Un flujo de trabajo de bajo coste sin marcadores basado en DeepLabCut para el análisis espontáneo de marcha y locomoción en ratones en movimiento libre

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo de bajo coste y sin marcadores utilizando DeepLabCut para cuantificar la marcha y locomoción espontáneas en ratones que se mueven libremente. Este protocolo integra la adquisición de vídeo con una sola cámara, el seguimiento sin marcador de hitos anatómicos y la extracción de parámetros locomotores espaciotemporales, proporcionando un marco no invasivo y accesible para el análisis del comportamiento motor sin equipos especializados.

Resumen

La marcha es un biomarcador funcional ampliamente utilizado para detectar alteraciones motoras en diversas enfermedades y condiciones, ya que refleja cambios en la coordinación, fuerza, equilibrio e integración sensoriomotora. Sin embargo, los métodos tradicionales para analizar la marcha en modelos animales suelen requerir equipos costosos, montajes complejos o procedimientos invasivos que pueden alterar el comportamiento natural. Aquí presentamos un flujo de trabajo de bajo coste y sin marcadores basado en DeepLabCut, un software de estimación de poses de código abierto, para el análisis cuantitativo de la marcha y la locomoción espontánea en ratones en movimiento libre. El método se basa en la adquisición de vídeo con una sola cámara, el seguimiento sin marcador de hitos anatómicos y la extracción de parámetros locomotores espaciotemporales, sin necesidad de marcadores físicos ni hardware especializado. Para demostrar la aplicabilidad del protocolo, se implementó en el modelo murino triple transgénico de la enfermedad de Alzheimer (3xTg-AD) como ejemplo representativo de aplicación. Este enfoque preserva la libre movilidad y minimiza el estrés relacionado con el manejo, permitiendo una evaluación no invasiva del comportamiento motor. El protocolo es compatible con entornos estándar de pruebas de comportamiento. En conjunto, este método proporciona un marco accesible y no invasivo para el análisis cuantitativo de la marcha y la locomoción en la investigación preclínica.

Introducción

La marcha es un proceso motor complejo que surge de la interacción en tiempo real de sistemas motores, sensoriales y cognitivos, que requiere un procesamiento coordinado de la retroalimentación sensorial, el control postural, la planificación motora y la activación muscular para generar un movimiento estable^{y adaptativo 1}. Debido a esta naturaleza integradora, las alteraciones de la marcha se reconocen cada vez más como indicadores funcionales de disfunción neurológica tanto en la práctica clínica como en la investigación experimental. En modelos humanos y animales, el análisis de la marcha permite detectar cambios en la movilidad, riesgo de caídas, fragilidad y capacidad funcional, y se ha propuesto como biomarcador para la progresión de la enfermedad y la eficacia de intervenciones en múltiples^{condiciones 2,3,4}.

En la investigación básica, especialmente en modelos murinos, evaluar la marcha espontánea y la actividad locomotora representa una estrategia ampliamente utilizada para caracterizar fenotipos motores y evaluar el impacto de perturbaciones fisiológicas e intervenciones terapéuticas. La cuantificación objetiva de los parámetros locomotores permite detectar alteraciones motoras sutiles que no se capturan de forma fiable solo con la inspección visual, una limitación especialmente relevante en estudios preclínicos dirigidos a fenotipos⁵ tempranos o leves. En este contexto, el análisis de la marcha ha surgido como una herramienta valiosa para investigar alteraciones en el comportamiento motor e identificar cambios funcionales asociados a diferentes condiciones experimentales, como enfermedades neurológicas y^{neurodegenerativas 6}.

