Protocolo computacional para cuantificar los desplazamientos transcriptómicos asociados a artesunatos en tejido cerebral experimental de malaria cerebral utilizando DESeq2

Oche Ambrose George; Adedoyin Igunnu; Joshua Oluwatope Adebayo

doi:10.3791/70870

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Artículo de método

Protocolo computacional para cuantificar los desplazamientos transcriptómicos asociados a artesunatos en tejido cerebral experimental de malaria cerebral utilizando DESeq2

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DOI:

10.3791/70870

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31 de julio de 2026

Oche Ambrose George^*¹ , Adedoyin Igunnu^*¹ , Joshua Oluwatope Adebayo^*¹

¹Department of Biochemistry, University of Ilorin

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La malaria cerebral experimental (ECM) causa neuroinflamación y disfunción de la barrera hematoencefálica. Utilizando GSE162535, este flujo de trabajo reproducible basado en R compara cerebros de control (CB), ECM (MB) y tratados con artesunato (AB), realizando análisis de QC, PCA y DESeq2. Identifica los cambios transcripcionales impulsados por la MCE y evalúa la modulación mediada por artesunatos de las vías inflamatorias y neurovasculares.

Resumen

La secuenciación de ARN (RNA-seq) se utiliza ampliamente para definir programas transcripcionales asociados a enfermedades, pero se requieren flujos de trabajo consistentes y de extremo a extremo para garantizar comparaciones reproducibles entre grupos experimentales y facilitar resultados biológicamente interpretables. Aquí se presenta un protocolo completo de análisis de ARN-seq para evaluar los cambios transcriptómicos cerebrales en la malaria cerebral experimental (ECM) y tras el tratamiento con artesunatos utilizando el conjunto público de datos GSE162535. El flujo de trabajo analiza tres grupos—cerebro de control (CB), cerebro ECM (MB) y cerebro ECM (AB) tratado con artesunatos—partiendo de una matriz de recuento HTSeq. Tras importar y formatear los conteos en bruto, el protocolo construye un conjunto de datos DESeq2 con CB como nivel de referencia, filtra genes con bajo conteo y realiza control de calidad mediante visualización del tamaño de la biblioteca, análisis de componentes principales y agrupamiento por distancia muestral. A continuación, se calcula la expresión diferencial para tres contrastes primarios (MB vs CB, AB vs MB, AB vs CB), aplicándose una contracción de cambio de multiplicado log2 para una estimación estable del tamaño del efecto. El protocolo exporta tablas completas y significativas de expresión diferencial, genera gráficos volcánicos y gráficos MA, y produce mapas de calor de los genes más variables y genes diferencialmente expresados mejor clasificados por contraste. Para apoyar la interpretación mecanicista, el flujo de trabajo incluye la extracción dirigida de marcadores inmunes (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, marcadores de activación microglial, genes BBB/endoteliales) y realiza análisis de Ontología Génica y enriquecimiento KEGG para conjuntos génicos significativamente regulados a la alza o a la baja. Este protocolo proporciona una plantilla reproducible para caracterizar programas transcripcionales neuroinflamatorios asociados a ECM y para cuantificar la modulación asociada a artesunatos de estas firmas.

Introducción

La malaria cerebral (MC) es una complicación neurológica potencialmente mortal de la infección por Plasmodium falciparum y sigue siendo un factor importante en la mortalidad por malaria a pesar de los avances en el manejo de casos. La MC se caracteriza por encefalopatía aguda, disfunción microvascular, activación endotelial y alteración de la barrera hematoencefálica (BBB), con neuroinflamación posterior que puede provocar el coma y, entre los supervivientes, secuelas neurocognitivas^{persistentes 1}. La patogénesis de la MC es multifactorial e implica respuestas inflamatorias del huésped que interactúan con factores derivados de parásitos y huéspedes en la interfaz neurovascular, lo que dificulta inferir mecanismos causales solo a partir de los criterios^{clínicos 1}.

