El receptor de la manosa tipo C 2 predice un mal resultado en el glioma y se asocia con fenotipos invasivos y cambios relacionados con la β-catenina/EMT

Resumen

Análisis de cohortes públicas y experimentos basados en células de glioma identifican MRC2 como un marcador de mal pronóstico asociado a una mayor proliferación, migración, invasión y cambios relacionados con β-catenina/EMT en el glioma.

Resumen

El glioma sigue siendo una malignidad letal del sistema nervioso central, y aún se necesitan biomarcadores adicionales que mejoren la estratificación pronóstica e informen la exploración terapéutica. Este estudio evaluó el receptor de manosa tipo C tipo 2 (MRC2/Endo180) integrando cohortes transcriptómicas públicas con validación in vitro . Se obtuvieron perfiles de expresión y anotaciones clínicas emparejadas del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) para comparaciones tumor-normales y cribado pan-cáncer, y se examinaron más a fondo asociaciones pronósticas en la cohorte del Atlas del Genoma del Glioma (CGGA). La expresión de MRC2 se evaluó en líneas celulares de glioma mediante transcripción inversa mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR) e inmunobloting, y se estableció un knockdown estable de MRC2 en células U87 y U251 utilizando ARN cortos de horquilla lentiviral (shRNAs). El crecimiento celular y la clonogenicidad se evaluaron mediante ensayos CCK-8 y de formación de colonias, mientras que la migración e invasión se evaluaron mediante ensayos de inserción de membrana porosa. Se analizaron mediante inmunosedimentación CDK4, CDK6 y β-catenina/epitelial–mesenquimalo (EMT) relacionados con la transición de CDK4, CDK6. En los conjuntos de datos, el MRC2 estaba elevado en el glioma, y una expresión más alta se asoció con una peor supervivencia global, supervivencia específica de la enfermedad e intervalo libre de progresión. In vitro, la depleción de MRC2 redujo la proliferación, clonogenicidad, migración e invasión, acompañada de una disminución de los niveles de proteínas CDK4 y CDK6 y cambios en la β-catenina y los marcadores relacionados con EMT. En conjunto, estos hallazgos apoyan a MRC2 como biomarcador pronóstico candidato asociado a fenotipos de glioma agresivo y requieren una investigación mecanicista e in vivo adicional.

Introducción

Los gliomas representan los tumores primarios más comunes que surgen en el sistema nervioso central y representan una fracción considerable de las neoplasias^{intracraneales 1,2}. Los estudios epidemiológicos estiman una incidencia del orden de unos pocos casos por cada 100.000 personas cada año, con diferencias geográficas y relacionadas con el sexo reportadas entre^{poblaciones 3,4}. Clínicamente, los gliomas abarcan un amplio espectro de comportamiento: los gliomas de menor grado pueden seguir un curso prolongado, mientras que la enfermedad de alto grado —especialmente el glioblastoma— sigue siendo rápidamente fatal para la mayoría de los^pacientes 5,6,7,8. Las clasificaciones modernas de la OMS integran la histología con características moleculares clave (por ejemplo, mutación IDH, alteración del promotor TERT, metilación del promotor MGMT y codeleción 1p/19q), lo que refina el diagnóstico e informa el^{pronóstico 9,10}. A pesar de que el manejo multimodal combina cirugía, radioterapia y quimioterapia, la recurrencia es común y los resultados a largo plazo para tumores de alto grado siguen siendo pobres. Por lo tanto, identificar marcadores pronósticos adicionales y vulnerabilidades cibles sigue siendo una prioridad urgente.

