Modelo murino para la transección selectiva de nervios autónomos intestinales

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo permitir una transección precisa y selectiva de nervios simpáticos y parasimpáticos que inervan el intestino en ratones utilizando la arteria mesentérica superior como un hito anatómico consistente, proporcionando un modelo enfocado y reproducible para estudiar la regulación autónoma de la fisiología y enfermedad intestinal.

Resumen

Los nervios autónomos comprenden los sistemas simpático y parasimpático, que actúan de manera mayormente antagónica para regular diversas funciones fisiológicas. Con el creciente interés en los roles de la inervación autónoma en la fisiología y patología intestinal, existe una necesidad creciente de modelos experimentales que permitan manipular con precisión las entradas simpáticas y parasimpáticas dirigidas al intestino. Aquí presentamos un protocolo quirúrgico para seccionar selectivamente los nervios simpático y parasimpático que inervan el intestino. Utilizando la arteria mesentérica superior (SMA) como un hito anatómico reproducible, este enfoque permite identificar de forma fiable los haces nerviosos autónomos intestinales y la posterior transección dirigida. A diferencia de enfoques de denervación más amplios como la ganglionectomía o la vagotomía subdiafragmática, este enfoque pretende lograr una transección anatómica más localizada de los haces autónomos dirigidos al intestino, lo que puede ayudar a reducir la interferencia extraintestinal. La lesión es controlable y suele asociarse a un sangrado mínimo, lo que favorece la consistencia del procedimiento y la recuperación postoperatoria. Aunque la cirugía requiere formación microquirúrgica adecuada, el protocolo es adaptable, permitiendo a los usuarios adaptar parámetros clave a objetivos experimentales específicos. Es importante destacar que este modelo proporciona una plataforma práctica para investigar los roles de los nervios simpáticos y parasimpáticos en la regulación de la función intestinal tanto en condiciones fisiológicas como patóricas. Este artículo pretende describir el procedimiento en detalle para facilitar su adopción por parte de nuevos usuarios en sus investigaciones.

Introducción

El tracto gastrointestinal está bajo control continuo del sistema nervioso autónomo (SNA), con vías simpáticas y parasimpáticas que coordinan aspectos fundamentales de la fisiología intestinal, incluyendo motilidad, secreción, función de la barrera epitelial y homeostasis^{inmunitaria 1,2}. En el colon, las entradas simpáticas extrínsecas pueden ejercer efectos dependientes de la región a través de múltiples compartimentos celulares, lo que subraya que las perturbaciones amplias del SNA pueden ocultar fenotipos intestinales específicos de sitio¹. Por el contrario, los circuitos parasimpáticos, tradicionalmente mediados por señalización vagal y mecanismos colinérgicos posteriores, son cada vez más reconocidos como parte integral para mantener el equilibrio inmunitario intestinal y moldear las respuestas mucosas, lo que motiva aún más estrategias experimentales que pueden separar las contribuciones simpáticas de las parasimpáticas con precisión^{anatómica 2}.

Más allá de la regulación fisiológica, la actividad autonómica ha surgido como un modificador relevante de la biología de las enfermedades intestinales, incluido el cáncer colorrectal (CCR). Trabajos recientes en CRC demuestran un programa bidireccional nervio simpático–mesenquimato, en el que la señalización β2-adrenérgica y los fibroblastos asociados al cáncer que expresan NGF refuerzan las interacciones neural-estromales y promueven la progresión tumoral, proporcionando evidencia directa de que los circuitos simpáticos pueden estar funcionalmente acoplados a la patogénesis³ del CRC. Paralelamente, la señalización colinérgica se ha relacionado con el crecimiento del CRC y características inmunitarias asociadas al tumor, como se demuestra mediante la inhibición farmacológica del receptor muscarínico 3 en un modelo murino ortotópico y la conexión de la señalización colinérgica con la expresión en puntos de control inmunitarios y otras características^{malignas 4,5}. Es importante destacar que las influencias autonómicas sobre las enfermedades intestinales también pueden converger con otros moduladores, como el estrés psicológico y la microbiota intestinal. El sistema nervioso entérico puede transmitir señales de estrés a la inflamación intestinal⁶, y las señales microbianas pueden activar los circuitos intestino-cerebro que ajustan las neuronas simpáticas intestino-extrínseco, apoyando colectivamente un marco multifactorial en el que la regulación neural se cruza con la ecología inmune y^{microbiana 6,7}.