Los modelos experimentales de malaria cerebral (MEC), especialmente la infección por Plasmodium berghei ANKA en ratones C57BL/6, proporcionan una plataforma manejable para examinar la inmunopatología específica del cerebro, la lesión de la BBB y la señalización neuroinflamatoria en un entorno^controlado ^2,3. Estos modelos se han utilizado para mapear respuestas celulares y moleculares a través de las fases de la enfermedad y para probar intervenciones adjuntas in vivo ^2,3. Sin embargo, la patobiología de la ECM es compleja y altamente dinámica, y los ensayos dirigidos pueden no realizar cambios coordinados a nivel de vía que ocurren en múltiples programas inmunológicos y neurovasculares.

El artesunato es la terapia parenteral de primera línea recomendada para la malaria grave y ha demostrado un beneficio sustancial en la supervivencia en comparación con la quinina en bases clave^{de evidencia 4}. Aunque la eliminación rápida de parásitos es fundamental para la eficacia del artesunato, los resultados neurológicos probablemente reflejan tanto la reducción parasitaria como la modulación secundaria de las vías inflamatorias y^{neurovasculares} ^1,4. Comprender cómo el tratamiento con artemisinina remodela los programas de transcripción cerebral durante la ECM puede, por tanto, proporcionar conocimientos mecanicistas que complementan los datos de eficacia clínica y puede identificar vías candidatas para estrategias neuroprotectoras adjuntas.

La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite un perfilado genómico no sesgado y generalizado de respuestas transcripcionales en enfermedades y estados de tratamiento, apoyando el análisis de expresión diferencial y la interpretación funcional posterior. Repositorios públicos como el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) proporcionan conjuntos de datos seleccionados adecuados para su reanálisis reproducible, incluyendo GSE162535, que contiene ARN-seq cerebral de cerebros de control (CB), cerebros ECM (MB) y cerebros ECM tratados con artesunato (AB)⁵. Para apoyar el descubrimiento reproducible a partir de estos conjuntos de datos, se requieren marcos estadísticos robustos para la expresión diferencial basada en el recuento, y se necesitan herramientas de enriquecimiento para interpretar los cambios a nivel génico en términos de vías y procesos biológicos.

Este estudio presenta un flujo de trabajo reproducible y de análisis de RNA-seq de extremo a extremo para tejido cerebral en grupos control (CB), malaria cerebral experimental (MB) y tratados con artesunato (AB). La novedad de este artículo radica en su pipeline estandarizado basado en DESeq2, que incorpora contrastes biológicamente relevantes predefinidos (MB vs CB, AB vs MB y AB vs CB), resultados rigurosos de control de calidad (evaluación del tamaño de la biblioteca, análisis de componentes principales y mapas de calor de distancia muestral), y una interpretación integrada posterior mediante Ontología de Genes (GO) y enriquecimiento de vías KEGG usando clusterProfiler ^6,7. Además, el flujo de trabajo implementa una interpretación estructurada basada en paneles inmunitarios, permitiendo la caracterización sistemática de respuestas transcripcionales neuroinflamatorias, inmunitarias y neurovasculares. Al combinar rigor estadístico, transparencia y resultados listos para publicación, este protocolo proporciona un marco robusto y reutilizable para analizar la desregulación transcriptómica asociada a la ECM y evaluar la modulación impulsada por el tratamiento en estudios preclínicos sobre la malaria.

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Protocolo

Este estudio utilizó datos de RNA-seq disponibles públicamente y no implicó nuevos experimentos en humanos o animales. Por lo tanto, no se requería aprobación ética ni consentimiento informado (Tabla de Materiales).