MRC2 (receptor de la manosa tipo C 2; también conocido como Endo180/CD280/uPARAP) es un miembro transmembrana de la familia de receptores de lectinas tipo^{C 11}. Está enriquecido en compartimentos estromales e inmunes, como fibroblastos y macrófagos, y participa en el recambio de la matriz extracelular (MEC), la remodelación relacionada con fibrosis y las interacciones tumor-microambiente^12,13. Estructuralmente, MRC2 contiene una región rica en cisteína N-terminal, un dominio de fibronectina tipo II que une al colágeno, múltiples dominios tipo C tipo lectina, un segmento transmembrana y una cola^{citoplasmática 14,15}. A través de la internalización y remodelación del colágeno, MRC2 puede facilitar la motilidad celular y la invasión tisular, y un MRC2 elevado se ha relacionado con comportamientos agresivos en varios tipos de cáncer, incluyendo mama, páncreas, próstata, melanoma y^glioblastoma 11,14,16,17,18 . Trabajos previos también sugieren conexiones entre MRC2 y programas de señalización pro-invasiva (por ejemplo, vías asociadas al TGF-β), la actividad de la metaloproteinasa matricial y cambios fenotípicos similares a los EMT, así como roles en los estados fibroblastos y macrófagos asociados al^cáncer 17,18,19,20,21 . Sin embargo, la importancia clínica de la MRC2 en el glioma y las consecuencias funcionales de la desregulación de la MRC2 en las células del glioma siguen sin estar claras.

Aunque MRC2 ha sido implicado en la remodelación de la matriz extracelular y en comportamientos invasivos en varias malignidades, su importancia clínica en el glioma no se ha establecido sistemáticamente entre cohortes transcriptómicas independientes, y sus efectos asociados al fenotipo en células gliomas no se han evaluado dentro de un marco integrado que combine el análisis de conjuntos públicos con la validación funcional. Por tanto, este estudio planteó la hipótesis de que MRC2 está asociado con resultados clínicos adversos y fenotipos malignos en el glioma. Para abordar esta cuestión, se integraron el cribado pan-canceroso, la validación independiente de cohortes de glioma y experimentos de knockdown estable en líneas celulares de glioma para evaluar la importancia pronóstica de MRC2 y su asociación con la proliferación, migración, invasión y cambios en marcadores relacionados con β-catenina/EMT. Dado que MRC2 pertenece a la familia de receptores de manosa y la progresión del glioma también está moldeada por el microambiente tumoral, se incluyó un análisis exploratorio adicional de la expresión de MRC1 según el estado de IDH para proporcionar información contextual sobre las diferencias relacionadas con el sistema inmunológico entre subtipos de glioma.

La novedad de este trabajo radica en la evaluación combinada de MRC2 en conjuntos de datos públicos de glioma y ensayos funcionales in vitro , proporcionando así evidencia clínica y experimental complementaria de su relevancia en el glioma. En comparación con los análisis de una sola cohorte o los estudios solo en células, este flujo de trabajo integrado ofrece varias ventajas prácticas. La incorporación de TCGA, GTEx y CGGA permite la validación entre cohortes y reduce la dependencia de un único conjunto de datos. Además, el acoplamiento de análisis de cohortes públicas con ensayos de knockdown con células de glioma vincula asociaciones clínicas con evidencia a nivel fenotípico. Finalmente, el uso de lecturas complementarias, incluyendo RT-qPCR, inmunobloting, CCK-8, formación de colonias y ensayos de inserción de membrana porosa, permite evaluar en paralelo cambios transcripcionales, a nivel proteico, proliferativos y relacionados con la motilidad. El diseño general del estudio y el flujo de trabajo analítico se resumen en la Figura 1. En conjunto, esta estrategia mejora la robustez y la interpretabilidad biológica de los hallazgos en comparación con enfoques de bioinformática solo o de ensayo único.

Protocolo

Este estudio utilizó conjuntos de datos públicos y desidentificados (TCGA, GTEx y CGGA) y líneas celulares comerciales establecidas. No participaron participantes humanos recién reclutados, ni información identificable del paciente ni muestras derivadas del paciente. Todos los análisis se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales e internacionales pertinentes para el uso de datos públicos disponibles. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética institucional adicional ni consentimiento informado para este estudio.