Estas líneas convergentes de evidencia ponen de manifiesto la necesidad de enfoques experimentales que puedan aislar los efectos autonómicos dirigidos al intestino con suficiente precisión anatómica para apoyar la inferencia causal tanto en contextos fisiológicos como patológicos. A pesar del rápido progreso en el mapeo de circuitos y la neuromodulación, muchas intervenciones comúnmente utilizadas siguen siendo limitadas en especificidad de órganos. La manipulación farmacológica sistémica, la simpatectomía química y la vagotomía subdiafragmática pueden influir en amplios resultados autonómicos y, por tanto, alterar puntos de ajuste inmunitarios y metabólicos más allá del intestino, complicando la atribución causal a entradas neuronales específicas del^{colon 8}. Por ejemplo, los circuitos vagales pueden suprimir la producción de citocinas^{inflamatorias 9}, y la estimulación vagal puede modular la función endocrina pancreática y la dinámica celular β, lo que ilustra que intervenciones aguas arriba o no selectivas pueden introducir efectos extra-intestinales que dificultan la interpretación de los fenotipos^{intestinales 10}. Estas limitaciones son especialmente importantes para estudios que buscan aislar mecanismos autónomos restringidos por colon en fisiología y patología. El objetivo general del método es, por tanto, permitir la transección anatómica y selectiva de fibras simpáticas y parasimpáticas dirigidas al intestino en ratones, proporcionando un modelo práctico para interrogar la regulación autonómica intestinal con un impacto fuera del objetivo reducido.

En resumen, este protocolo informa de un enfoque más preciso de denervación autonómica intestinal murina con mínima interrupción de la inervación autónoma de otros órganos abdominales, mejorando así la interpretabilidad al reducir el sesgo potencial de efectos extra-intestinales.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Hospital de la Amistad de Pekín, Universidad Médica Capital (Nº 24-2026). En este estudio se utilizaron ratones machos silvestres adultos tipo C57BL/6J (8–10 semanas, 20–30 g). La información detallada sobre reactivos y equipos se proporciona en la Tabla de Materiales.

Criterios de inclusión: Se utilizaron ratones de la misma cepa, sexo y rango de edad en cada experimento para minimizar la variabilidad biológica. Solo se incluyeron animales sanos que mostraron actividad normal, comportamiento de acicalación, ingesta de comida y agua, y producción de heces durante el periodo de aclimatación. Además, los ratones se aclimataron a la instalación animal durante al menos 7 días antes de la cirugía.

Criterios de exclusión: Se excluyeron ratones en casos de sangrado incontrolado o lesión vascular mayor durante la cirugía, perforación intestinal o daño tisular significativo incompatible con la supervivencia. También se excluyeron los animales que no se recuperaron de la anestesia, definidos como no deambulando en las 2 horas posteriores a la cirugía. Criterios adicionales de exclusión incluyeron complicaciones postoperatorias como dehiscencia persistente de la herida, infección grave o pérdida de peso superior al 15% en 48 horas o un 20% en cualquier periodo de 72 horas. También se excluyeron ratones con identificación errónea quirúrgica de la rama nerviosa, confirmada por evaluación histológica a posteriori.