1. Preparar el entorno informático y la estructura de carpetas

Configurar hardware y sistema operativo
1. Utiliza un puesto de trabajo o portátil con al menos 8 GB de RAM (se recomienda 16 GB) y ≥10 GB de espacio libre en disco para descargas y salidas.
2. Utiliza Windows, macOS o Linux con permiso para instalar paquetes R y escribir archivos en el directorio de trabajo.
Instala el software necesario
1. Instala R (versión 4.2 o posterior). Instala RStudio Desktop (recomendado) para ejecutar el flujo de trabajo de forma interactiva y gestionar el directorio del proyecto.
Crea un directorio de proyecto y carpetas de salida
1. Crea una nueva carpeta para el análisis (por ejemplo, GSE162535_RNAseq_DESeq2). Configura esta carpeta como el directorio de trabajo R.
2. Crea las carpetas de salida exactamente así:
  1. Crear resultados/. Crear resultados/figura/. Crea resultados/tablas/.
Instalar paquetes R necesarios
1. Instala paquetes CRAN: tidyverse, pheatmap y RColorBrewer. Instalar paquetes Bioconductor: DESeq2, apeglm (opcional), clusterProfiler y org. Mm.eg.db.
2. Carga los paquetes necesarios al inicio del script: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db, y ggplot2. Establece una semilla de reproducibilidad ejecutando set.seed(123).
Aplicar salvaguardas de integridad y privacidad de los datos
1. Guarda los archivos descargados solo en el directorio del proyecto. Restringir el acceso al directorio del proyecto si el entorno contiene datos sensibles o con embargo. Graba las versiones del software exportando sessionInfo() a resultados/sessionInfo.txt al final del flujo de trabajo.
  NOTA: Este protocolo realiza un análisis in silico de datos públicos de recuento de RNA-seq y no implica manipular especímenes biológicos.

2. Obtener la matriz de recuento RNA-seq y definir los grupos experimentales

Descarga los archivos del conjunto de datos GEO para GSE162535
1. Descarga el archivo de conteo de HTSeq para GSE162535 desde GEO y guárdalo en el directorio del proyecto como GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. Verifica la integridad del archivo confirmando que el archivo se abre sin error usando gzfile() y read.delim().
Carga los conteos HTSeq en R
1. Importa la tabla de conteo comprimida usando read.delim(gzfile(...), encabezado = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). Inspecciona el objeto importado usando str(), head() y colnames() para confirmar que:
  1. La primera columna contiene identificadores de genes (por ejemplo, AccID). Las columnas restantes contienen recuentos a nivel de muestra.
Estandarizar los tipos de datos y resolver identificadores de genes duplicados
1. Define las columnas de muestra como todas las columnas excepto la columna identificador de gen (AccID). Obliga a todas las columnas de muestra a contar enteros. Colapsar identificadores de genes duplicados sumando los recuentos entre filas que comparten el mismo AccID.
2. Convierte la tabla plegada en un marco de datos estándar. Establece nombres de filas al identificador de gen y elimina la columna de identificador de la matriz de recuento.
Verificar la estructura de la matriz de recuento
1. Confirma que la matriz de recuento tiene 12 columnas de muestra. Confirma que los nombres de las columnas de ejemplo siguen el formato AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 y MB_1.MB_4.
2. Detener la ejecución si la matriz de conteo no tiene 12 columnas.
Crear y validar metadatos de muestra
1. Crea una tabla de metadatos de ejemplo (colData) que contenga las siguientes columnas:
  1. Ejemplo: identificadores únicos de muestra correspondientes a los nombres de columnas de la matriz de conteo. Grupo: condición biológica asignada a cada muestra.
2. Recupera las anotaciones de muestra correspondientes para el GSE162535 de datos del Gene Expression Omnibus (GEO).
3. Verifica la identidad de cada muestra utilizando la información de acceso GEO y los campos de anotación que describen la condición experimental. Mapea cada identificador de muestra en la matriz de recuento a su anotación GEO verificada.
4. Asignar cada muestra verificada a uno de los siguientes grupos: cerebro control (CB), cerebro experimental de malaria cerebral (MB) o cerebro experimental de malaria cerebral (AB) tratado con artesunato.
5. Organiza la tabla de metadatos de modo que el orden de la muestra coincida con el orden de las columnas de la matriz de conteo.
6. Compara los identificadores de muestra en la tabla de metadatos con la matriz de recuento para confirmar la correspondencia uno a uno. Codifica la variable de grupo como un factor con niveles ordenados como CB, MB y AB.
7. Establece CB como nivel de referencia para definir el grupo cerebral de control como referencia para el análisis de expresión diferencial posterior.
8. Establece los nombres de filas de la tabla de metadatos igual a los identificadores de muestra.
  NOTA:Las etiquetas de grupo no se asignaban únicamente en función del orden de muestras en la matriz de conteo. Las identidades de las muestras se verificaron de forma independiente utilizando metadatos GEO e información de acceso antes de alinearse con la matriz de expresión para mejorar la reproducibilidad y reducir el riesgo de mala clasificación de muestras.