1. Flujo de trabajo bioinformático y preprocesamiento de datos

Se obtuvieron perfiles de expresión génica y anotaciones clínicas emparejadas de recursos públicos, incluyendo el Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), el proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) y el Atlas del Genoma del Glioma Chino (CGGA). Las matrices de expresión y los metadatos clínicos se importaron en R y se armonizaron según los identificadores de la muestra. Se eliminaron entradas duplicadas o no emparejadas, y se excluyeron muestras que carecían de información esencial de supervivencia de los análisis de supervivencia. Se extrajeron los valores de expresión de MRC2 y las variables clinicopatológicas correspondientes para análisis posteriores. Para las comparaciones tumor-normales, la expresión de MRC2 se comparó entre tipos de cáncer utilizando datos solo de TCGA cuando había tejidos normales compatibles disponibles y utilizando datos integrados de TCGA–GTEx cuando se requerían controles normales adicionales. Para análisis centrados en gliomas, los pacientes de las cohortes TCGA-LGG y CGGA se estratificaron en grupos de alta y baja expresión según el nivel mediano de expresión de la cohorte MRC2. Posteriormente se realizaron análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, análisis de características operativas del receptor dependientes del tiempo (ROC) y regresión de riesgos proporcionales de Cox para evaluar la relevancia pronóstica de MRC2. Los modelos de Cox incluyeron covariables disponibles como edad, sexo, grado de la OMS y otras variables clinicopatológicas, dependiendo de la integridad de los datos dentro de cada cohorte. Se realizaron análisis de subgrupos según variables como la edad, subtipo histológico, grado de la OMS, estado de mutación IDH, estado de codedeleción 1p/19q e información relacionada con el tratamiento, cuando estuviera disponible. Las figuras se generaban utilizando flujos de trabajo estadísticos estándar de gráficos en R y GraphPad Prism.

2. Análisis pan-cancerosos de expresión y supervivencia

La expresión de MRC2 se comparó entre el tumor y los tejidos normales entre tipos de cáncer utilizando conjuntos de datos TCGA y GTEx. Las diferencias se visualizaron usando diagramas de caja y se resumieron usando diagramas de radar. Se realizaron análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox para evaluar las asociaciones entre la expresión de MRC2 y la supervivencia global (SO), la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y el intervalo libre de progresión (IFP) entre los tipos de cáncer. Las razones de riesgo y los niveles de significación correspondientes se visualizaron utilizando parcelas forestales y mapas de calor.

3. Validación pronóstica y análisis de subgrupos en cohortes de glioma

En la cohorte de glioma de menor grado de TCGA (TCGA-LGG), los pacientes se estratificaron en grupos de expresión MRC2 alta y baja. Se realizaron análisis de supervivencia de Kaplan–Meier para comparar OS, DSS e IFP entre grupos. Se generaron curvas de características de funcionamiento del receptor (ROC) dependientes del tiempo para evaluar el rendimiento predictivo. Se realizaron análisis de regresión de Cox univariantes y multivariantes para evaluar el valor pronóstico independiente de MRC2. La validación externa se realizó utilizando el conjunto de datos de gliomas CGGA, incluyendo análisis de supervivencia de Kaplan–Meier, análisis ROC y regresión de Cox. Se realizaron análisis de subgrupos para evaluar la expresión de MRC2 entre variables clinicopatológicas, incluyendo edad, grado tumoral, subtipo histológico, estado de mutación IDH, estado de codedeleción 1p/19q y variables relacionadas con el tratamiento.

4. Expresión de MRC1 en gliomas mutantes IDH frente a gliomas tipo salvaje IDH

La asociación entre la expresión de MRC1 y el estado de mutación de IDH se evaluó utilizando la plataforma web GlioVis y el conjunto de datos TCGA GBMLGG. Los casos se agruparon según el estado anotado de IDH en gliomas mutantes IDH y de tipo salvaje IDH. Se consultó la expresión del ARNm MRC1 dentro del conjunto de datos seleccionado, y se compararon los niveles de expresión entre ambos grupos utilizando la función de análisis estadístico integrada en la plataforma. Las distribuciones de expresiones por grupo se mostraron tal como generadas por la plataforma, y la significación estadística se definió como P < 0,05.

5. Cultivo celular

Se obtuvieron líneas celulares de glioma humano y astrocitos humanos normales de repositorios celulares establecidos. Las células se cultivaron en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco, suplementadas con suero fetal bovino (FBS) al 10% y mantenidas a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía un 5% de CO₂ y aproximadamente un 95% de humedad relativa. Se seleccionaron células U87 y U251 para experimentos de pérdida de función porque el cribado inicial en el panel de células gliomas probado mostró que estas dos líneas celulares expresaban niveles relativamente altos de MRC2 y, por tanto, eran adecuadas para análisis funcionales basados en knockdown.