1. Preparación preoperatoria

1. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos.
2. Administrar analgesia preventiva a todos los ratones 30 minutos antes de la cirugía para evitar la sensibilización al dolor. Administrar meloxicam (5 mg/kg de peso corporal) mediante inyección subcutánea.
3. Precalienta la almohadilla térmica a 37 °C y colócala bajo la plataforma quirúrgica.
4. Rocía la zona quirúrgica (incluida la cámara de inducción de anestesia) con etanol al 75% y limpia bien con papel de cocina. Coloca suficientes toallas de papel en el fondo de la cámara de inducción.
5. Inspecciona la cámara de inducción de anestesia y el tubo para confirmar que no hay fugas. Rellena y asegura un suministro adecuado de isoflurano. Inducir anestesia administrando isoflurano al 3%–3,5% en 1 L/min de oxígeno. Vigila el ratón continuamente; Normalmente se alcanza un plano quirúrgico en 1–2 minutos.
6. Coloca al ratón en posición supina con las cuatro extremidades completamente extendidas y sujeta con cinta hipoalergénica. Ajusta y asegura el cono de la nariz. Reducir el isoflurano al 1,5%–2,5% para el mantenimiento. Evalúa la profundidad anestésica por la ausencia de respuesta de retirada del pedal (sin reacción al pellizco en el dedo) y respiración regular (55–65 respiraciones/min).
   NOTA: Durante procedimientos microquirúrgicos prolongados, la profundidad anestésica se monitoriza continuamente más allá del plano quirúrgico inicial. Además de evaluar el reflejo de retirada del pedal y la frecuencia respiratoria cada 5–10 minutos, monitorizamos el patrón respiratorio (por ejemplo, regularidad y profundidad) y la frecuencia cardíaca mediante observación visual o contacto con la pared torácica. El color de la membrana mucosa (evaluado a partir de las patas o labios) también se revisa periódicamente para asegurar una oxigenación adecuada. Si el ratón muestra signos de anestesia aligerante, como aumento de la frecuencia respiratoria (>80 respiraciones/min), movimientos espontáneos o el regreso del reflejo pedal, la concentración de isoflurano aumenta en incrementos del 0,25%–0,5% hasta que se restablece un plano quirúrgico adecuado. Por el contrario, si la respiración se vuelve superficial o irregular, o si la frecuencia cardíaca disminuye notablemente, el isoflurano se reduce entre un 0,25% y un 0,5% hasta que recupere la función cardiorrespiratoria estable. Este ajuste dinámico garantiza que el ratón mantenga una profundidad anestésica adecuada durante todo el procedimiento, minimizando la depresión cardiorrespiratoria.
7. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar el resecamiento corneal y las lesiones bajo anestesia.
8. Afeita el vello abdominal desde el nivel de la sínfisis púbica hasta la zona por debajo del margen costal usando una máquina eléctrica de afeitar el pelo. Luego, mueve la plataforma quirúrgica bajo un estereomicroscopio.
9. Desinfecta el sitio quirúrgico utilizando hisopos de povidona-yodo en un patrón concéntrico hacia fuera (del centro a la periferia), cubriendo el área desde debajo del xifoides hasta la sínfisis púbica y lateralmente hacia ambos flancos. Repite 3 veces. Luego limpia con etanol al 70% de la misma manera. Asegúrate de que el campo esté libre de pelo suelto.
10. Ponte una mascarilla quirúrgica y un gorro desechable, una bata quirúrgica estéril y guantes estériles.
11. Cubre al ratón con una cortina estéril con fenestras. Ajusta la fenestración a aproximadamente 2 × 3 cm y alineala con la línea media abdominal para exponer completamente el campo quirúrgico. Asegura las cuatro esquinas de la cortina.

2. Laparotomía y exposición

1. Con pinzas estériles, levanta suavemente un pequeño pliegue de piel justo al craneal de la sínfisis púbica. Con tijeras estériles de punta afilada, realiza una pequeña incisión inicial en el ápice (~0,3 cm), luego extiende la incisión cutánea de forma craneal a lo largo de la línea media durante 1,5–2,0 cm.
   NOTA: Después de insertar las puntas afiladas de tijera en la abertura inicial, inclina las puntas hacia arriba y realiza un "push-cut" controlado a lo largo de la superficie inferior de la piel para evitar cortar demasiado profundo y dañar la musculatura abdominal o las vísceras. Utiliza pinzas y tijeras para diseccionar de forma sin rodeos el tejido conectivo subcutáneo suelto de la musculatura de la pared abdominal subyacente. Disecciona un poco más ancho que la incisión cutánea para facilitar la exposición posterior.
2. Aproximadamente 0,5 cm caudal hasta el proceso xifoide, insertar cuidadosamente las puntas de las pinzas finas estériles en la línea alba y levantar una pequeña carpa de tejido.
3. Con tijeras estériles y de punta afilada, crea una pequeña abertura (2–3 mm) en el lugar levantado. En este punto, el peritoneo liso y/o los órganos subyacentes (por ejemplo, un lóbulo hepático) deberían ser visibles.
4. Inserta una hoja de tijeras estériles de punta roma en la cavidad peritoneal, manteniéndola cerca de la pared abdominal. Con visualización directa, extiende la incisión a lo largo de la línea alba hacia la dirección craneal hasta que la longitud total coincida con la incisión cutánea.
   NOTA: Mantén la punta de las tijeras inclinada hacia arriba durante todo el tiempo y procede solo con visión directa para asegurarte de que no haya bucles intestinales ni vasos sanguíneos bajo las tijeras.