3. Construir el conjunto de datos DESeq2 y realizar un control básico de calidad

Sanitizar la matriz de conteo
1. Sustituye los valores faltantes en la matriz de recuento por cero. Confirma la ausencia de valores ausentes usando resúmenes columnas is.na().
Crear el conjunto de datos DESeq2
1. Crea un DESeqDataSet usando DESeqDataSetFromMatrix() con: countData = counts; colData = sample_info; Diseño = ~ grupo.
Filtrar genes de bajo conteo
1. Eliminar genes con conteos totales <10 en todas las muestras usando dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. Registra el número de genes retenidos imprimiendo el resumen del objeto.
Evaluar el tamaño de las bibliotecas
1. Calcular los tamaños de las bibliotecas como las sumas de columnas de la matriz de recuento filtrada. Genera un gráfico de barras del tamaño de la biblioteca y guárdalo como resultados/figura/library_sizes.pdf.
2. Inspecciona el gráfico de tamaño de la biblioteca y confirma que ninguna muestra tiene una profundidad de secuenciación extrema inconsistente con el diseño del estudio.

4. Ejecutar DESeq2 y generar objetos de transformación para visualización

Ajusta el modelo DESeq2
1. Ejecuta modelado diferencial de expresión usando dds <- DESeq(dds). Conservar el objeto DDS ajustado para todas las extracciones posteriores de resultados.
Crear matrices de expresión transformadas
1. Calcular la transformación logarítmica regularizada usando rld <- rlog(dds, ciego = FALSO). Calcular la transformación estabilizadora de varianza usando vsd <- vst(dds, ciego = FALSO). Usa RLD y VSD para PCA, clustering y heatmaps.
  NOTA: Utiliza blind = FALSE para preservar la estructura de varianza dependiente del grupo.

5. Realizar control de calidad global usando PCA y agrupamiento de distancia entre muestras

Generar análisis de componentes principales (PCA)
1. Calcular PCA usando plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE). Extraer la varianza porcentual explicada para PC1 y PC2. Grafica PC1 vs PC2 usando ggplot2, etiquetando puntos por nombre de muestra y coloreando por grupo.
2. Guarda el gráfico PCA como resultados/figura/PCA_samples.pdf. Confirma que la biología se replica por grupo y que ninguna muestra se separa como un caso atípico.
Generar un mapa de distancia de muestra
1. Calcular las distancias de muestra por pares usando dist(t(assay(vsd))). Convierte el objeto de distancia en una matriz para su visualización. Crea una tabla de anotaciones de columnas que contenga el factor de grupo para cada muestra.
2. Grafica la matriz de distancias usando pheatmap() y guarda como resultados/figura/sample_distance_heatmap.pdf. Confirma que las muestras se agrupan principalmente por grupo.

