas en la reacción de traducción. Mantén el glicerol en o por debajo del 5% en la muestra de proteína o en la reacción de traducción. Si es posible, evita añadir glucerol a la reacción.
  3. Desnaturaliza el ARNm calentando a 65 °C durante 2 minutos y enfriándolo rápidamente sobre hielo durante 2 minutos antes de la reacción de traducción in vitro .
  4. Realizar la traducción de cada ARNm en triplicado. Configura la reacción de la siguiente manera: 2,7 μL de cóctel de reacción (Tabla 2) + 5 μL de lisado embrionario + ARNm (30 ng) + H2O a 17 μL de volumen final. Como mezcla base maestra, sigue el cóctel de reacción para una reacción en la Tabla 2 y escala según el número de reacciones que se van a realizar. Incuba la reacción a 25 °C durante 60 minutos.
    NOTA: ATP y GTP no se suman por separado a la reacción estándar descrita aquí. En nuestras manos, suplementar la reacción con ATP/GTP adicional no mejoró la salida de FLuc ni redujo la traducción bajo las condiciones probadas. Por lo tanto, la reacción se realiza con el sistema regenerador de energía descrito en la Tabla 2 sin suplementación adicional de nucleótidos.
  5. Programa el termociclador con un paso inicial de 5 minutos a 4 °C, seguido de 60 minutos a 25 °C y un paso final de 10 minutos a 4 °C.
  6. Detiene la reacción añadiendo 20 μL de tampón de lisis fría 1× pasiva. Coloca la reacción sobre hielo durante 10 minutos adicionales.
  7. Almacenar las muestras a -20 °C o proceder a la cuantificación de luciferasa.
    NOTA: El protocolo puede pausarse aquí.

6) Cuantificación de luciferasa sintetizada

  1. Lleva las reacciones a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de cuantificar la actividad de FLuc.
  2. Lleva 10 μL de cada reacción de traslación y 50 μL de sustrato de luciferasa (durante al menos 2 horas antes de su uso) a temperatura ambiente.
  3. Añade el sustrato de luciferasa a la reacción de traslación. Registrar las unidades de luz relativa usando un luminómetro automático o manual. Programa el luminómetro para que tome 10 lecturas separadas por 1 s.

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Resultados

Realizamos reacciones de traducción para analizar la variabilidad de la eficiencia entre seis preparaciones independientes de lisado (es decir, repeticiones biológicas) utilizando embriones de 0–12 h. Cada barra representa un triplicado técnico (Figura 5). Se observó una eficiencia traslacional similar, aunque con cierta variabilidad. También comparamos la eficiencia de traducción entre embriones de diferentes edades. Así, probamos lisados de embriones de 0–...

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Discusión

Los lisados de Drosophila para la traducción in vitro libre de células pueden dar resultados reproducibles. Embriones de diferentes edades y variaciones en la composición del tampón se han utilizado para investigar una amplia gama de fenómenos fundamentales en la síntesis de proteínas y su maquinaria (Tabla 1). Aquí, describimos un método estándar adecuado para embriones de cualquier edad para realizar estudios de manera precisa y cuantitativa ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

N.B-Á y G.H. contaban con el apoyo del programa de financiación intramuros del Instituto Nacional de Cáncer (INCan), México; D.E.V. es posdoctoral del Programa de Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". Agradecemos a Fannis Missirlis y Bety Osorio (CINVESTAV, México) por las moscas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aluminum foil sheetReynoldsN/AStandard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.
Amino acids mixturePromegaL4461N/A
Apple cider vinegarHeinzN/ACommercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.
Apple or grape fruit juiceJumexN/ACommercial grape juice; or any equivalent commercial brand.
Bacteriological agar Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boric acid (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReAgent, Molecular Biology grade, ≥99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structureBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Non-functional cap analogue G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifuge Tube (15 mL)Corning 430053N/A
Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11836170001N/A
Creatine phosphokinase from rabbit muscleMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatine phosphoric acid, disodium saltMerck1120A47950N/A
Dehydrated baker´s yeastFleischmann'sN/ACommercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.
Diethyl pyrocarbonate Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
Hydrogen peroxide (H2O2)EquateN/ACommercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.
In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 and AM1348N/A
KOAc, also termed KCH3COOMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lb broth (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Luciferase assay systemPromega E1501N/A
MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription KitInvitrogenAM1316 and AM1312N/A
Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl (sodium chloride)J.T Baker B17W53ACS Reagent
OligonucleotidesAny companyN/ASequence-specific.
Pasive lysis 5X bufferPromegaE1941N/A
Pipet TipsAxygenT-200-Y200 microliters yellow tips.
Pipet TipsAxygenT-1000-B1ml blue tips.
Pipet Tips AxygenT-3000.5-10 microliters clear tips.
Propionic AcidMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reagent grade, ≥99.5%, liquid.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder  PYREX®  7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep kitQiagen27106N/A
QIAquick gel extraction kitQiagen28704N/A
Rabbit reticulocyte lysate (RRL)Promega L4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assay systemPromega E2820N/A
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo Scientific87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).N/A
Sodium hypochlorite (bleach)CloroxN/ACommercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.
SpermidineMerck85558N/A
Stainless steel sieveN/AN/AAny commercial supplier.
Taq plus precision DNA polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 or R4752N/A
Tris (Tris base)IBI ScientificIB70145Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.
Triton X-100SigmaSLBX9437Laboratory Grade
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500N/A
Unflavored gelatin powderKnoxN/ACommercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.
Unrefined cane sugar (piloncillo)N/AN/ACommercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.
Vector: pBluescript SK or KS (+/-)Stratagene200301N/A
Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy. Promega

Referencias

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