Un flujo de trabajo de microinyección CRISPR/Cas9 para el marcaje fluorescente endógeno en la línea germinal de Caenorhabditis elegans para obtener líneas homocigotas de knock-in para análisis in vivo de localización de proteínas.
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Artículo de método
Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans
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Resumen
Resumen
La localización de proteínas en la línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) es fundamental para interpretar la función génica durante la gametogénesis, aunque los enfoques transgénicos convencionales suelen producir expresión variable y pueden ser silenciados en las células germinales. Aquí se describe un flujo de trabajo práctico de CRISPR/Cas9 que inserta una etiqueta fluorescente en un locus endógeno, lo que permite la generación de alelos knock-in estables que informan de la distribución proteica bajo regulación nativa. El protocolo cubre las etapas clave del procedimiento: seleccionar una estrategia de etiquetado adecuada para la proteína objetivo, administrar reactivos CRISPR mediante microinyección gonadal en hermafroditas jóvenes adultos, y recuperar animales inyectados para su cribado. Los candidatos knock-in se identifican mediante genotipado basado en PCR a lo largo de dos generaciones para aislar gusanos homocigotos y verificar el alelo editado. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para verificar la fluorescencia de la línea germinal y evaluar la localización subcelular in vivo. El flujo de trabajo está diseñado para ser reproducible y ampliamente aplicable a genes enriquecidos en la línea germinal, proporcionando una vía sencilla para establecer cepas homocigotas marcadas para análisis de desarrollo y biología celular.
Introducción
Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo bien establecido para estudiar el desarrollo reproductivo y la gametogénesis, debido a su ciclo vital corto, cuerpo transparente y alta traabilidadgenética 1. C. elegans existe principalmente como hermafroditas autofecundantes, cuya gónada primero sufre espermatogénesis y luego cambia a oogénesis. Este modo reproductor simplifica el mantenimiento de la cepa y facilita la obtención de líneashomocigotas 2. La transcriptómica espacial reciente ha ampliado sustancialmente la lista de genes enriquecidos en la gónada y ha revelado patrones de expresión específicos del sexo en todo el sistema reproductor en C. elegans3. Más recientemente, la secuenciación de ARN unicelular ha permitido la reconstrucción de trayectorias de desarrollo de células germinales y la inferencia de redes reguladoras génicas que rigen laespermatogénesis 4. En conjunto, estos conjuntos de datos generan listas de candidatos enriquecedoras, pero la interpretación funcional a menudo requiere observar el comportamiento de las proteínas in vivo, concretamente, definir cuándo y dónde se localizan las proteínas correspondientes y cómo cambian sus patrones a lo largo del desarrollo de la línea germinal.
La transgénesis convencional en C. elegans suele depender de la microinyección gonadal de ADN plasmid, que genera fácilmente matrices extracromosómicas de copiamúltiple 5. Sin embargo, en la línea germinal, estos arreglos suelen estar fuertemente silenciados, un mecanismo que se cree ayuda a mantener la integridad de la línea germinal al restringir la expresión del ADN repetitivo, preservando así la función germinal y la estabilidad de la información genética a lo largo de lasgeneraciones 6 y 7. Como resultado, los constructos de expresión transgénica que se expresan fácilmente en tejidos somáticos pueden ser débiles o inconsistentes en la línea germinal. Incluso cuando la expresión es detectable, los efectos del número de copias y los elementos reguladores modificados pueden alterar la dosis y el momento de la proteína, lo que puede confundir conclusiones sobre la localización y dinámica nativas. Para abordar estas limitaciones, el bombardeo de micropartículas y la inserción de copia única mediada por Mos1 (MosSCI) se utilizan ampliamente para generar líneas transgénicas integradas de baja o simplecopia 8, 9 y 10. Estos enfoques pueden mejorar la expresión en la línea germinal, pero difieren en coste, rendimiento y en la eficacia con la que reproducen la regulación endógena. La edición genómica CRISPR/Cas9 ofrece una vía más directa insertando una etiqueta fluorescente en el locus endógeno mediante reparación dirigida por homología, generando alelos knock-in estables que informan de localización y dinámica de proteínas bajo control regulatorionativo 11,12,13,14.