6. Calcular la expresión diferencial para los tres contrastes principales

Define los contrastes
1. Define el efecto de la enfermedad como ECM frente a control: MB vs CB. Define el efecto del tratamiento dentro de la ECM como tratado con artesunato frente a ECM: AB vs MB. Define tratamiento frente a línea base como tratado con artesunato frente a control: AB vs CB.
Extraer resultados de DESeq2 con retroceso por cambio de pliegue log2
1. Extrae los resultados en bruto para cada contraste usando resultados (dds, contrast = c("grupo", grupoA, grupoB)). Shrink log2 fold cambia usando lfcShrink(dds, contrast = c("group", groupA, groupB), res = res, type = "normal").
2. Convierte los resultados en un marco de datos y almacena el identificador del gen como una columna llamada gene_id. Ordena los resultados por valor p nominal para informes estables.
3. Guarda cada tabla completa de resultados en resultados/tablas/ como:
  1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
    NOTA: Si la contracción falla debido a la configuración del encapsulado, se vuelve a ejecutar con un tipo de contracción alternativo soportado en la instalación local.
Definir umbrales de significancia y exportar conjuntos de genes significativos
1. Defina genes diferencialmente expresados (DEGs) usando: valor p ajustado (FDR) < 0,05 y cambio absoluto log2 multiplicado ≥ 1. Filtra cada contraste para excluir genes que falten valores p ajustados.
2. Exporta tablas DEG significativas a: resultados/tablas/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, resultados/tablas/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, resultados/tablas/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
Resume los recuentos de DEG por contraste
1. Calcular el número de genes significativos por contraste. Guarda la tabla resumen como resultados/tablas/DE_summary_counts.csv.

7. Generar gráficos de volcán para cada contraste.

Crea una función de trazo volcán.
1. Calcula -log10 (valor p ajustado) para cada gen. Clasifica cada gen como Arriba, Abajo o No Significativo usando los umbrales: FDR < 0,05 y |log2FC| ≥ 1.
2. Grafica log2FC (eje x) vs -log10(FDR) (eje y) usando ggplot2. Añade líneas umbral discontinuas en log2FC = ±1 y -log10(0,05).
Gráficos de volcanes de exportación
1. Guarda cada gráfico como PDF en resultados/figura/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf.
  NOTA: Utiliza límites de ejes consistentes entre contrastes para apoyar la comparación visual entre figuras.

8. Generar gráficos de MA para cada contraste

Exportar gráficos de MA a un solo PDF.
1. Abre un dispositivo PDF llamado results/fig/MA_plots.pdf. Grafica los gráficos MA para cada objeto de resultado DESeq2 en bruto usando plotMA(). Etiqueta cada parcela con el nombre de contraste. Cierra el dispositivo PDF.

9. Generar mapas de calor de expresión para genes de DE específicos de variabilidad global y de contraste.

Grafica los genes de la variable superior en todas las muestras.
1. Calcular la varianza fila a fila entre muestras a partir de la matriz de ensayo vsd. Selecciona los 100 genes más variables principales. Centra cada gen en el centro medio entre muestras.
2. Genera un mapa de calor usando pheatmap() con anotaciones de grupos muestrales. Guarda la figura como resultados/figura/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
Grafica los genes diferencialmente expresados por primera vez para cada contraste.
1. Selecciona los 50 genes principales ajustando el valor p para cada contraste. Extrae su matriz de expresión de la DSV y el centro medio por gen. Genera un mapa de calor para cada contraste y guarda como:
2. resultados/fig/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, resultados/fig/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, resultados/fig/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
  NOTA: Aumenta el ancho y la altura del PDF si las etiquetas de fila están activadas.