3. Identificación de la arteria mesentérica superior y la transección nerviosa

1. Retrae suavemente la pared abdominal lateralmente usando tiras de cinta estériles para exponer la cavidad peritoneal.
2. Aplica una presión moderada con un hisopo de algodón en la pared abdominal para permitir que los intestinos se exterioricen. Mueve suavemente el intestino delgado, el colon y el ceco hacia el lado izquierdo del ratón.
   NOTA: Cubre el intestino expuesto con una almohadilla de algodón estéril o una gasa humedecida con solución salina estéril tibia (≈37 °C) para evitar el sequeo del tejido y la pérdida de calor.
3. Con la mano derecha, desplaza suavemente el estómago, el duodeno y el colon en bloque hacia el cuadrante superior izquierdo con un hisopo de algodón estéril y humedecido (o micropinzas de punta roma). La aorta abdominal, anterior a la columna, debería ser claramente visible en esta etapa, a veces parcialmente cubierta por una pequeña cantidad de grasa retroperitoneal.
4. Identifica la vena renal izquierda y el tronco celíaco. La arteria mesentérica superior (SMA) se origina como una sola rama arterial desde la pared anterior de la aorta abdominal, típicamente a ~2–4 mm caudal hasta el tronco celíaco y a nivel o ligeramente por encima del nivel de la vena renal izquierda.
   NOTA: La vena renal izquierda es una vena oscura y gruesa que recorre horizontalmente la parte anterior de la aorta abdominal antes de drenar hacia la vena cava inferior. El tronco celíaco suele ser la primera rama arterial principal que surge de la pared anterior de la aorta abdominal, situada justo en la parte craneal (superior) de la vena renal izquierda, y comúnmente se trifurca en las arterias hepática, esplénica y gástrica izquierda. En cambio, la SMA es un tronco único sin ramas hepáticas/esplénicas. Entra en la raíz del mesenterio y suministra el yeyuno, el íleon y el colon proximal; Rastrear su curso hasta el mesenterio puede ayudar a confirmar la identificación correcta.
5. Identifica los haces blanco-lechoso, en forma de cordón, que corren paralelos a la AME como fibras nerviosas objetivo. El haz nervioso situado por encima del SMA corresponde a las fibras parasimpáticas, mientras que el haz situado por debajo del SMA corresponde a las fibras simpáticas (Figura 1A).
6. Usando microfórceps y microtijeras, separa muy suavemente el tejido graso y linfático que rodea la SMA para exponer completamente las fibras nerviosas. Levanta suavemente el haz nervioso simpático o parasimpático con micropinzas para separarlo de la AME, y luego transectarlo rápida y cuidadosamente (Figura 1).
   NOTA: Durante la disección, mantenga las puntas de las pinzas y las tijeras orientadas hacia la pared lateral de la arteria y evite dirigir los instrumentos verticalmente hacia planos más profundos. Si se produce un sangrado importante (por ejemplo, hemorragia por la AME o aorta abdominal que no puede controlarse en 30 s aplicando presión con un hisopo de algodón estéril), el procedimiento se interrumpe inmediatamente. El animal es sacrificado humanamente mientras sigue bajo anestesia y queda excluido de todos los análisis posteriores. Este punto final está predefinido de acuerdo con los criterios humanos aprobados por la IACUC para evitar sufrimientos innecesarios. En el Archivo Suplementario 1 se proporciona orientación adicional para la resolución de problemas de complicaciones intraoperatorias comunes.

