Un flujo de trabajo de microinyección CRISPR/Cas9 para el marcaje fluorescente endógeno en la línea germinal de Caenorhabditis elegans para obtener líneas homocigotas de knock-in para análisis in vivo de localización de proteínas.
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Artículo de método
Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans
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Resumen
Resumen
La localización de proteínas en la línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) es fundamental para interpretar la función génica durante la gametogénesis, aunque los enfoques transgénicos convencionales suelen producir expresión variable y pueden ser silenciados en las células germinales. Aquí se describe un flujo de trabajo práctico de CRISPR/Cas9 que inserta una etiqueta fluorescente en un locus endógeno, lo que permite la generación de alelos knock-in estables que informan de la distribución proteica bajo regulación nativa. El protocolo cubre las etapas clave del procedimiento: seleccionar una estrategia de etiquetado adecuada para la proteína objetivo, administrar reactivos CRISPR mediante microinyección gonadal en hermafroditas jóvenes adultos, y recuperar animales inyectados para su cribado. Los candidatos knock-in se identifican mediante genotipado basado en PCR a lo largo de dos generaciones para aislar gusanos homocigotos y verificar el alelo editado. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para verificar la fluorescencia de la línea germinal y evaluar la localización subcelular in vivo. El flujo de trabajo está diseñado para ser reproducible y ampliamente aplicable a genes enriquecidos en la línea germinal, proporcionando una vía sencilla para establecer cepas homocigotas marcadas para análisis de desarrollo y biología celular.
Introducción
Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo bien establecido para estudiar el desarrollo reproductivo y la gametogénesis, debido a su ciclo vital corto, cuerpo transparente y alta traabilidadgenética 1. C. elegans existe principalmente como hermafroditas autofecundantes, cuya gónada primero sufre espermatogénesis y luego cambia a oogénesis. Este modo reproductor simplifica el mantenimiento de la cepa y facilita la obtención de líneashomocigotas 2. La transcriptómica espacial reciente ha ampliado sustancialmente la lista de genes enriquecidos en la gónada y....
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Protocolo
Todos los experimentos que involucraron Caenorhabditis elegans se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de organismos de laboratorio en la Universidad Normal de Pekín.
Figura 1: Visión general del marcaje endógeno fluorescente mediado por CRISPR/Cas9 en C. elegans. Flujo de trabajo esquemático que ilustra las principales etapas de la generación y valid....
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Resultados
Siguiendo el protocolo, los hermafroditas adultos jóvenes fueron microinyectados gonádalmente con un plásmido CRISPR/Cas9 (pDD162), un donante de plásmidos que codificaba una etiqueta GFP knock-in flanqueada por brazos de homología de aproximadamente 1 kb (pPD95.75) y marcadores de co-inyección (pRF4 y pPD122.11). Se utilizó un gen blanco enriquecido en línea germinal como ejemplo representativo para generar un alelo knock-in homocigoto estable que reporta la localización de proteínas ba.......
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Discusión
Este flujo de trabajo está diseñado para generar líneas estables y homocigotas de knock-in en las que se inserta una etiqueta fluorescente en el locus endógeno para informar de la localización de proteínas bajo control regulatorionativo 5,6,7,8,9,10. En la práctica, el éxito se valora mejor m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2023YFA1801100 a L.M.), la Fundación de Ciencias Naturales de China (32400698 a P.W., 32270774 a L.M.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Preparar almohadillas de agarose al 2% |
| Caenorhabditis elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cepa de fondo para inyección | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5425 | Aclarar la mezcla de inyección |
| Colesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Plásmido marcador de co-inyección rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Marcador rodador para enriquecer candidatos | |
| Microscopio confocal | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Validar la expresión/localización de GFP |
| Hidrogenofosfato dipotásico (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Hidrogenofosfato di-sódico (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Componente para preparar el tampón M9 |
| Escalera de ADN | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Referencia de tamaño para geles de agarose |
| Estructura base del plásmido donante (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Estructura base para la construcción del donante HDR |
| Sistema de electroforesis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Separar los productos de PCR en geles de agarose para la detección de uniones y el genotipado de la cigosidad |
| Escherichia coli cepa OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Fuente de alimento para gusanos | |
| Plásmido marcador de co-inyección fluorescente (pPD122.11) | Fire Lab | Co-marcador GFP para enriquecer candidatos | |
| Estereomicroscopio fluorescente | SOPTOP | SZX12-HT | Examinar gusanos vivos para detectar marcadores de co-inyección fluorescentes |
| GelRed Stain de ácidos nucleicos para gel | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualización de bandas de ADN |
| Cápsulas de vidrio | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Usado con el extractor de agujas para hacer agujas de inyección |
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Prevenir la desecación durante la inyección |
| Incubadora | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Mantener los gusanos a temperatura estándar |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Pipetas microcapilares | KIMBLE | 71900-50 | Calentadas y rotas para crear herramienta de carga |
| Unidad de microinyección | Eppendorf | FemtoJet 4i | Suministra pulsos de presión controlada de la mezcla de inyección al gónada distal mediante una aguja de microinyección (activada por pedal) |
| Portaobjetos para microscopio | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Preparar almohadillas de agarose al 2% para montar e inmovilizar gusanos durante la microinyección; Abre las puntas de las agujas de inyección contra el borde del cubreobjetos |
| Microscopio para microinyección | ZEISS | Axio Observer.A1 | Microscopio de inyección |
| Extractor de agujas | Sutter Instrument Company | Modelo P97 | Hacer que las cápsulas de vidrio se transformen en agujas de inyección |
| Termociclador PCR | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | Amplificación PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA vacío) | Addgene | 47549 | Expresión de Cas9 + sgRNA |
| Peptona | Gibco | 308723 | Componente para preparar placas de agar NGM |
| Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9 |
| Estereomicroscopio | Motic | K400L | Coger y montar gusanos en almohadillas de agarose y realizar pasos de recuperación post-inyección |
Referencias
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caen....
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Reimpresiones y permisos