10. Realizar un análisis dirigido de marcadores inmunitarios.

Resume genes inmunitarios seleccionados a través de los contrastes.
1. Define un conjunto de marcadores inmunitarios: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21 e Icam1. Extrae log2FC, valor p y valor p ajustado para estos genes de cada tabla de resultados de contraste.
2. Fusiona los tres resúmenes de contraste por identificador genético. Guarda la tabla fusionada como resultados/tablas/immune_genes_summary.csv.
Genera un mapa de calor de marcadores inmunes (rlog).
1. Identificar los genes inmunitarios presentes en la matriz de ensayo transformada. Extrae la matriz de expresión rlog para los genes inmunes actuales.
2. Expresión del centro medio por gen. Genera y guarda el mapa de calor en resultados/figuras/heatmap_immune_genes.pdf.

11. Realizar análisis ampliado del panel inmunitario por categoría funcional

Define los paneles inmunes.
1. Definan paneles de marcadores inmunitarios por categoría, incluyendo: citocinas proinflamatorias y genes de respuesta al interferón, genes antiinflamatorios y reguladores, quimioquinas, marcadores de activación microglial, marcadores de astrocitos, marcadores de BBB y activación endotelial, marcadores de células T y marcadores de agotamiento, marcadores de monocitos/macrófagos, genes de la vía del complemento y genes de estrés oxidativo y muerte celular.
Extrae los resultados del panel inmunológico de DE para cada contraste.
1. Crea una tabla de mapeo desde símbolos génicos hasta categorías inmunes. Filtra cada tabla de resultados de contraste para los genes del panel inmunitario. Une la asignación de categorías a cada tabla de resultados filtrada.
2. Concatena las tres tablas inmunitarias específicas de contraste en una sola tabla. Guarda la tabla combinada como resultados/tablas/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. Genera un mapa de calor de expresión del panel inmunitario clasificado.
3. Identificar los genes del panel inmunitario presentes en la matriz de ensayos de la rld. Añade etiquetas de categoría a los nombres de las filas para preservar la clasificación de los paneles en la figura. Grafica el mapa de calor de rlog con anotaciones de grupos de muestra.
Guarda las salidas.
1. Guardar como: resultados/figura/heatmap_immune_panels_all.pdf, resultados/figura/heatmap_immune_panels_all.png

12. Generar gráficos de volcán con superposición inmune

Crea parcelas volcánicas con superposición inmunitaria.
1. Marca los genes como inmunes o no inmunes uniéndote al panel inmunitario que corresponde a cada tabla de resultados de contraste. Representa todos los genes no inmunes como puntos de fondo gris. Traza genes inmunes coloreados por categoría inmune en primer plano. Añadir líneas umbral en log2FC = ±1 y -log10(0,05).
Exporta parcelas de volcán con superposición inmune y inmunaria.
1. Guarda los gráficos de volcán de superposición inmune a MB vs CB como:
  1. resultados/figura/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
  2. resultados/figura/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
2. Guarda los gráficos de volcán de superposición inmune AB vs MB como:
  1. resultados/figura/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
  2. resultados/figura/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
    NOTA: Los paneles génicos inmunitarios seleccionados se predefinieron y agruparon en categorías funcionales; la lista completa de símbolos génicos con anotaciones se proporciona en la Tabla Suplementaria S1. Esta tabla garantiza transparencia y reproducibilidad, permitiendo la reutilización y validación directa de análisis basados en paneles entre estudios.

