Dispositivo universal de carga de presión para imagen de células vivas bajo estrés fisiológico mecánico sostenido

Summary

El dispositivo de carga por presión descrito aquí permite la imagen óptica en lapso de tiempo de células cultivadas y es compatible con platos estándar de cultivo celular y microscopios invertidos. Con este dispositivo, se confirma que el microambiente de presión hidrostática tumoral mejora la transducción de señales de calcio, proporcionando una plataforma viable para estudiar la transducción mecánica de señales en el microambiente tumoral.

Abstract

Este protocolo describe un dispositivo de carga de presión hidrostática que facilita la observación microscópica en tiempo real de las células adherentes durante la estimulación sostenida de presión hidrostática, y es compatible con antenas comerciales de cultivo celular de 3,5 cm. El aparato consta de una cámara de cultivo hermética fabricada con una base de aluminio, una cubierta de poli(metacrilato de metilo) ópticamente transparente, puertos de entrada/salida de gas integrados en la tapa y una ventana de observación sellada. Al conectarse a una fuente de gas regulada, el dispositivo mantiene una presión hidrostática estable (0–200 kPa, ajustable) mientras permite la imagen continua con contraste de fase o fluorescencia. Utilizando este dispositivo de carga por presión, se pueden registrar efectos dependientes de la dosis inducidos por presión sobre el fenotipo y comportamientos celulares, como la morfología, proliferación y migración. Además, las señales fluorescentes también pueden grabarse en tiempo real. Aquí, se observaron y cuantificaron la heterogeneidad y dinámica de la señalización de Ca^2⁺ desencadenada por presión en células de cáncer de mama MDA-MB-231 y células HeLa de cáncer de cuello uterino mediante microscopía de fluorescencia invertida utilizando imágenes en time-lapse. Esta plataforma integra la carga mecánica con imágenes de células vivas para superar las limitaciones de los sistemas finales convencionales, proporcionando una herramienta universal para estudios mecanobiológicos.

Introduction

Numerosas células, tejidos y órganos experimentan fuerzas compresivas sostenidas o intermitentes como parte de su^{fisiología 1}. Por ejemplo, las células alveolares están sometidas a presurización cíclica durante la^{respiración 2}, mientras que las células epiteliales de la vejiga sufren cargas mecánicas durante la retención^{urinaria 3}. En contextos patológicos como los tumores sólidos, las células cancerosas están continuamente expuestas a fuerzas compresivas originadas por confinamiento espacial y presión elevada del líquido^{intersticial 4}. De manera similar, en otras enfermedades como la degeneración menisco y la fibrosis pulmonar, las células^{meniscales 5} y las células epiteliales^{alveolares 6} también sufren tensiones mecánicas sostenidas por la tensión y la presión derivada de la rigidez de la matriz.

Cada vez hay más pruebas que confirman que la presión mecánica actúa como un potente regulador del fenotipo y comportamiento celular ^7,8. En células no malignas, el estrés compresivo potencia la proliferación de células madre periodontales e induce la fusión de osteoclastos mediante protuberancias^{invasivas 9}. Por el contrario, en los modelos de cáncer, la compresión exhibe efectos de Janus: suprime la proliferación y migración de las células del melanoma mientras activa simultáneamente la reprogramación transcriptómica que promueve la^{quimiorresistencia 10,11}. Además, la compresión volumétrica causada por la presión hiperosmótica puede inducir apiñamiento intracelular y estimular la redistribución de la concentración de proteínas y la fuerza iónica mediante la separación en fase líquido-líquido (LLPS), que altera profundamente los comportamientos y el destino celular. Esta perturbación física potencia la expansión de los organoides intestinales mediante la señalización activada de Wnt/β-catenina y una mayor autorrenovación de las células madre^{intestinales 12}. Además, en el núcleo celular, LLPS inducida por cambios de volumen está implicada en el control transcripcional génico mediante la coordinación de la iniciación, elongación y terminación de la^{transcripción 13,14}.