El análisis del comportamiento motor y la marcha en modelos murinos se ha basado tradicionalmente en plataformas tecnológicas especializadas diseñadas para cuantificar variables cinemáticas espaciales y temporales. Sistemas como pasarelas iluminadas, plataformas instrumentadas y software comercial de seguimiento de movimiento son de uso común; Sin embargo, su dependencia de hardware costoso e infraestructuras dedicadas limita significativamente la accesibilidad para muchos^{laboratorios 7, 8, 9, 10}. Más allá de las consideraciones económicas, estos enfoques introducen restricciones experimentales adicionales. Varios sistemas requieren que los animales recorran pasillos estrechos o caminos muy iluminados, imponiendo patrones locomotores forzados que reducen el comportamiento espontáneo, mientras que otros dependen de marcadores físicos, manchas de pintura o etiquetas adhesivas adheridas a las extremidades. Estas intervenciones pueden inducir estrés, alterar la mecánica de la marcha y confundir la interpretación fisiológica de los resultados motores 11,12,13,14. En conjunto, estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de metodologías capaces de capturar la marcha en condiciones naturales y de libre movimiento, sin depender de procedimientos invasivos o infraestructuras costosas.

Evaluar la marcha durante la locomoción sin restricciones permite observar patrones motores más naturales, evitando restricciones externas que regulan artificialmente la velocidad, la trayectoria o la postura. Este enfoque facilita la caracterización del comportamiento locomotor bajo condiciones mínimamente restringidas. DeepLabCut es un marco de estimación de poses de código abierto basado en aprendizaje profundo que utiliza redes neuronales convolucionales para rastrear hitos anatómicos definidos por el usuario sin necesidad de marcadores físicos. Al permitir el seguimiento anatómico de puntos a partir de grabaciones de vídeo estándar, DeepLabCut permite la extracción de parámetros cinemáticos mientras reduce sustancialmente el coste y la complejidad experimental 15,16,17,18. Es importante destacar que el seguimiento sin marcadores minimiza la interferencia experimental, haciéndolo adecuado para estudios de comportamiento espontáneo. Este enfoque sin marcador de cámara única es más adecuado para estudios que requieren cuantificación accesible y no invasiva de la actividad locomotora espontánea y de características bidimensionales relacionadas con la marcha bajo condiciones de libre movimiento. Sin embargo, se requieren plataformas de marcha instrumentadas o sistemas de captura de movimiento tridimensionales cuando se requieren variables biomecánicas directas, como fuerzas de reacción del suelo, presión plantar, ángulos articulares o cinemática tridimensional completa del miembro.

El objetivo de este artículo es presentar un flujo de trabajo de bajo coste y sin marcadores basado en DeepLabCut para la cuantificación no invasiva de la marcha y la locomoción espontánea en ratones en movimiento libre, integrando la adquisición de vídeo con una sola cámara, el seguimiento de hitos anatómicos y la extracción de parámetros locomotores espaciotemporales dentro de un flujo de trabajo accesible que no requiere hardware especializado ni manipulación invasiva. Este protocolo se centra en la implementación metodológica y en los resultados representativos del flujo de trabajo.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo el protocolo número 117.

1. Contexto de estudio

1. Utiliza ratones bajo las condiciones experimentales requeridas para el estudio. En este artículo de protocolo, utilizamos el modelo de ratón triple transgénico de la enfermedad de Alzheimer (3xTg-AD), que alberga los transgenes APPSwe y tauP301L en un PS1M146V fondo knock-in, junto con ratones no transgénicos como controles, como ejemplo representativo de implementación de flujo de trabajo.
2. Genotipa a todos los animales antes de que comience el estudio.
3. Mantener a los ratones con comida y agua a voluntad bajo condiciones controladas que consistan en un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h, una temperatura de 22 °C ± 2 °C y una humedad relativa del 60% ± 5%, bajo supervisión veterinaria.
4. Realizar grabaciones durante la fase de luz tras un periodo de hábito de 60 minutos, utilizando una única sesión en campo abierto por animal para preservar el comportamiento exploratorio espontáneo y evitar la reducción de actividad asociada a la exposición repetida a la arena.
   NOTA: En este artículo del protocolo, presentamos grabaciones representativas exclusivamente para ilustrar el flujo de trabajo y el tipo de salidas locomotoras y de marcha generadas por el método, en lugar de apoyar comparaciones biológicas entre grupos.

2. Materiales

1. Nosotros son los materiales y equipos listados en la Tabla de Materiales y Equipos para el registro y análisis de la locomoción y la marcha espontáneas. Véase la Figura 1 para el conjunto general del montaje experimental.

