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Todos los experimentos que involucraron Caenorhabditis elegans se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de organismos de laboratorio en la Universidad Normal de Pekín.
Figura 1: Visión general del marcaje endógeno fluorescente mediado por CRISPR/Cas9 en C. elegans. Flujo de trabajo esquemático que ilustra las principales etapas de la generación y validación endógena de knock-in fluorescente. En la fase de diseño y construcción, se selecciona un gen objetivo enriquecido con la línea germinal y un sitio de inserción, se utiliza pDD162 como plásmido CRISPR/Cas9 para la expresión de ARN guía y Cas9, y pPD95.75 se utiliza como columna vertebral donante en la que se subclonan la etiqueta fluorescente (por ejemplo, GFP) y los brazos de homología izquierdo y derecho. En la fase de microinyección, la mezcla de inyección CRISPR/Cas9 (incluyendo el plásmido de ARNG/Cas9, la plantilla donante y los marcadores de coinyección) se administra en la gónada de hermafroditas jóvenes adultos, seguida de la recuperación en placas con semillas. En la fase de validación, se seleccionan descendientes positivos para el genotipado posterior, incluyendo la identificación por PCR de eventos knock-in y la confirmación mediante secuenciación de ADN, y posteriormente se examinan las líneas knock-in exitosas mediante microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión germinal y la localización subcelular de la proteína marcada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
1. Seleccionar un gen objetivo enriquecido en línea germinal
- Identificar genes candidatos con expresión predominante en las gónadas o células germinales utilizando bases de datos públicas y literatura publicada.
- Selecciona un lugar de etiquetado adecuado en función de las características proteicas. Registrar la isoforma seleccionada y la posición de inserción de la etiqueta para el diseño posterior de ARN guía y plantilla donante (Figura 1).
2. Diseñar el ARN guía y la plantilla de donante
- Identificar una secuencia de ARN guía (gRNA) de 20 nt aguas arriba de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM; NGG), la secuencia requerida para el reconocimiento Cas9, y posicionarla lo más cerca posible del lugar de inserción de etiquetas previsto.
- Evalúa los gRNAs candidatos utilizando una herramienta de diseño en línea (por ejemplo, la herramienta de diseño IDT CRISPR) seleccionando el genoma de C. elegans. Selecciona una guía con una alta eficiencia de corte en el objetivo previsto y sin sitios de alto riesgo y predicho fuera de objetivo.
- Clona la secuencia de gRNA en la región entre el promotor de U6 y el andamiaje de gRNA dentro de la columna vertebral del plásmido de expresión CRISPR.
NOTA: Cebadores de diseño que incorporan la secuencia de gRNA como voladizos. Realizar amplificación por PCR seguida de ensamblaje basado en recombinación homóloga, un método de clonación independiente de la ligadura que elimina la digestión enzimática de restricción y permite la clonación en un solo paso directamente en el vectorde expresión 15.
- Confirma la inserción correcta mediante secuenciación de Sanger.
- Construir el plásmido donante usando una etiqueta fluorescente flanqueada por brazos de homología izquierdo de aproximadamente 1.000 pb y brazos de homología derecha de 1.000 pb derivados del locus objetivo.
NOTA: Amplificar los brazos de homología a partir del ADN genómico N2 preparado como lisato de gusano utilizando digestión de la proteinasa K. Los imprimadores de diseño con 15–20 pb se superponen con la etiqueta linealizada vectorial y fluorescente. Ensamblar los brazos de homología y marcar en la columna vertebral mediante recombinación homóloga en una sola reacción. Inserta la etiqueta fluorescente inmediatamente después del codón de inicio ATG para el marcado N-terminal o antes del codón de parada para el marcado C-terminal. Incluye una secuencia de enlace entre el gen objetivo y la etiqueta fluorescente para mantener el plegamiento y la función adecuada de proteínas. Utiliza el enlazador para reducir la interferencia estérica entre los socios de fusión y asegúrate de que tanto el enlazador como la etiqueta se inserten en el marco con la secuencia codificante. Seleccione cuidadosamente el sitio de inserción para evitar alterar dominios funcionales conocidos o predichos, péptidos señales o regiones transmembrana (Archivo Suplementario 1).