Para investigar cuantitativamente estos efectos biológicos inducidos por la presión, son esenciales sistemas experimentales capaces de aplicar estímulos compresivos bien definidos y homogéneos. Para las células cultivadas in vitro, que están rodeadas por un medio acuoso, la presión hidrostática sirve como un medio principal y fisiológicamente relevante para aplicar tales fuerzas de compresión, que ha sido ampliamente adoptada para estudiar la mecanotransducción^{celular 15}. La presión hidrostática puede aumentar la actividad de la fosfatasa alcalina y acelerar la osteogénesis de células madre mesenquimales derivadas del adiposo humano sin suplementación de factores^{osteoinductivos 16}. En la enfermedad hepática grasa no alcohólica, fuerzas mecánicas como la presión hidrostática pueden contribuir a la hipertensión portal sin una fibrosis significativa, lo que subraya su papel en la diversidad^{tisular 17}. Aunque la presión hidrostática desempeña un papel importante en la regulación fisiopatológica, los estudios mecanicistas de la presión hidrostática se enfrentan a una limitación crítica: las cámaras de presión convencionales impiden la observación en tiempo real de células vivas durante la estimulación. La mayoría de los sistemas experimentales solo permiten el análisis de puntos finales, enmascarando la dinámica espacial y temporal de eventos de mecanotransducción, como la mecanoactivación Piezo1, la heterogeneidad del flujo Ca²⁺ y la reorganización del citoesqueleto. Esta brecha limitó la comprensión de cómo la presión hidrostática impulsa la diversidad de fenotipos en tumores u otros tejidos.

Para cubrir esta brecha tecnológica, se desarrolló una novedosa plataforma experimental que permite la observación en tiempo real de las respuestas celulares a una presión hidrostática controlada con precisión mediante imagen óptica. Este sistema integra tres capacidades clave: (1) aplicación de presión hidrostática sostenida en un rango de 0–100 kPa mediante un controlador de presión de gas ajustable (El manómetro tiene un rango de 0–200 kPa, y las presiones aplicadas pueden seleccionarse en función de parámetros fisiológicos. Por ejemplo, basándose en los esfuerzos compresivos reportados de varios tipos celulares: 8-16 kPa para células estromales de médula ósea^{humanas 18}, 12–24 kPa para células musculares lisas^{vasculares 19}, y 0–15 kPa para células epiteliales mamarias^{humanas 20}.); (2) imagen continua de celda viva con alta resolución temporal durante la aplicación de presión hidrostática; y (3) mantenimiento de las condiciones de cultivo fisiológico a lo largo de experimentos prolongados. Este enfoque permite la visualización directa de procesos dinámicos, incluyendo el reclutamiento y activación del canal Piezo1, las ondas de señalización de calcio y el remodelado del citoesqueleto que ocurren en respuesta a la estimulación mecánica. Además, este dispositivo es compatible con la mayoría de los platos de cultivo y microscopios invertidos comercialmente disponibles, lo que lo hace muy cómodo de usar en laboratorios. La capacidad de monitorizar estos eventos bioquímicos intracelulares en tiempo real proporciona conocimientos sin precedentes sobre cómo las células detectan y se adaptan a la presión hidrostática. Al capturar la secuencia temporal de eventos de mecanotransducción, que incluyen la detección inicial de la fuerza, la señalización posterior y los cambios fenotípicos, esta plataforma proporciona una herramienta poderosa para investigar los mecanismos fundamentales por los cuales la presión hidrostática influye en el comportamiento celular en contextos fisiológicos y patológicos.

Protocol

1. Materiales

1. Especificaciones del dispositivo (véase Figura 1)
   1. Preparar los componentes según las especificaciones mencionadas a continuación:
      Base: aluminio (Ø 56 mm, altura 15 mm), ventana central Ø 40 mm.
      Cubierta: PMMA (Ø 56 mm) con: 6 × orificios roscados M3, puerto de gas Luer-lock, junta de silicona (diámetro interior 25 mm, diámetro exterior 32 mm, espesor 0,8 mm)
      Regulador de presión: (rango 0–200 kPa)
2. Células y reactivos
   1. Utiliza MDA-MB-231 y células HeLa en este estudio. Utiliza medio L-15, medio RPMI 1640, suero de ternero recién nacido (NCS), solución antibiótico-antimicótica al 1% y una sonda de imagen de calcio para cultivo celular y marcado con Ca²⁺.