Aquí se describe un flujo de trabajo práctico para el marcaje fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 en C. elegans , aplicado a genes seleccionados en función de patrones de expresión enriquecidos por la línea germinal reportados. El protocolo describe la selección de objetivos, el diseño de ARN de plantilla y guía de donantes, la microinyección gonadal y el cribado posterior para aislar líneas knock-in homocigotas, seguido de la validación mediante genotipado. Este enfoque es ampliamente aplicable a genes expresados por la línea germinal a través de las etapas de desarrollo y permite análisis cuantitativos de la localización y dinámica de proteínas in vivo. Este flujo de trabajo proporciona una estrategia práctica para marcar genes expresados en la línea germinal y para analizar la localización y dinámica de proteínas in vivo bajo control regulatorio nativo.
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Protocolo
Todos los experimentos que involucraron Caenorhabditis elegans se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de organismos de laboratorio en la Universidad Normal de Pekín.
Figura 1: Visión general del marcaje endógeno fluorescente mediado por CRISPR/Cas9 en C. elegans. Flujo de trabajo esquemático que ilustra las principales etapas de la generación y validación endógena de knock-in fluorescente. En la fase de diseño y construcción, se selecciona un gen objetivo enriquecido con la línea germinal y un sitio de inserción, se utiliza pDD162 como plásmido CRISPR/Cas9 para la expresión de ARN guía y Cas9, y pPD95.75 se utiliza como columna vertebral donante en la que se subclonan la etiqueta fluorescente (por ejemplo, GFP) y los brazos de homología izquierdo y derecho. En la fase de microinyección, la mezcla de inyección CRISPR/Cas9 (incluyendo el plásmido de ARNG/Cas9, la plantilla donante y los marcadores de coinyección) se administra en la gónada de hermafroditas jóvenes adultos, seguida de la recuperación en placas con semillas. En la fase de validación, se seleccionan descendientes positivos para el genotipado posterior, incluyendo la identificación por PCR de eventos knock-in y la confirmación mediante secuenciación de ADN, y posteriormente se examinan las líneas knock-in exitosas mediante microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión germinal y la localización subcelular de la proteína marcada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
1. Seleccionar un gen objetivo enriquecido en línea germinal
- Identificar genes candidatos con expresión predominante en las gónadas o células germinales utilizando bases de datos públicas y literatura publicada.
- Selecciona un lugar de etiquetado adecuado en función de las características proteicas. Registrar la isoforma seleccionada y la posición de inserción de la etiqueta para el diseño posterior de ARN guía y plantilla donante (Figura 1).
2. Diseñar el ARN guía y la plantilla de donante
- Identificar una secuencia de ARN guía (gRNA) de 20 nt aguas arriba de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM; NGG), la secuencia requerida para el reconocimiento Cas9, y posicionarla lo más cerca posible del lugar de inserción de etiquetas previsto.
- Evalúa los gRNAs candidatos utilizando una herramienta de diseño en línea (por ejemplo, la herramienta de diseño IDT CRISPR) seleccionando el genoma de C. elegans. Selecciona una guía con una alta eficiencia de corte en el objetivo previsto y sin sitios de alto riesgo y predicho fuera de objetivo.
- Clona la secuencia de gRNA en la región entre el promotor de U6 y el andamiaje de gRNA dentro de la columna vertebral del plásmido de expresión CRISPR.
NOTA: Cebadores de diseño que incorporan la secuencia de gRNA como voladizos. Realizar amplificación por PCR seguida de ensamblaje basado en recombinación homóloga, un método de clonación independiente de la ligadura que elimina la digestión enzimática de restricción y permite la clonación en un solo paso directamente en el vectorde expresión 15. - Confirma la inserción correcta mediante secuenciación de Sanger.
- Construir el plásmido donante usando una etiqueta fluorescente flanqueada por brazos de homología izquierdo de aproximadamente 1.000 pb y brazos de homología derecha de 1.000 pb derivados del locus objetivo.