- Introducir sustituciones silenciosas en la secuencia de plantilla homóloga donante para interrumpir la secuencia de PAM o de unión guía sin alterar la secuencia proteica y evitar que Cas9 se vuelva a cortar tras la integración.
NOTA: Incorporar mutaciones puntuales sinónimas en cebadores usados para amplificación del brazo de homología, dirigiéndose a codones dentro de la región PAM.
- Confirmar la integridad de la secuencia donante tanto en brazos de homología como en uniones de etiquetas mediante secuenciación de Sanger.
NOTA: Almacenar plásmidos verificados a −20 °C para almacenamiento a corto plazo o a −80 °C para almacenamiento a largo plazo.
3. Prepara la mezcla de inyección
- Ensamblar la mezcla de inyección combinando el plásmido de expresión CRISPR, el plásmido donante (construido a partir de pPD95.75) y marcadores de coinyección en ddH₂O estéril hasta un volumen final de 10 μL a las concentraciones indicadas en la Tabla 1.
NOTA: Optimizar las concentraciones empíricamente para equilibrar la legibilidad de los marcadores, la recuperación de candidatos y la supervivencia tras la inyección.
- Centrifugar la mezcla de inyección a 10.000 × g. durante 10–20 minutos para pelletar material particulado y evitar obstrucciones del capilar de microinyección.
| Componente | Función | Concentración de trabajo (ng/μL) |
| pDD162 | Plásmido CRISPR/Cas9 (expresión de Cas9 y gRNA) | 50-100 |
| Plásmido donante (columna vertebral pPD95.75) | Plantilla donante HDR que lleva la etiqueta fluorescente flanqueada por brazos de homología de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marcador de coinyección (fenotipo de rodillo) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marcador de coinyección (expresión GFP) | 5-10 |
| Estéril ddH2O | Llevar al volumen final | – |
Tabla 1: Composición de la mezcla de inyección y funciones de plásmidos. La mezcla de inyección contiene plásmidos de expresión CRISPR, plásmido donante, pRF4 y pPD122.11 a las concentraciones indicadas, para un volumen total de 10 μL.
4. Carga y prepara la aguja de inyección
- Extrae capilares de vidrio en agujas de microinyección usando un extractor de agujas configurado para producir una estrecha conicidad con una punta afilada adecuada para la inyección gonadal.
NOTA: Optimiza empíricamente los parámetros del puller. Ejemplos de parámetros iniciales: calor = 540, tracción = 20, velocidad = 100.
PRECAUCIÓN: Maneja cuidadosamente las agujas tiradas para evitar lesiones por punzación. Utiliza pinzas al manipular agujas y desecha las agujas usadas en un recipiente para objetos punzantes.
- Calienta una micropipeta y rompe la capa en dos para crear una herramienta de carga.
NOTA: Las puntas de carga comerciales pueden usarse como alternativa.
- Coloca una bombilla aspiradora de goma en el extremo ancho de la micropipeta microcapilar acortada.
- Aspira aproximadamente 1 μL de mezclas de inyección clarificada con sobrenadante en la cargadora.
NOTA: El volumen exacto no es crítico. Asegúrate de que la solución llene la punta de la aguja.
- Introduce el cargador en la parte trasera de la aguja de inyección y dispensa suavemente la mezcla de inyección.
- Coloca la aguja cargada horizontalmente durante 10 minutos para permitir que la solución se asiente hacia la punta y confirmar una columna continua.
- Monta la aguja en el microscopio de inyección y enfoca la punta usando óptica de campo claro.
- Abre la punta de la aguja tocándola suavemente con el borde de una capa de cobertura en aceite de halocarbono y prueba el flujo.
NOTA: Ajuste la presión de inyección (30–80 psi) para generar una burbuja aproximadamente igual al diámetro de la gónada dentro de 1s 16.
5. Prepara los gusanos para la inyección
NOTA: Preparar las placas de Medio de Crecimiento Nematodo (NGM) y el buffer M9 como se ha descritoanteriormente 17. Mantener gusanos en placas con Escherichia coli OP50 (en adelante OP50) y realizar inyecciones en el fondo de N2.
- Selecciona hermafroditas L4 de una placa sana e incuba a 20 °C durante 10 horas para obtener adultos jóvenes con líneas germinales bien desarrolladas.
- Transfiere los gusanos a una placa sin sembrar para reducir la transmisión bacteriana.