2. Preparación del dispositivo

1. Fabricación
   1. El diseño personalizado es el componente central de este estudio. Mecanizar con precisión la base de aluminio y la cubierta de PMMA según las especificaciones (véase la Figura 1 y la Figura Suplementaria 1).
   2. Corta la junta de silicona y procesa hasta el tamaño necesario.
      NOTA: La transmitancia óptica del material PMMA es suficiente para la imagen estándar de luz transmitida. Todos los componentes eran esterilizables y biocompatibles para experimentos posteriores de cultivo celular. No se imponen requisitos especiales sobre las tolerancias de fabricación de esta cámara (en este estudio se adoptó una tolerancia de ±0,1 mm).
2. Esterilización
   1. Para esterilizar la base (aluminio), autoclave a 121 °C durante 20 minutos.
   2. Para esterilizar la cubierta (PMMA), límpialo con etanol al 75% y luego esteriliza con UV durante 30 minutos.
   3. Esteriliza la junta de silicona autoclavando a 121 °C durante 20 minutos.

3. Procesamiento celular

1. Cultivo celular
   1. Células de semillas en platos de 35 mm con una confluencia del 30%–70%. Cultivar las células durante 24 horas en medio RPMI-1640 o L15 (suplementado con 10% de NCS) en una incubadora de_CO-2 a 37 °C con un 5% de CO₂.
   2. Para el paso celular, disociar las células con un 0,25% de tripsina y terminar la digestión con medio completo. Utiliza las células para resembrar una vez que alcancen el 70%–80% de confluencia.
2. Tinción Ca²⁺
   1. Retira el medio y luego lava las células dos veces con Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) precalentada en un armario de bioseguridad.
   2. Tingue el Ca²⁺ intercelular con una sonda de calcio de 5 μM en un medio libre de suero. Incuba las células durante 20 minutos a 37 °C en un entorno protegido por la luz.
   3. Retira el tinte, lava las células tres veces con HBSS y luego desesterifica durante 30 minutos en un medio sin suero.

4. Ensamblaje del dispositivo (Figura 2)

1. Transfiere el plato de cultivo a la ventana central de la cámara de presión y luego retira el medio de cultivo.
2. Coloca la junta esterilizada en el plato de cultivo.
3. Alinea la tapa sobre la chimenea de la junta de platos.
4. Aprieta los tornillos en diagonal primero apretándolos manualmente hasta que se sienta la resistencia, y luego añade 1,5 vueltas adicionales usando un atornillador controlado por par.
5. Conecta el tubo de gas de silicona al puerto Luer-lock e inyecta gas mezclado en el dispositivo para comprobar si hay fugas.
6. Desconecta el tubo de gas de silicona e inyecta un medio fresco en la placa de cultivo celular a través del puerto Luer-lock usando una jeringuilla estéril de 5 mL.

5. Carga de presión e imagen

1. Conecta el tubo de gas de silicona (diámetro interior de 4 mm) desde el puerto Luer-lock de la junta de silicona al manómetro digital y al depósito de gasolina.
2. Monta el dispositivo ensamblado en el escenario del microscopio.
3. Calibra la presión.
   1. Valida la estabilidad del rango de 0–200 kPa usando el gálibo.
      NOTA: Se utiliza un gas mixto que contiene 75% nitrógeno, 20% oxígeno y 5% dióxido de carbono para el cultivo celular HeLa. Se utiliza un gas mixto que contiene 80% de nitrógeno y 20% de oxígeno para el cultivo celular MDA-MB-231. El tipo de gas utilizado en el experimento de carga a presión puede sustituirse según el tipo de celda, el tipo de medio o los requisitos experimentales específicos. Ningún componente es específico del modelo, y las dimensiones del módulo de detección de presión y su tubería de entrada pueden seleccionarse según sea necesario.
4. Ajusta la presión objetivo (por ejemplo, 100 kPa) mediante el regulador digital de presión.
5. Inicia la imagen una vez que se alcance la presión objetivo.
6. Imagen
   1. Ajusta el escenario, confirma la zona de imagen y asegúrate de que las células estén enfocadas.
   2. Adquirir imágenes de fluorescencia de células teñidas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un objetivo de 20×, con los siguientes parámetros: tiempo de exposición de 400 ms, intervalos de 5 s en lapso de tiempo y una duración total de imagen de 10 min (filtro FITC: Ex/Em = 490/525 nm, corte = 515 nm).
   3. Imagen en condiciones no presurizadas durante 10 minutos para asegurar el correcto funcionamiento del sistema y obtener datos de señal base.
   4. Después de abrir la válvula de gas para cargar la presión, reajusta la altura del escenario para asegurarte de que las células están enfocadas y luego comienza a imaginar señales dinámicas de calcio.
   5. Selecciona la lente del objetivo en función del grosor inferior del plato de cultivo y la distancia de trabajo del objetivo. Elige el tiempo de exposición utilizado para permitir el seguimiento de las oscilaciones de la señal de calcio, evitando el fotoblanqueamiento excesivo y el daño por foto.
   6. Ajustar los parámetros según el tipo de sonda y los requisitos experimentales al observar otras señales dinámicas.