6. Caída lentiviral de MRC2

Los ARN cortos en horquilla (shRNAs) dirigidos a MRC2 y un control no dirigido fueron clonados en vectores lentivirales. Las partículas lentivirales se producían co-transfectando células HEK293T con plásmidos de transferencia y envasando plásmidos usando un reactivo estándar de transfección. Los sobrenacionantes virales se recogieron a las 48 y 72 horas después de la transfección, se centrifugaron a 2.100 × g durante 5 minutos para eliminar las células de envase y los restos celulares, y luego pasaron por un filtro de 0,45 μm antes de su uso o almacenamiento inmediato a −80 °^{C 19}. Se usaron sobrenadantes que contenían virus de inmediato o se alicotaron y almacenaron a −80 °C. Se evitaron los ciclos repetidos de congelación y deshielo. Las células de glioma fueron infectadas con partículas lentivirales en presencia de polibrene. Tras la infección, se seleccionaron células con puromicina para establecer líneas celulares estables de knockdown. Las secuencias utilizadas fueron las siguientes: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGCTATAAGGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.

7. Validación del knockdown de MRC2 mediante RT-qPCR e inmuno-absorbente

El ARN total se extrajo usando reactivo TRIzol, y el cDNA se sintetizó mediante un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó utilizando la química SYBR Green bajo las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s, con un análisis de la curva de disociación al final de la amplificación. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: MRC2 hacia adelante, 5′-GGCAAGGACAAGAAGTGCGTGT-3′; MRC2 reversa, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCTGCTT-3′; GAPDH hacia adelante, 5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′; y GAPDH inverso, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′. La expresión relativa de ARNm se calculó utilizando el método comparativo_{C t} (2^-ΔΔCt) con GAPDH como control^{interno 20}. Se realizó inmunoblot en paralelo para confirmar la reducción de MRC2 a nivel de proteína. Para RT-qPCR, se analizaron tres réplicas biológicas independientes y cada muestra se realizó en triplicado técnico.

8. Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo CCK-8. Las células se sembraron en placas de 96 pozos con una densidad adecuada y se cultivaron para los periodos indicados. En cada momento se añadía reactivo CCK-8 a cada pozo e incubado según las instrucciones del fabricante, tras lo cual se medía la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas. Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes.

9. Ensayo de formación de colonias

Las células se sembraron a baja densidad en placas de seis pozos y se cultivaron durante 10–14 días. Las colonias se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se teñieron con violeta cristalino al 0,1% durante 15 minutos. Las colonias se lavaron con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS), se secaron al aire y se contaron manualmente o utilizando el software de análisis^{de imagen 21}. Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes.

10. Ensayos de migración e invasión celular

La migración e invasión celular se evaluó utilizando ensayos de inserción de^{membrana porosa 22}. Para los ensayos de invasión, los insertos superiores se recubrieron previamente con gel de matriz extracelular; Para los ensayos de migración, se utilizaron insertos sin recubrimiento. Se añadieron células suspendidas en un medio libre de suero a la cámara superior, y el medio que contenía suero se colocó en la cámara inferior como quimioatractivo. Tras la incubación, las células no migratorias de la superficie superior de la membrana fueron retiradas suavemente con un hisopo de algodón. Las células que habían migrado o invadido la superficie inferior se fijaban con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, se teñían con violeta cristalino al 0,1% durante 15 minutos, se enjuagaban con solución salina tamponada con fosfato frío, se secaban al aire e imágenes bajo un microscopio invertido a ×200 de aumento. Las células se contaron en cinco campos microscópicos seleccionados aleatoriamente por inserto. Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes.