NOTA: Amplificar los brazos de homología a partir del ADN genómico N2 preparado como lisato de gusano utilizando digestión de la proteinasa K. Los imprimadores de diseño con 15–20 pb se superponen con la etiqueta linealizada vectorial y fluorescente. Ensamblar los brazos de homología y marcar en la columna vertebral mediante recombinación homóloga en una sola reacción. Inserta la etiqueta fluorescente inmediatamente después del codón de inicio ATG para el marcado N-terminal o antes del codón de parada para el marcado C-terminal. Incluye una secuencia de enlace entre el gen objetivo y la etiqueta fluorescente para mantener el plegamiento y la función adecuada de proteínas. Utiliza el enlazador para reducir la interferencia estérica entre los socios de fusión y asegúrate de que tanto el enlazador como la etiqueta se inserten en el marco con la secuencia codificante. Seleccione cuidadosamente el sitio de inserción para evitar alterar dominios funcionales conocidos o predichos, péptidos señales o regiones transmembrana (Archivo Suplementario 1). - Introducir sustituciones silenciosas en la secuencia de plantilla homóloga donante para interrumpir la secuencia de PAM o de unión guía sin alterar la secuencia proteica y evitar que Cas9 se vuelva a cortar tras la integración.
NOTA: Incorporar mutaciones puntuales sinónimas en cebadores usados para amplificación del brazo de homología, dirigiéndose a codones dentro de la región PAM. - Confirmar la integridad de la secuencia donante tanto en brazos de homología como en uniones de etiquetas mediante secuenciación de Sanger.
NOTA: Almacenar plásmidos verificados a −20 °C para almacenamiento a corto plazo o a −80 °C para almacenamiento a largo plazo.
3. Prepara la mezcla de inyección
- Ensamblar la mezcla de inyección combinando el plásmido de expresión CRISPR, el plásmido donante (construido a partir de pPD95.75) y marcadores de coinyección en ddH₂O estéril hasta un volumen final de 10 μL a las concentraciones indicadas en la Tabla 1.
NOTA: Optimizar las concentraciones empíricamente para equilibrar la legibilidad de los marcadores, la recuperación de candidatos y la supervivencia tras la inyección. - Centrifugar la mezcla de inyección a 10.000 × g. durante 10–20 minutos para pelletar material particulado y evitar obstrucciones del capilar de microinyección.
| Componente | Función | Concentración de trabajo (ng/μL) |
| pDD162 | Plásmido CRISPR/Cas9 (expresión de Cas9 y gRNA) | 50-100 |
| Plásmido donante (columna vertebral pPD95.75) | Plantilla donante HDR que lleva la etiqueta fluorescente flanqueada por brazos de homología de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marcador de coinyección (fenotipo de rodillo) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marcador de coinyección (expresión GFP) | 5-10 |
| Estéril ddH2O | Llevar al volumen final | – |
Tabla 1: Composición de la mezcla de inyección y funciones de plásmidos. La mezcla de inyección contiene plásmidos de expresión CRISPR, plásmido donante, pRF4 y pPD122.11 a las concentraciones indicadas, para un volumen total de 10 μL.
4. Carga y prepara la aguja de inyección
- Extrae capilares de vidrio en agujas de microinyección usando un extractor de agujas configurado para producir una estrecha conicidad con una punta afilada adecuada para la inyección gonadal.
NOTA: Optimiza empíricamente los parámetros del puller. Ejemplos de parámetros iniciales: calor = 540, tracción = 20, velocidad = 100.
PRECAUCIÓN: Maneja cuidadosamente las agujas tiradas para evitar lesiones por punzación. Utiliza pinzas al manipular agujas y desecha las agujas usadas en un recipiente para objetos punzantes. - Calienta una micropipeta y rompe la capa en dos para crear una herramienta de carga.
NOTA: Las puntas de carga comerciales pueden usarse como alternativa. - Coloca una bombilla aspiradora de goma en el extremo ancho de la micropipeta microcapilar acortada.
- Aspira aproximadamente 1 μL de mezclas de inyección clarificada con sobrenadante en la cargadora.
NOTA: El volumen exacto no es crítico. Asegúrate de que la solución llene la punta de la aguja. - Introduce el cargador en la parte trasera de la aguja de inyección y dispensa suavemente la mezcla de inyección.
- Coloca la aguja cargada horizontalmente durante 10 minutos para permitir que la solución se asiente hacia la punta y confirmar una columna continua.
- Monta la aguja en el microscopio de inyección y enfoca la punta usando óptica de campo claro.
- Abre la punta de la aguja tocándola suavemente con el borde de una capa de cobertura en aceite de halocarbono y prueba el flujo.