6. Resolución de problemas

1. Consulta la Tabla 1 para consejos sobre la resolución de problemas.

7. Análisis estadístico

1. Presenta todos los datos como media ± desviación estándar (DS). El software GraphPad Prism (EE. UU.) se utilizó para comparar los resultados entre dos grupos mediante el test t de Student no emparejado. Consideremos las diferencias como estadísticamente significativas cuando **p < 0,01, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001.

Results

Para verificar la función de imagen en tiempo real de este dispositivo de carga de presión hidrostática, se observó la dinámica de las señales de calcio en las células tumorales tras la aplicación de presión hidrostática. Las células confluentes MDA-MB-231, HeLa y A549 se sembraron en placas de cultivo de 35 mm para su uso posterior. Tras ser teñidas con una sonda de imagen de calcio, las células cultivadas sin suero fueron sometidas a una presión hidrostática de 40 kPa. Tras 10 minutos ...

Discussion

Este protocolo mostró un dispositivo de carga de presión universalmente adaptable que permitía la observación en tiempo real de la dinámica de la mecanotransducción bajo presión hidrostática sintonizable. Al integrar una cubierta de PMMA ópticamente transparente con una base de aluminio mecanizada con precisión, el sistema supera la limitación crítica de las cámaras convencionales, que solo pueden realizar análisis de puntos finales. Este dispositivo de carga por presión, que funciona co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiótico-Antimicótico (100 veces)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	15140122	Concentración del 1% en medio completo
Autoclave	Panasonic, Japón	MLS-3751-PC	Para esterilizar la base de aluminio y la junta de silicona
Gabinete de Bioseguridad	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	Armarios de seguridad biológica de la serie 1300 Clase A2 II y Tipo A2	Proporciona un entorno estéril para el manejo celular
Cal-520 AM, indicador de calcio perseñado por células	AAT Bioquest, EE. UU.	21131	Para la detección dinámica de la concentración de iones calcio en células vivas
Plato de cultivo celular (35 mm)	BIOFIL, China	TCD010035	Bandeja estándar de 35 mm usada para sembrar células
Base de la cámara (aluminio)	Quanyi, China	/	Diseño personalizado y Oslash; 56 mm, H 15 mm, ventana central y Oslash; 40 mm
Cubierta de la Cámara (PMMA)	Quanyi,  China	/	Diseño personalizado y Oslash; 56 mm, con 6 y multiplicadas; Agujeros roscados M3, puerto de gas Luer-lock
Incubadora CO2	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	HERAcell 3111	Mantiene condiciones de cultivo en 37&º; C con o sin 5% de CO2
HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)	Beyotime, China	C0219	Para lavar células antes y después de teñir
Línea celular HeLa	Centro de Recursos Celulares, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, CAMS/PUMC, China	CRM-CCL-2	Células humanas de cáncer cervical
Microscopio de fluorescencia invertida	Nikon, Japón	Eclipse Ti2	Para imagen de fluorescencia
L-15 Medium de Leibovitz	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	41300039	Para cultivo celular MDA-MB-231
Línea celular MDA-MB-231	Centro de Recursos Celulares, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, CAMS/PUMC, China	CRM-HTB-26	Células de cáncer de mama en humanos
Suero para terneros recién nacidos (NCS)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	16010142	10% de concentración en medio completo
Regulador de presión	Hongrun, China	DP20	Rango: 0-200 kPa
RPMI 1640 Medio	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	31800022	Para cultivo celular MDA-MB-231
Jeringuilla estéril (5 mL)	KDL, China	1101010198	Para inyectar medio o reactivos a través del puerto Luer-lock
Tripsina (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	2520056	Para disociar células adherentes para el paso