13. Realizar análisis de enriquecimiento funcional (GO y KEGG)

Definir conjuntos génicos para el enriquecimiento
1. Para cada contraste (MB vs CB y AB vs MB), extrae genes significativamente diferencialmente expresados (DEGs) usando un umbral ajustado de p-value de < 0,05 y un umbral absoluto log₂ de cambio de pliegues ≥ 1.
2. Dividir los DEGs en genes regulados al alza (log₂FC > 0) y genes regulados a la baja (log₂FC < 0).
Definir el conjunto génico de fondo (universo)
1. Utiliza todos los genes retenidos tras el filtrado de recuento en el conjunto de datos DESeq2 como universo de fondo. Extrae símbolos génicos del objeto DESeq2 filtrado. Convierte símbolos genéticos de fondo en identificadores Entrez usando la función bitr() con org. Mm.eg.db.
  NOTA: El uso de un conjunto de genes de fondo consistente garantiza resultados de enriquecimiento imparciales.
Mapear identificadores génicos para el enriquecimiento
1. Convierte los símbolos génicos de cada conjunto DEG a identificadores Entrez usando bitr(). Conservar solo genes mapeados correctamente para el enriquecimiento KEGG. Saltarse el análisis de enriquecimiento para un conjunto génico si ningún gen está mapeado correctamente.
  NOTA: El enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) utiliza símbolos génicos, mientras que el enriquecimiento KEGG requiere identificadores Entrez.
Realizar enriquecimiento de ontología génica (GO) (Proceso Biológico)
1. Ejecuta enriquecimiento GO usando enrichGO() con OrgDb = org. Mm.eg.db. Set keyType = "SYMBOL" y ontología (ont) = "BP". Especifica el universo como todos los símbolos génicos filtrados del conjunto de datos DESeq2.
2. Utiliza pAdajustMethod = "BH" para la corrección con múltiples pruebas. Aplicar umbrales de significancia de pvalueCutoff = 0,05 y qvalueCutoff = 0,05. Restringir los tamaños del conjunto génico usando minGSSize = 10 y maxGSSize = 500.
3. Exporta los resultados de enriquecimiento de GO a los resultados/tablas/directorio. Genera barras gráficas de términos de GO enriquecidos y guarda en resultados/figura/.
Realizar el enriquecimiento de vías KEGG
1. Ejecuta el enriquecimiento KEGG usando enrichKEGG() con organismo = "mmu". Proporcionar identificadores Entrez de conjuntos DEG como genes de entrada. Usa el fondo de Entrez mapeado como el universo.
2. Apply pAdajustMethod = "BH". Utiliza los umbrales de significancia de pvalorCorte = 0,05 y qvalorCorte = 0,05. Restringir los tamaños del conjunto génico usando minGSSize = 10 y maxGSSize = 500.
3. Exporta las tablas de enriquecimiento de KEGG a resultados/tablas/. Genera barras de vías enriquecidas de KEGG y guarda según resultados/figura/.
  NOTA: El enriquecimiento KEGG puede no devolver resultados si el mapeo génico es insuficiente; Estos casos se gestionan sin interrumpir el flujo de trabajo.

14. Realizar análisis de enriquecimiento solo inmune (módulo opcional)

Construir conjuntos génicos específicos del sistema inmunitario
1. Define los genes del panel inmunitario basándose en categorías funcionales seleccionadas. Intersectan las listas DEG con los genes del panel inmunitario. Divide los DEG específicos del sistema inmunitario en conjuntos regulados al alza y a la baja para cada contraste.
Realizar enriquecimiento en conjuntos genéticos específicos del sistema inmunológico.
1. Aplicar los mismos procedimientos de enriquecimiento GO y KEGG descritos en la Sección 13. Usa el mismo universo de fondo y ajustes de parámetros. Guarda las salidas usando nombres de archivo que contienen la etiqueta "inmune" para distinguirlas de los resultados de enriquecimiento global.

15. Generar gráficos de puntos de enriquecimiento (módulo opcional)

Resultados de enriquecimiento de carga.
1. Importa tablas de enriquecimiento GO o KEGG desde los resultados/tablas/directorio.
Transformar métricas de enriquecimiento.
1. Convierte los valores de GeneRatio de formatos fraccionarios (x/y) a proporciones numéricas. Calcular −log₁₀ (valores p ajustados) para visualización.
Genera gráficos de puntos.
1. Traza la proporción génica en el eje x y las descripciones de términos enriquecidas en el eje y. Escala el tamaño del punto por recuento de genes y el color por −log₁₀ (valor p ajustado).
2. Selecciona los términos más enriquecidos basándose en la clasificación ajustada del valor p. Guarda los gráficos de puntos como archivos PDF y PNG en el directorio de resultados/figura/.