11. Análisis de Western blot

Las células se lisaron en un tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasas, y la concentración de proteínas se determinó mediante un ensayo BCA. Cantidades iguales de proteína total fueron separadas por SDS-PAGE y transferidas a las membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Los siguientes anticuerpos primarios y diluciones de acción se utilizaron para el western bloting: anti-MRC2 (1:5.000), anti-CDK4 (1:1.000), anti-CDK6 (1:2.000), anti-β-catenina (1:5.000), anti-E-cadherina (1:10.000), anti-N-cadherina (1:3.000) y anti-β-actina (1:5.000). Tras el lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios anti-IgG de cabra conjugados con peroxidasa picante o anti-IgG anticonejo de cabra (1:5.000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron mediante quimiluminiscencia, y las intensidades de las bandas se cuantificaron y normalizaron a β-actina. Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes.

12. Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos utilizando R y GraphPad Prism. Las curvas de supervivencia se compararon utilizando la prueba log-rank. Se utilizaron modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox para análisis univariantes y multivariantes. Para los experimentos basados en células, los datos se presentan como media ± DS. Antes de las pruebas paramétricas, la normalidad se evaluaba mediante la prueba de Shapiro–Wilk. Para los datos normalmente distribuidos, las diferencias entre dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student, y se realizaron comparaciones entre varios grupos utilizando ANOVA unidireccional. Si no se cumplían las suposiciones de normalidad, se utilizaban las pruebas no paramétricas correspondientes. Los valores p se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de tasa de descubrimiento de falsos de Benjamini–^{Hochberg 23,24}. Se consideró estadísticamente significativo un P < de dos caras.

Resultados

Expresión pancancerosa y paisaje pronóstico de MRC2
Los análisis pan-cancerosos se realizaron primero para caracterizar el patrón de expresión y la relevancia pronóstica de MRC2 en malignidades humanas. Las comparaciones basadas en los conjuntos de datos TCGA y GTEx mostraron que la expresión de MRC2 difería significativamente entre tejidos tumorales y normales en múltiples tipos de cáncer (Figura 2A, 2B). Un resumen del ...