3. Habituación y registro de la locomoción espontánea

1. Preparación y habituación animal
   1. Transfiere cuidadosamente al ratón de su sala de alojamiento a la sala de pruebas de comportamiento al menos 60 minutos antes del experimento para permitir la adaptación ambiental.
   2. Mantener la sala de pruebas de comportamiento bajo condiciones ambientales controladas, incluyendo una temperatura constante de 20 °C–22 °C, intensidad de iluminación estandarizada (120–150 lux medida a nivel de arena) y ruido blanco continuo para minimizar estímulos auditivos externos.
   3. Durante el periodo de habituación, mantén al animal en su jaula sin introducir estímulos o enriquecimientos adicionales. Manejar a los animales de acuerdo con las directrices institucionales de bienestar animal para minimizar la variabilidad conductual inducida por el estrés.
   4. Manipula al animal usando guantes limpios y movimientos lentos y deliberados. Levanta suavemente al animal por la base de la cola y apoya el cuerpo con la mano opuesta antes de colocarlo en la arena del campo abierto.
      Nota: PASO CRÍTICO: Un manejo inconsistente o un tiempo de adaptación insuficiente pueden aumentar los comportamientos relacionados con la ansiedad e introducir variabilidad en los parámetros locomotores. Asegúrate de procedimientos de habituación idénticos en todos los animales y sesiones.
2. Preparación de arena y cámara en campo abierto
   1. Antes de cada sesión de grabación, limpia a fondo la arena acrílica de campo abierto con etanol al 70% (v/v) para eliminar olores residuales y señales de olor previas. Deja que la superficie se seque completamente antes de usarla.
   2. Manipula etanol al 70% en un lugar bien ventilado, mantenlo alejado de fuentes de calor o de ignición, y deja que la arena se seque completamente antes de usarla.
   3. Coloca la arena en campo abierto de forma segura sobre la plataforma de madera, asegurando que la estructura sea estable y libre de vibraciones.
   4. Inspecciona las paredes acrílicas transparentes y la superficie mate del suelo para confirmar que están libres de polvo, humedad o residuos reflectantes que puedan interferir con el seguimiento de vídeo.
   5. Coloca lámparas laterales externas de luz blanca a ambos lados de la arena en un ángulo aproximado de 30–45° respecto al plano de la arena para proporcionar una iluminación uniforme en toda la zona de grabación y minimizar sombras, reflejos o brillo excesivo. Ajusta la colocación de las lámparas antes de cada sesión y verifica que la iluminación a nivel de arena se mantenga dentro del rango objetivo de 120-150 lux.
   6. Coloca la cámara debajo de la pista en una configuración de vista inferior a una distancia fija de aproximadamente 80 cm del plano de la arena, asegurando una visibilidad completa del área de grabación. Ten en cuenta que esta distancia óptima puede necesitar ajustarse según la apertura del objetivo y el campo de visión (FOV) de la cámara específica para mantener la cobertura total de la arena.
   7. Conecta la cámara al sistema informático e inicia el software de adquisición de vídeo antes de presentar al animal.
   8. Ajusta el enfoque de la cámara y el campo de visión para asegurarte de que toda la superficie de la arena sea visible y resuelta con nitidez.
   9. Adquiere una imagen de referencia para calibración espacial colocando la cuadrícula de tablero de ajedrez o el patrón de calibración con dimensiones conocidas en el plano de la arena.
      NOTA: PASO CRÍTICO: Una alineación precisa de la cámara, una distancia fija y una iluminación constante son esenciales para una estimación fiable de la pose sin marcadores. Las desviaciones en la geometría o las condiciones de iluminación pueden reducir la precisión del seguimiento y comprometer la comparabilidad de los datos entre sesiones.
      NOTA: Se pueden utilizar materiales alternativos, incluido el acero inoxidable, para la estructura de soporte externa, siempre que el montaje se mantenga estable y se preserve la alineación de registro.
      NOTA: También puede utilizarse una arena opaca o materiales alternativos para paredes, especialmente cuando se desea un control adicional de la entrada visual externa, siempre que la configuración de grabación se mantenga estable y se minimice la interferencia visual externa.
      NOTA: Las dimensiones de la arena usadas en este protocolo corresponden a la configuración empleada para grabar ratones en movimiento libre. Estas dimensiones pueden ajustarse según el roedor utilizado y el protocolo adoptado para campo abierto, siempre que se mantenga la visibilidad completa del animal, la calibración espacial y las condiciones consistentes de adquisición.
3. Registro del comportamiento locomotor espontáneo
   1. Antes de colocar el ratón en la arena, muestra brevemente el identificador del animal en el fotograma de vídeo para asegurar una asociación visual directa entre la grabación y la sesión experimental correspondiente.
   2. Inicia la grabación de vídeo antes de colocar el ratón en el centro de la arena en campo abierto para asegurar la captura del comportamiento exploratorio inicial desde el inicio de la sesión.
   3. Coloca suavemente el ratón en el centro de la arena del campo abierto.
   4. Graba la locomoción espontánea de forma continua durante 3 minutos sin introducir alteraciones visuales, auditivas o táctiles. En el protocolo actual, solo se realizaba una sesión de grabación por ratón.
   5. Monitoriza la transmisión de vídeo en directo en la pantalla del ordenador para confirmar la grabación ininterrumpida y la captura adecuada de los movimientos del animal.
   6. Verifica periódicamente la alineación de la cámara y la uniformidad de la iluminación entre sesiones para asegurar condiciones de grabación consistentes entre los animales.
   7. Al final del periodo de grabación, detener la adquisición de vídeo y retirar cuidadosamente al animal de la arena utilizando el mismo procedimiento de manipulación descrito anteriormente.
   8. Devuelvo al animal a su jaula y déjalo descansar antes de realizar más procedimientos.
      NOTA: Evite reposicionar al animal durante la grabación, ya que la interferencia externa puede alterar los patrones espontáneos de marcha y afectar el análisis posterior.
4. Limpieza, almacenamiento de datos y finalización de sesiones
   1. Limpia la arena de campo abierto de nuevo con etanol al 70% (v/v) después de cada sesión y déjala secar completamente antes de introducir el siguiente animal.
   2. Asegúrate de que no quede etanol ni olor residual en la superficie de la arena antes de introducir al siguiente animal.
   3. Documenta el identificador del animal, la fecha y hora de la sesión, la condición experimental y el nombre del operador inmediatamente después de cada grabación.
   4. Si se prueban más animales, se repite el procedimiento a partir del paso 3.1.1 bajo condiciones ambientales y experimentales idénticas.
   5. Guarda cada archivo de vídeo en una carpeta dedicada usando una convención de nombres estandarizada (por ejemplo, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. Al final del día experimental, apaga el sistema de cámaras y el equipo de iluminación para evitar desviaciones en los ajustes de iluminación entre las sesiones.
      NOTA: Aunque se utilizó etanol al 70% en el protocolo actual, ya que es un desinfectante comúnmente utilizado en este tipo de procedimiento, también pueden emplearse desinfectantes compatibles con acrílicos para evitar el deterioro progresivo de la superficie, siempre que la arena esté completamente seca y libre de olor residual antes de la siguiente grabación.
      NOTA: Cuando sea posible, se pueden preparar múltiples arenas para permitir el cambio inmediato entre sesiones y facilitar la progresión continua del experimento entre animales.
      Véase la Figura 1 para los materiales y el montaje del montaje experimental, incluyendo la plataforma de madera (Figura 1A), la arena de acrílico (Figura 1B), el sistema de iluminación lateral (Figura 1C), la posición de la cámara en vista inferior (Figura 1D) y el montaje experimental completo (Figura 1E).