NOTA: Ajuste la presión de inyección (30–80 psi) para generar una burbuja aproximadamente igual al diámetro de la gónada dentro de 1s 16.
5. Prepara los gusanos para la inyección
NOTA: Preparar las placas de Medio de Crecimiento Nematodo (NGM) y el buffer M9 como se ha descritoanteriormente 17. Mantener gusanos en placas con Escherichia coli OP50 (en adelante OP50) y realizar inyecciones en el fondo de N2.
- Selecciona hermafroditas L4 de una placa sana e incuba a 20 °C durante 10 horas para obtener adultos jóvenes con líneas germinales bien desarrolladas.
- Transfiere los gusanos a una placa sin sembrar para reducir la transmisión bacteriana.
- Prepara una almohadilla seca de agarosa al 2% sobre una lámina de vidrio y aplica una gota de aceite de halocarbono.
- Transfiere un gusano a la almohadilla de agarosa usando un rascapes.
- Inmoviliza el gusano y orienta la gónada para la inyección.
PRECAUCIÓN: Complete las inyecciones en un plazo de 20–30 minutos para evitar la desecación.
6. Realizar microinyección gonadal
Figura 2: Localización del sincito gonada distal para microinyección en adultos jóvenes de C. elegans hermafroditas. (A) Imagen de campo claro de bajo aumento de un hermafrodita adulto joven montado. Ambos brazos gónadas son visibles; El lugar de inyección se indica para un brazo (flecha) como ejemplo representativo. La región encapsulada marca el área mostrada con mayor aumento en el panel B. (B) Vista DIC de mayor aumento de la gónada distal correspondiente a la región encapsulada en el panel A. La flecha indica la posición de inyección dentro del sincicio gonadal distal, donde se administra la mezcla de inyección. Barras de escala: 100 μm (A) y 20 μm (B). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
- Localiza un gusano inmovilizado e identifica la gónada usando un objetivo de baja aumentación.
- Coloca la aguja usando controles de micromanipuladores.
- Orienta el gusano en un ángulo de 20–40° respecto a la aguja.
- Céntrate en la línea germinal distal usando un aumento más alto.
- Avanza el gusano hacia la aguja y coloca la punta dentro del sincicio gonadal (Figura 2).
- Inyecta la solución y confirma la administración mediante la hinchazón visible de la gónada.
NOTA: Optimizar la presión de inyección (30–80 psi), la presión de compensación (0,1–0,5 psi) y la duración de la inyección (0,1–0,3 s).
PRECAUCIÓN: Una presión o volumen excesivo puede causar la ruptura de los gusanos. - Retira la aguja y vuelve a colocarla para las inyecciones posteriores.
NOTA: Realizar una inyección unilateral para maximizar la supervivencia, o una inyección bilateral para aumentar la eficiencia de la edición. - Añade un buffer M9 para liberar gusanos y transfiere cada gusano a una placa de recuperación individual.
- Repetir las inyecciones para 20–25 gusanos.
NOTA: Cambia la aguja si se obstruye o se daña. - Incubar gusanos inyectados a 20 °C durante 2–3 días para permitir la recuperación.
7. Seleccionar candidatos a F1 para identificar las líneas de knock-in positivo
- Examinar la progenie F1 para detectar marcadores de coinyección y seleccionar animales positivos para marcadores.
NOTA: En la Tabla Suplementaria 1 se proporcionan ejemplos de marcadores alternativos de coinyección fluorescente con diferentes especificidades tisulares y propiedades espectrales.
NOTA: Selecciona animales que expresen ambos marcadores para mayor fiabilidad. Prioriza las crías con alta frecuencia de marcadores ("prole jackpot"). - Transfiere cada gusano F1 a una placa individual y permite la puesta de huevos durante 1–2 días.
- Lisa cada gusano F1 en un tampón de proteinasa K para preparar plantillas de PCR.
NOTA: Almacenar los lisados a −80 °C si no se procesan inmediatamente. - Realiza PCR de unión usando un cebador genómico fuera del brazo de homología y un cebador interno de etiquetas.
NOTA: Conservar las placas correspondientes de animales F1 positivos para PCR.
8. Analizar la progenie F2 para aislar líneas homocigotas de knock-in y confirmar la integración
- Aísla la descendencia de F2 de líneas F1 positivas para PCR en placas individuales.