Discusión

La terapia estándar para el glioma se basa en la máxima resección segura seguida de radioterapia y quimioterapia, siendo la más común la temozolomida⁴. No obstante, la infiltración difusa frecuentemente limita la extirpación quirúrgica completa y contribuye a la recaída inevitable, especialmente en enfermedades de alto^{grado 3,25}. Varias características moleculares —incluyendo la metilación del promotor MGM...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-CDK4	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	11026-1-AP	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID: AB_2078702.
Anticuerpo anti-CDK6	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	66278-1-IG	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID: AB_2881661.
anticuerpo anti-E-cadherina	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	20874-1-AP	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID:AB_10697811.
Anticuerpo anti-MRC2	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	86028-1-RR	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID: AB_2879692.
Anticuerpo anti-N-cadherina	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	22018-1-AP	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID: AB_2813891.
Anticuerpo anti-β-actina	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	66009-1-IG	Anticuerpo de control de carga para la blot occidental. RRID: AB_2687938.
Anticuerpo anti-β-catenina	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	51067-2-AP	Anticuerpo principal para la absorción occidental. RRID: AB_2086128.
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beyotime Biotechnology, China	P0012	Kit de ensayo de proteínas BCA para la determinación de la concentración de proteínas.
Kit de Recuento de Celdas-8 (CCK-8)	Laboratorios Dojindo, Japón	CK04-500T	Ensayo de viabilidad/proliferación celular.
Sistema de imagen quimioluminiscencia	Uvitec Limited, Francia	Manual Avanzado Alliance Q9	Sistema de adquisición de imagen para la detección de manchas occidentales.
Incubadora CO2	Equipamiento genérico de laboratorio	No especificado	Incubadora de CO2 humidificada utilizada para cultivo celular a 37 °C; C y 5% CO2.
Solución de violeta cristalina (0,1%)	Beyotime Biotechnology, China	C0121-100 mL	Solución teñidora de violeta cristalino utilizada a una concentración de trabajo del 0,1%.
DMEM, glucosa alta	Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	C11995500BT	Medio basal para cultivo celular de glioma.
Suero fetal bovino (FBS)	ExCell Bio, China	FSP500	Suplemento sérico para cultivo celular.
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	No aplicable	Plataforma web para la visualización y análisis de conjuntos de datos de expresión de tumores cerebrales, especialmente gliomas.
GraphPad Prism	GraphPad Software, EE. UU.	Versión 10.4.0	Software de análisis estadístico y gráficos. RRID: SCR_002798.
HEK293T Células	Colección de Cultura de Tipos de la Academia China de Ciencias, Shanghái, China	GNHu43	Línea celular de envasado utilizada para la producción de lentivirales. RRID: CVCL_0063.
IgG Anti-Ratón de Cabra conjugado con HRP (H+L)	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	SA00001-1	Anticuerpo secundario para la coagulación occidental. RRID: AB_2722565.
IgG Anti-Conejo de Cabra conjugado con HRP (H+L)	Proteintech Group, Inc., EE. UU.	SA00001-2	Anticuerpo secundario para la coagulación occidental. RRID: AB_2722564.
Astrocitos humanos	Colección de Cultura de Tipos de la Academia China de Ciencias, Shanghái, China	No disponible públicamente	Astrocitos humanos normales usados como control no tumoral; número de catálogo no disponible públicamente.
Microscopio invertido	Equipamiento genérico de laboratorio	No especificado	Microscopio invertido utilizado para la adquisición de imágenes en ensayos de migración e invasión.
Matriz matrigel	Corning, EE. UU.	354234	La matriz de membrana basal se utiliza para recubrir insertos en ensayos de invasión.
Lector de microplacas	Equipamiento genérico de laboratorio	No especificado	Lector de microplacas utilizado para la medición de absorbancia a 450 nm en ensayos CCK-8.
Kit de preparación en gel PAGE, 10%	EpiZyme, China	PG212	Kit de preparación de gel SDS-PAGE.
Kit de preparación en gel PAGE, 7,5%	EpiZyme, China	PG111	Kit de preparación de gel SDS-PAGE.
Solución de paraformaldehído (4%)	Beyotime Biotechnology, China	P0099-100 mL	Fijador de paraformaldehído al 4% para la formación de colonias y los ensayos de migración/invasión.
Solución de penicilina-estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	15140163	Suplemento antibiótico para cultivo celular.
Polybrene	Beyotime Biotechnology, China	C0351-1 mL	Solución de bromuro de hexadimetrina (10 mg/mL) utilizada para facilitar la transducción lentiviral.
Marcador proteico prestained	Elabscience, China	E-IR-R331	Marcador de peso molecular de proteínas.
Kit de reactivos PrimeScript RT	Takara Bio Inc., Japón	RR047A	Kit de transcripción inversa para síntesis de ADNc.
Puromicina	Beyotime Biotechnology, China	ST551-10 mg	Puromicina dihidrocloruro utilizada para seleccionar células de knockdown estables.
Membrana PVDF	Beyotime Biotechnology, China	FFP20	Membrana PVDF hidrofila (0,45 & micro; m) para la transferencia western blot.
R	Fundación R para Computación Estadística, Austria	Versión 4.5.1	Entorno de computación estadística utilizado para análisis bioinformáticos. RRID: SCR_001905.
Búfer de lisis RIPA	Beyotime Biotechnology, China	P0013B	Buffer de lisis RIPA (fuerte) para extracción de proteínas.
Búfer de carga SDS-PAGE (5 veces)	Beyotime Biotechnology, China	P0015L	Amortiguador de carga de muestras de proteína.
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Bio Inc., Japón	RR066A	Mezcla maestra qPCR.
Insertos Transwell, 8.0-& micro; m tamaño de poro	Corning, EE. UU.	3422	Inserciones de cultivo celular con un 8.0 y micro; membrana de policarbonato del tamaño de un poro m; Formato estándar de 24 pozos para ensayos de migración e invasión.
Reactivo de Trizol	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	10296010CN	Reactivo de extracción de ARN.
Células gliomas de U251	Colección Nacional de Cultivos Celulares Autenticados, China	SCSP-559	Línea celular de glioma humano utilizada para ensayos de knockdown y funcional. RRID: CVCL_0021.
Células gliomas U87	Colección Nacional de Cultivos Celulares Autenticados, China	SCSP-5432	Línea celular de glioma humano utilizada para ensayos de knockdown y funcional. RRID: CVCL_0022.