Figura 1: Montaje experimental para la grabación de vídeo de locomoción en la arena de campo abierto. (A) estructura de soporte para la arena; (B) arena de campo abierto acrílica colocada sobre la plataforma; (C) iluminación lateral para asegurar una iluminación uniforme; (D) posicionamiento de cámara para registrar el movimiento desde abajo; (E) montaje completo. Las puntas de flecha blancas indican la orientación de la fuente de luz en la Figura 1C y de la cámara en la Figura 1D. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Procesamiento de vídeo y análisis cinemático

1. Preparación de vídeo y control de calidad
   1. Obtén vídeos en bruto en . MOV y convertirlos a .avi formato para compatibilidad con DeepLabCut, manteniendo parámetros constantes de tasa de fotogramas y resolución.
   2. Bguarda todos los archivos de vídeo en bruto inmediatamente después de la adquisición en una carpeta dedicada en el ordenador de análisis y aplica una convención de nombres estandarizada (por ejemplo, AnimalID_Session_Date).
   3. Revisa cada vídeo en su totalidad para confirmar que la grabación está completa y libre de interrupciones, caídas de fotogramas o corrupción. Los vídeos con errores de adquisición deben excluirse del análisis.
   4. Convierte los vídeos a MP4 (H.264) o formato AVI sin comprimir si el formato original no es compatible con DeepLabCut.
   5. Opcionalmente, realizar un recorte temporal de las imágenes de vídeo para eliminar los intervalos no experimentales al principio y al final de la sesión (por ejemplo, durante la introducción o retirada del animal del ámbito experimental).
   6. Confirma que la resolución y la tasa de fotogramas coinciden con los parámetros de adquisición utilizados durante la grabación y que se mantienen consistentes en todas las sesiones.
   7. Verifica que toda la superficie de la arena sea visible dentro del fotograma de vídeo y que no haya partes del cuerpo ocultas de forma persistente durante la locomoción.
   8. Pvincula todos los vídeos verificados y procesados en un directorio designado del proyecto para el análisis de DeepLabCut.
      NOTA: PASO CRÍTICO: Tasas de fotogramas inconsistentes, visibilidad parcial de la arena o desenfoque de movimiento reducirán directamente la precisión del seguimiento. Los vídeos que no cumplan los criterios de calidad no deben incluirse en el entrenamiento o inferencia del modelo.
2. Creación y configuración del proyecto
   1. Designa una biblioteca de vídeo para el proyecto, utilizando ya sea los mismos vídeos destinados al análisis o un subconjunto representativo para la formación en red.
   2. Lanza el entorno Python e importa el paquete DeepLabCut.
   3. Crea un nuevo proyecto DeepLabCut usando el comando:
   4. deeplabcut.create_new_project('NombreDeproyecto', 'Autor', 'CaminoVídeo').
   5. Define los puntos anatómicos (partes del cuerpo) de interés en el archivo config.yaml, asegurando definiciones claras y anatómicamente consistentes.
   6. Las definiciones de las partes del cuerpo deben optimizarse para la pregunta experimental y permanecer idénticas en todos los animales y sesiones.
3. Extracción del chasis y etiquetado de partes del cuerpo
   1. Especifica start, stop, numframes2extract y cropping_parameters en el archivo config.yaml según la duración del vídeo y la disposición espacial.
   2. Extraer los marcos representativos usando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automático', 'kmeans'/'uniforme').
   3. Revisa los fotogramas extraídos para confirmar la inclusión de variaciones en la postura corporal, orientación, posición de las extremidades y cobertura de la fase de marcha a lo largo de la grabación. Si posturas específicas, configuraciones de extremidades o fases locomotoras están infrarrepresentadas, extrae marcos adicionales para representar mejor estas condiciones.
   4. Cuando se requieran fases específicas del ciclo de marcha, extrae manualmente los fotogramas usando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manual').
   5. Inicia la interfaz gráfica de etiquetado usando: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Etiqueta todos los puntos anatómicos predefinidos mostrados en la Figura 2, incluyendo el fotograma de vídeo representativo durante la adquisición (Figura 2A), la detección automática de puntos del cuerpo superpuesta sobre el marco original (Figura 2B) y la representación esquemática de los puntos de referencia definidos del cuerpo y los puntos de referencia de la arena usados para el análisis (Figura 2C). Seguir criterios anatómicos consistentes (por ejemplo, nariz: punta anterior del hocico; base de la cola: unión entre la columna y la cola)