16. Guardar la información de la sesión y finalizar la ejecución

Exportar información de la sesión.
1. Guarda la salida de sessionInfo() en resultados/sessionInfo.txt para documentar la versión R y las versiones del paquete.
Confirmar la finalización exitosa
1. Confirma que el flujo de trabajo generado: Figuras en resultados/figura/, tablas en resultados/tablas/.
2. Confirma que existen las tres salidas principales de contraste y no están vacías: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

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Resultados

Evaluación de la calidad de los datos y estructura transcriptómica global

Los datos de ARN-seq de 12 muestras cerebrales (CB, MB, AB; n = 4 por grupo) se procesaron utilizando el flujo de trabajo estandarizado. Tras filtrar genes de bajo conteo (≥10 conteos totales), el conjunto de datos se mantuvo para análisis posteriores. El análisis de componentes principales (PCA) de los recuentos transformados en rlog demostró la separación de muestras p...

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Discusión

Este estudio presenta un flujo de trabajo reproducible basado en DESeq2 para el análisis de datos masivos de ARN-seq a través de contrastes biológicos predefinidos. El protocolo integra preprocesamiento estandarizado, asignación verificada de metadatos, normalización, pruebas de expresión diferencial y salidas estructuradas posteriores, permitiendo una generación consistente y transparente de resultados transcriptómicos. Al definir explícitamente pasos analíticos y parámetros, el flujo d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses en competencia.

Agradecimientos

Los autores no tienen reconocimientos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
clusterProfiler (paquete R)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	Análisis de enriquecimiento funcional (rutas GO y KEGG)
DESeq2 (paquete R)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	Análisis de expresión diferencial de datos de RNA-seq basados en conteo
ggplot2 (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_014601	Visualización de gráficos PCA, gráficos volcánico y figuras resumen
GitHub (opcional)	GitHub Inc.	RRID:SCR_002630	Control de versiones y compartición de scripts reproducibles
HTSeq-count RNA-seq dataset (GSE162535)	NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)	RRID:SCR_005012	Matriz de conteo RNA-seq masiva utilizada como entrada para el análisis
matrixStats (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_016361	Cálculo eficiente de estadísticas de fila/columna (por ejemplo, varianza)
openxlsx (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_019215	Exportación de tablas de resultados al formato Excel
Sistema operativo	Microsoft / Apple / Linux	N/A	Soporte para Windows 10+, macOS o Linux
org.Mm.eg.db (paquete R)	Bioconductor	RRID:SCR_002815	Base de datos de anotación de genes de ratón para asignación de ID de genes
Visor de PDF	Cualquiera	N/A	Visualización de figuras de salida (PCA, mapas de calor, gráficos volcánico)
Computadora personal o estación de trabajo	Cualquiera	N/A	Se recomienda un mínimo de 16 GB de RAM para análisis de RNA-seq
pheatmap (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_016418	Visualización de mapas de calor de expresión génica y agrupamiento
R Statistical Software (versión ≥ 4.2)	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	Entorno computacional central para todos los análisis de RNA-seq
RColorBrewer (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_015742	Paletas de colores para mapas de calor y gráficos
RStudio Desktop	Posit Software	RRID:SCR_000432	Entorno de desarrollo integrado (IDE) para script y reproducibilidad
Archivo de metadatos de muestra (formato CSV)	Generado / Anotaciones GEO	N/A	Anotación de muestras curadas que vinculan muestras con grupos CB, MB y AB
stringr (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_019195	Procesamiento de cadenas para visualización y formato de enriquecimiento
tibble (paquete R)	CRAN	RRID:SCR_019186	Manejo de marcos de datos y estructuras de datos ordenadas
tidyverse (paquete de R suite)	CRAN	RRID:SCR_019186	Manipulación, transformación y visualización de datos

Referencias

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