4. Cierre de la cavidad abdominal

1. Quita todas las gasas o almohadillas de algodón intraabdominales. Inspecciona cuidadosamente la cavidad abdominal en busca de hemorragias activas, prestando especial atención al campo de disección del SMA, al sitio de la transección nerviosa y a los bordes del corte de la pared abdominal.
2. Riega suavemente la cavidad peritoneal con un pequeño volumen de suero salino estéril y tibio (0,5–1,0 mL), y luego absorbe cuidadosamente el exceso de líquido usando un hisopo de algodón seco y estéril.
3. Realiza un recuento con instrumentos y gasas/algodón para asegurarte de que no se retenga material extraño dentro de la cavidad abdominal.
4. Utilizando sutura absorbible 6-0, cierra el peritoneo y la capa muscular con una puntada continua que comienza desde un extremo de la incisión. Cada mordida debe incorporar el peritoneo y la musculatura de la pared abdominal en ambos lados.
   NOTA: Levanta los bordes de la herida con pinzas y coloca cada puntada en visualización directa para evitar que se enganche el intestino o el omento subyacentes. Si es necesario, desplaza suavemente los intestinos alejándolos de la incisión con un hisopo de algodón humedecido.
5. Cierra la piel con suturas interrumpidas usando suturas trenzadas de seda 5-0 no absorbibles. Colocar suturas a intervalos de ~2 mm y hacer nudos con tensión moderada, aproximando (pero sin estrangular) los bordes de la piel para evitar isquemias.
   NOTA: Una mala aposición de la herida puede provocar una hernia incisional. Asegúrate de que la capa muscular esté bien sellada y que los bordes de la piel estén bien alineados.
6. Limpia suavemente la incisión cutánea cerrada una vez más con un hisopo de povidona y yodo.
7. Marca el ratón (oreja o cola) con la fecha de la cirugía.
8. Retira el cono nadal y transfiere el ratón a una jaula de recuperación limpia y blanda colocada sobre una almohadilla de calentamiento a 37 °C (carcasa simple). Mantener al animal en posición de reclinación lateral para reducir el riesgo de aspiración.
   NOTA: Confirme que la almohadilla de calentamiento se mantiene estable a 37 °C para evitar la hipotermia. Si es necesario, administrar 1 mL de solución salina estéril tibia por vía subcutánea para dar soporte al volumen.
9. Vigila continuamente al ratón hasta que recupere completamente la conciencia y pueda mantenerse en posición prono de forma independiente.
   NOTA: Se continuó la analgesia postoperatoria con meloxicam (5 mg/kg, subcutáneo, una vez cada 24 horas durante hasta 48 horas tras la cirugía), con evaluación veterinaria adicional si se observaban signos de dolor o malestar persistente.

5. Parámetros de monitorización postoperatoria

NOTA: El seguimiento postoperatorio se realizó dos veces al día durante las primeras 72 horas y luego diariamente durante toda la duración del estudio. Los parámetros evaluados incluyeron:

1. Controla el aspecto general, incluyendo el aseo, el estado del pelaje, la postura y el nivel de actividad.
2. Mide el peso corporal diariamente; Define una pérdida de más del 15% del peso corporal preoperatorio en un plazo de 48 horas o un 20% durante cualquier periodo de 72 horas como un punto final humano.
3. Inspecciona el lugar de la cirugía en busca de signos de infección, dehiscencia o secreción.
4. Vigila el comportamiento, incluyendo movimientos espontáneos, respuesta al manipulo y signos de angustia (por ejemplo, vocalización e inquietud).
5. Evalúa cualquier animal que muestre signos persistentes de dolor o malestar a pesar de la analgesia por parte del personal veterinario y, si es necesario, eutanasia al animal.

Resultados

Utilizando la AME como un hito anatómico consistente, los haces nerviosos autónomos intestinales pueden identificarse como estructuras delgadas, de un blanco perlado, que corren paralelas al vaso. En función de su posición anatómica respecto al SMA, el haz superior se designaba como el fibrado parasimpático presumido y el fibrado inferior como el fibrado simpático presumido (Figura 1A,D). Se obtiene un resultado positivo intraoperatorio cuan...

Discusión

La SMA murina se origina en la pared anterior de la aorta abdominal, inferior al tronco celíaco, y proporciona entrada arterial a las vísceras abdominales principales, incluido el^{intestino 14}. En la parte anterior de la AME se encuentran el colon y su mesenterio, mientras que posteriormente está estrechamente relacionada con la vena renal izquierda y la aorta abdominal; la vena mesentérica superior suele recorrer su lado derecho. En ratones, la SMA es extremadamen...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-0 silk braided non-absorbable suture	Ethicon	W500
6-0 PGA Suture	Jinhuan	CR631
Anesthesia Induction Chambers	RWD Life Science	V100
Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500IP
Anti-Choline Acetyltransferase antibody	Abcam	ab181023
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugate	Thermo Scientific	C34776
Compound Microscope	Yuyan Instruments	512
DAPI and Hoechst Nucleic Acid Stains	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fine Hemostatic Forceps	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Micro Forceps(Curved)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Micro Forceps(Straight)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Micro Needle holders	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Micro scissors	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Micro syringe	Hamilton	7632-01
Ophthalmic Scissors(pointed tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Ophthalmic Scissors(rounded tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Povidone-Iodine Swabstick	Winner Medical	206
Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Tissue OCT-Freeze Medium	Sakura	C2077
Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	58844S