   7. Etiqueta las cuatro extremidades de forma consistente colocando cada punto de referencia en el centro de la pata sobre las almohadillas plantares en contacto con el suelo.
   8. Guarda e inspecciona las etiquetas usando: deeplabcut.check_labels(config_path), y corrige las anotaciones inexactas si es necesario.
   9. Cuando sea posible, pide a un segundo evaluador entrenado que etiquete un subconjunto de tramas para evaluar la consistencia entre evaluadores.
      NOTA: PASO CRÍTICO: El etiquetado inconsistente o anatómicamente impreciso es una fuente importante de errores de seguimiento aguas abajo. Asegurarse de cumplir estrictamente con las definiciones de monumentos en todos los marcos.
4. Entrenamiento en redes neuronales
   1. Entrenar el modelo de estimación de pose para 200 épocas y obtener un error medio final de entrenamiento (RMSE) de 3,27 píxeles y un error medio de prueba de 3,59 píxeles, correspondiente a un rendimiento de seguimiento estable bajo las condiciones de adquisición descritas.
   2. Crea los conjuntos de datos de entrenamiento y evaluación usando: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Ajusta el parámetro de fracción de entrenamiento en config.yaml para definir la proporción de imágenes utilizadas para el entrenamiento.
   4. Verifica la disponibilidad de la GPU ejecutando: nvidia-smi.
   5. Comienza la formación en red usando: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, épocas=200).
   6. Monitoriza la pérdida de entrenamiento y detén el entrenamiento una vez que los valores de pérdida se estabilizan y no se observa ninguna mejora adicional.
   7. Si el entrenamiento se interrumpe, reanuda desde el último punto de control guardado.
   8. Evalúa el modelo entrenado usando: deeplabcut.evaluate_network(config_path) y registra el error medio de píxel.
   9. Si el error supera el umbral aceptable para la configuración experimental, añadir tramas etiquetadas adicionales o refinar anotaciones y repetir el entrenamiento.
      NOTA: Los umbrales aceptables de error de píxel pueden variar según la resolución de la cámara y el tamaño de la arena, pero deben mantenerse consistentes entre los experimentos.
5. Análisis de vídeo y cuantificación de la marcha
   1. Considera que los puntos con un valor de verosimilitud inferior a 0,3 faltan.
   2. Interpolar linealmente los puntos faltantes solo cuando los huecos son ≤3 fotogramas consecutivos; excluye los intervalos más largos del análisis.
   3. Definamos los tramos locomotores usando un umbral de velocidad central del cuerpo de 10 cm/s.
   4. Excluye los movimientos por debajo de este umbral y los eventos transitorios de menos de 3 fotogramas.
   5. Haz inferencia en vídeos experimentales usando: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Verdadero).
   6. Genera vídeos etiquetados usando: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) para confirmar visualmente la calidad del seguimiento (Figura 2).
   7. Establece el parámetro pcutoff en config.yaml en 0.6 para aplicar un umbral de confianza durante la visualización y evaluación del seguimiento.
   8. Importa los archivos CSV de salida al entorno de computación estadística que aparece en la Tabla de Materiales, junto con el paquete de análisis correspondiente y los scripts personalizados proporcionados en el Material Suplementario 1 para cuantificación conductual.
   9. Convierte índices de fotogramas a tiempo usando la tasa de muestreo original del vídeo.
   10. Calibra las dimensiones espaciales transformando coordenadas de píxeles en unidades físicas usando las dimensiones conocidas de la arena y los puntos de referencia de las esquinas de arena rastreadas.
   11. Realizar control de calidad sobre las coordenadas rastreadas antes de la extracción métrica.
   12. Considera que los puntos con un valor de verosimilitud inferior a 0,3 faltan y los sustituyes por interpolación lineal cuando sea apropiado.
   13. Identifica trayectorias atipicas durante la inspección visual y corrígilas o excluyelas cuando sea necesario.
   14. Define los segmentos de marcha usando criterios cinemáticos sincronizados basados en el desplazamiento del centro del cuerpo y el movimiento de las extremidades posteriores.
   15. Excluye comportamientos no locomotores como encabritarse, girar y acicalarse.
   16. Calibrar y refinar manualmente los umbrales de definición según las condiciones experimentales y el modelo animal para conservar solo tramos locomotores robustos y continuos para su análisis.