- Prepara una almohadilla seca de agarosa al 2% sobre una lámina de vidrio y aplica una gota de aceite de halocarbono.
- Transfiere un gusano a la almohadilla de agarosa usando un rascapes.
- Inmoviliza el gusano y orienta la gónada para la inyección.
PRECAUCIÓN: Complete las inyecciones en un plazo de 20–30 minutos para evitar la desecación.
6. Realizar microinyección gonadal
Figura 2: Localización del sincito gonada distal para microinyección en adultos jóvenes de C. elegans hermafroditas. (A) Imagen de campo claro de bajo aumento de un hermafrodita adulto joven montado. Ambos brazos gónadas son visibles; El lugar de inyección se indica para un brazo (flecha) como ejemplo representativo. La región encapsulada marca el área mostrada con mayor aumento en el panel B. (B) Vista DIC de mayor aumento de la gónada distal correspondiente a la región encapsulada en el panel A. La flecha indica la posición de inyección dentro del sincicio gonadal distal, donde se administra la mezcla de inyección. Barras de escala: 100 μm (A) y 20 μm (B). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
- Localiza un gusano inmovilizado e identifica la gónada usando un objetivo de baja aumentación.
- Coloca la aguja usando controles de micromanipuladores.
- Orienta el gusano en un ángulo de 20–40° respecto a la aguja.
- Céntrate en la línea germinal distal usando un aumento más alto.
- Avanza el gusano hacia la aguja y coloca la punta dentro del sincicio gonadal (Figura 2).
- Inyecta la solución y confirma la administración mediante la hinchazón visible de la gónada.
NOTA: Optimizar la presión de inyección (30–80 psi), la presión de compensación (0,1–0,5 psi) y la duración de la inyección (0,1–0,3 s).
PRECAUCIÓN: Una presión o volumen excesivo puede causar la ruptura de los gusanos.
- Retira la aguja y vuelve a colocarla para las inyecciones posteriores.
NOTA: Realizar una inyección unilateral para maximizar la supervivencia, o una inyección bilateral para aumentar la eficiencia de la edición.
- Añade un buffer M9 para liberar gusanos y transfiere cada gusano a una placa de recuperación individual.
- Repetir las inyecciones para 20–25 gusanos.
NOTA: Cambia la aguja si se obstruye o se daña.
- Incubar gusanos inyectados a 20 °C durante 2–3 días para permitir la recuperación.
7. Seleccionar candidatos a F1 para identificar las líneas de knock-in positivo
- Examinar la progenie F1 para detectar marcadores de coinyección y seleccionar animales positivos para marcadores.
NOTA: En la Tabla Suplementaria 1 se proporcionan ejemplos de marcadores alternativos de coinyección fluorescente con diferentes especificidades tisulares y propiedades espectrales.
NOTA: Selecciona animales que expresen ambos marcadores para mayor fiabilidad. Prioriza las crías con alta frecuencia de marcadores ("prole jackpot").
- Transfiere cada gusano F1 a una placa individual y permite la puesta de huevos durante 1–2 días.
- Lisa cada gusano F1 en un tampón de proteinasa K para preparar plantillas de PCR.
NOTA: Almacenar los lisados a −80 °C si no se procesan inmediatamente.
- Realiza PCR de unión usando un cebador genómico fuera del brazo de homología y un cebador interno de etiquetas.
NOTA: Conservar las placas correspondientes de animales F1 positivos para PCR.
8. Analizar la progenie F2 para aislar líneas homocigotas de knock-in y confirmar la integración
- Aísla la descendencia de F2 de líneas F1 positivas para PCR en placas individuales.
- Permitir que los gusanos F2 produzcan descendencia y lisar adultos para el genotipado.
NOTA: Conservar los lisados a −20 °C si es necesario.
- Realizar PCR utilizando cebadores flanqueando los brazos de homología para distinguir alelos tipo salvaje y knock-in por tamaño del producto.
- Confirma la integración correcta mediante secuenciación Sanger en ambas uniones de inserción.
- Verifica la expresión y localización de la fluorescencia de la línea germinal utilizando microscopía de fluorescencia.
- Ampliar las líneas homocigotas confirmadas y mantener las existencias.
NOTA: Líneas validadas por criopreservación para almacenamiento a largo plazo.