- Permitir que los gusanos F2 produzcan descendencia y lisar adultos para el genotipado.
NOTA: Conservar los lisados a −20 °C si es necesario. - Realizar PCR utilizando cebadores flanqueando los brazos de homología para distinguir alelos tipo salvaje y knock-in por tamaño del producto.
- Confirma la integración correcta mediante secuenciación Sanger en ambas uniones de inserción.
- Verifica la expresión y localización de la fluorescencia de la línea germinal utilizando microscopía de fluorescencia.
- Ampliar las líneas homocigotas confirmadas y mantener las existencias.
NOTA: Líneas validadas por criopreservación para almacenamiento a largo plazo.
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Resultados
Siguiendo el protocolo, los hermafroditas adultos jóvenes fueron microinyectados gonádalmente con un plásmido CRISPR/Cas9 (pDD162), un donante de plásmidos que codificaba una etiqueta GFP knock-in flanqueada por brazos de homología de aproximadamente 1 kb (pPD95.75) y marcadores de co-inyección (pRF4 y pPD122.11). Se utilizó un gen blanco enriquecido en línea germinal como ejemplo representativo para generar un alelo knock-in homocigoto estable que reporta la localización de proteínas ba...
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Discusión
Este flujo de trabajo está diseñado para generar líneas estables y homocigotas de knock-in en las que se inserta una etiqueta fluorescente en el locus endógeno para informar de la localización de proteínas bajo control regulatorionativo 5,6,7,8,9,10. En la práctica, el éxito se valora mejor m...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2023YFA1801100 a L.M.), la Fundación de Ciencias Naturales de China (32400698 a P.W., 32270774 a L.M.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Preparar almohadillas de agarose al 2% |
| Caenorhabditis elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cepa de fondo para inyección | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5425 | Aclarar la mezcla de inyección |
| Colesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Plásmido marcador de co-inyección rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Marcador rodador para enriquecer candidatos | |
| Microscopio confocal | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Validar la expresión/localización de GFP |
| Hidrogenofosfato dipotásico (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Hidrogenofosfato di-sódico (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Componente para preparar el tampón M9 |
| Escalera de ADN | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Referencia de tamaño para geles de agarose |
| Estructura base del plásmido donante (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Estructura base para la construcción del donante HDR |
| Sistema de electroforesis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Separar los productos de PCR en geles de agarose para la detección de uniones y el genotipado de la cigosidad |
| Escherichia coli cepa OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Fuente de alimento para gusanos | |
| Plásmido marcador de co-inyección fluorescente (pPD122.11) | Fire Lab | Co-marcador GFP para enriquecer candidatos | |
| Estereomicroscopio fluorescente | SOPTOP | SZX12-HT | Examinar gusanos vivos para detectar marcadores de co-inyección fluorescentes |
| GelRed Stain de ácidos nucleicos para gel | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualización de bandas de ADN |
| Cápsulas de vidrio | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Usado con el extractor de agujas para hacer agujas de inyección |
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Prevenir la desecación durante la inyección |
| Incubadora | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Mantener los gusanos a temperatura estándar |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Pipetas microcapilares | KIMBLE | 71900-50 | Calentadas y rotas para crear herramienta de carga |
| Unidad de microinyección | Eppendorf | FemtoJet 4i | Suministra pulsos de presión controlada de la mezcla de inyección al gónada distal mediante una aguja de microinyección (activada por pedal) |
| Portaobjetos para microscopio | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Preparar almohadillas de agarose al 2% para montar e inmovilizar gusanos durante la microinyección; Abre las puntas de las agujas de inyección contra el borde del cubreobjetos |
| Microscopio para microinyección | ZEISS | Axio Observer.A1 | Microscopio de inyección |
| Extractor de agujas | Sutter Instrument Company | Modelo P97 | Hacer que las cápsulas de vidrio se transformen en agujas de inyección |
| Termociclador PCR | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | Amplificación PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA vacío) | Addgene | 47549 | Expresión de Cas9 + sgRNA |
| Peptona | Gibco | 308723 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Estereomicroscopio | Motic | K400L | Coger y montar gusanos en almohadillas de agarose y realizar pasos de recuperación post-inyección |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