   17. Calcular métricas de marcha derivadas de relaciones geométricas y temporales entre hilos con vías utilizando los segmentos locomotores continuos filtrados (Tabla 1). Estos incluían la longitud de la zancada, la longitud del paso, la anchura del paso, la cadencia, la duración de la zancada, la duración del paso, el tiempo de postura, el tiempo de swing, la amplitud ipsilateral y las medidas específicas de desplazamiento de las extremidades.
   18. Extrae métricas de campo abierto de la grabación completa usando los mismos datos de seguimiento (Tabla 1). Estos incluían la distancia total recorrida, la velocidad media, el tiempo de movimiento, el porcentaje del tiempo en movimiento, el número y duración de las rondas de caminata, y la distancia acumulada recorrida en las zonas central, periférica y de esquina.
   19. Compila todas las salidas en un archivo maestro estructurado para análisis estadístico posterior.
   20. Genera representaciones visuales (por ejemplo, trayectorias, mapas de calor, desplazamientos basados en el tiempo, patrones de marcha y gráficos de coordinación entre extremidades) utilizando los entornos computacionales listados en la Tabla de Materiales y los scripts de trazado descritos anteriormente.
   21. Visualizaciones representativas sincronizadas de la confianza puntual, detección de puntos de marcha, clasificación exploratoria de zonas y coordinación inter-extremidad se proporcionan en el Vídeo Suplementario 1 y el Vídeo Suplementario 2 para facilitar la interpretación del flujo de trabajo analítico.
6. Control de calidad y copia de seguridad de datos
   1. Inspecciona visualmente un subconjunto aleatorio de vídeos etiquetados para confirmar la consistencia anatómica entre fotogramas y sesiones.
   2. Compara las posiciones de referencia predichas con etiquetas anotadas para verificar la estabilidad y generalización del modelo.
   3. Guarda una copia completa del proyecto, incluyendo config.yaml, etiquetas originales, pesos de red entrenados y archivos de salida.
   4. Documenta las versiones de software utilizadas en el flujo de trabajo, incluyendo DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA y el entorno de computación estadística, junto con las especificaciones de la GPU y la fecha de análisis.
   5. Genera un informe resumen de los errores medios y los tiempos de procesamiento a partir de evaluation-results.csv.
   6. Haz una copia de seguridad de todo el proyecto en un archivo local y en un servidor institucional o almacenamiento en la nube seguro.
7. Entorno computacional y recursos de reproducibilidad
   1. Captura grabaciones de vídeo originales en . formato MOV con una resolución de 1080 × 1920 píxeles y aproximadamente 60 FPS.
   2. Preprocesa y transcodifica los vídeos a .avi formato.
   3. Durante este paso de conversión, recortar la región de interés, redimensionarla a una resolución cuadrada de 720 × 720 píxeles y estandarizar la tasa de fotogramas a una constante de 60 FPS para asegurar una cuantificación temporal precisa durante el análisis cinemático posterior.
   4. Implementa el flujo de trabajo de seguimiento sin marcadores usando DeepLabCut versión 3.0.0rc13 en un entorno Python configurado con Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 y CUDA 11.8.
   5. Entrenar el modelo de estimación de pose para 200 épocas y obtener un error medio final de entrenamiento (RMSE) de 3,27 píxeles y un error medio de prueba de 3,59 píxeles.
   6. Realizar análisis posteriores al seguimiento utilizando el entorno de computación estadística y los scripts personalizados proporcionados en el Material Suplementario 1 para la cuantificación de marcha y campo abierto.
   7. Utiliza un umbral de velocidad central corporal de 10 cm/s para identificar los episodios de caminata. Rellena los huecos de hasta 3 tramas entre épocas locomotoras y excluye movimientos transitorios más cortos de 3 tramas para conservar segmentos de marcha continuos para su análisis.
   8. Proporciona los ajustes relevantes de config.yaml, scripts de análisis representativos, ejemplos de archivos de vídeo y seguimiento, y pesos de modelos en el Material Suplementario 1.
   9. Proporcionar detalles adicionales de implementación, métricas de evaluación de modelos, especificaciones de hardware y parámetros de análisis específicos de cada caso en el Material Suplementario 1, cuando corresponda.
      NOTA: Ajusta estos parámetros según las condiciones de adquisición utilizadas en cada experimento.

Figura 2: Flujo de trabajo representativo para el seguimiento de puntos corporales sin marcador y el análisis de la marcha a partir de grabaciones de vídeo. (A) Fotograma de vídeo representativo de un ratón moviéndose libremente dentro de la arena de campo abierto durante la adquisición. (B) Ejemplo de detección automática de puntos corporales superpuestos al fotograma original tras la estimación de la pose, ilustrando los hitos anatómicos usados para el análisis. (C) Representación esquemática de los puntos de referencia del cuerpo definidos y los puntos de referencia de la arena utilizados para la reconstrucción de la marcha, calibración espacial y análisis locomotor cuantitativo. Puntos de referencia y puntos de referencia de la arena: hocico, garganta, centro del cuerpo, centro del cuerpo izquierdo (bcl), centro del cuerpo derecho (bcr), cadera izquierda (hipl), cadera derecha (hipr), base de la cola, centro de la cola, punta de cola, pata delantera izquierda (lfp), trasera izquierda (lhp), pata delantera derecha (rfp), pata trasera derecha (RHP), superior izquierda (tl), superior derecha (tr), inferior izquierda (bl) y inferior derecha (br). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Tras la aplicación del flujo de trabajo de seguimiento y análisis, el procesamiento automatizado reconstruyó la locomoción espontánea en campo abierto utilizando el punto de referencia definido del centro corporal y generó resultados cuantitativos adecuados para análisis posteriores. Los gráficos representativos de trayectoria ilustran cómo el protocolo captura el desplazamiento espacial a lo largo de la arena, la ocupación temporal y la dinámica de velocidad durante la exploración libre. Las variables de campo abierto m...

Discusión

Este estudio presenta un enfoque de bajo coste y sin marcadores para analizar la locomoción espontánea y la marcha en ratones en movimiento libre utilizando adquisición de vídeo estándar y estimación de poses basada en DeepLabCut dentro de un flujo de trabajo accesible. El flujo de trabajo permite extraer variables relacionadas con la locomotora y la marcha de grabaciones de vídeo, preservando el comportamiento locomotor natural y reduciendo la interferencia experimental. En este sentido...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70% etanol	Genérico	N/A	Limpieza de la arena entre sesiones
Lámparas ajustables de luz blanca	Genérico	N/A	Mantener una iluminación constante (100–150 lx)
Cortinas negras/control de resplandor	Genérico	N/A	Reducir la luz externa/reflejos
Plantilla de cuadrícula de tablero de ajedrez	Genérico	N/A	Imagen de referencia de calibración espacial
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	De código abierto	N/A	Software de estimación de pose
Cámara de video digital (HD, 16:9; ≥60 fps)	Genérico	N/A	Configuración fija en todas las sesiones
Estación de trabajo con GPU de Nvidia	Construido a medida	N/A	Hardware para el entrenamiento/inferencia del modelo
Luxómetro	Genérico	N/A	Verificar la iluminación en el nivel de la arena
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Marco requerido por DeepLabCut
Arena de campo abierto de acrílico transparente (42 × 42 × 42 cm)	Hecho a medida / Propio	N/A	Arena de campo abierto
Montaje de cámara debajo de la arena (vista de 90°)	Hecho a medida / Propio	N/A	Montaje estable para grabación inferior
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	Procesamiento paralelo acelerado por GPU
Lenguaje de programación R	Fundación R	N/A	Lenguaje de programación para el análisis de datos