Visualización y cuantificación del emparejamiento de bases de ARN intermolecular en clústeres de ARN in vitro utilizando reporteros de ARN brócoli dividido

Summary

Este protocolo describe un ensayo visual que utiliza reporteros de ARN brócoli divididos para detectar y cuantificar el apareamiento de bases intermoleculares en agrupaciones de ARN in vitro.

Abstract

El agrupamiento de ARN, impulsado por interacciones intermoleculares multivalentes ARN–ARN, puede ocurrir in vitro en ausencia de proteínas. Aunque se han utilizado sondeos químicos y simulaciones computacionales para predecir estas interacciones, los métodos para evaluar directamente el emparejamiento de bases intermoleculares en clústeres de ARN siguen siendo limitados. Este estudio presenta un ensayo visual basado en reporteros de ARN brócoli divididos conjugados con ARN de interés marcados fluorescente. El ensayo permite la detección y cuantificación del emparejamiento de bases intermoleculares en clústeres de ARN. El sistema de brócoli dividido contiene secuencias reporteras complementarias que se dimerizan para formar el aptámero de ARN brócoli. La estructura de ARN dimerizado resultante se une a DFHBI-1T, un fluoróforo que emite fluorescencia verde al unirse. Al agruparse el ARN, la aparición de fluorescencia verde informa de emparejamiento de bases mediado por las secuencias reporteras complementarias entre los ARN de interés. La medición de la fluorescencia de DFHBI-1T permite una evaluación cuantitativa de cómo las condiciones de agrupamiento in vitro de ARN influyen en el emparejamiento intermolecular de bases entre estas secuencias reporteras.

Introduction

Los ARN transcritos in vitro pueden autoensamblarse en clústeres visibles tras la adición de sales y reactivos de apiñamiento^molecular 1,2,3,4,5. Cabe destacar que estos grupos de ARN pueden formarse en ausencia de otros componentes celulares, incluidas las proteínas, lo que indica que, bajo condiciones específicas, las interacciones intermoleculares ARN–ARN son suficientes para impulsar la condensación del ARN in vitro.

Entre los distintos tipos de interacciones intermoleculares ARN–ARN, el emparejamiento de bases intermoleculares ha recibido una atención considerable en el campo de^condensados 1,2,4,6,7,8,9,10. Estas interacciones pueden ser impulsadas por secuencias complementarias expuestas ("códigos postales") entre transcritos, como se demuestra mediante la coagrupación de ARNm BNI1 y SPA2 en el hongo filamentoso Ashbya gossypii² o la oligomerización del ARNm de oskar en Drosophila melanogaster ^6,7. Alternativamente, el emparejamiento intermolecular de bases puede promoverse mediante la remodelación de estructuras secundarias de ARN, exponiendo secuencias complementarias que de otro modo estarían estructuralmente incrustadas. Este mecanismo se ha observado en ARN repetidos in^silico-9 y en riboswitches de guanidina in vitro¹⁰. Tanto las secuencias complementarias expuestas como la remodelación estructural del ARN pueden medirse mediante sondeo químico^11,12 o enfoques^{de simulación} 4,9,13,14. Sin embargo, los métodos que visualizan directamente el emparejamiento de bases intermoleculares en ensayos in vitro de agrupamiento de ARN siguen siendo limitados.

Los ensayos de arrastre de ARN mediante apareamientos de bases 15,16,17 y electroforesis en gel ^4,6,7 se utilizan comúnmente para estudiar el apareamiento intermolecular de bases de ARN in vitro. Sin embargo, estos métodos carecen de la resolución espacial para distinguir el emparejamiento de bases dentro de los clústeres del que está fuera de ellos. Además, aislar los clústeres de ARN para el análisis posterior es técnicamente complicado, ya que requiere preservar la estabilidad del clúster asegurando la compatibilidad del búfer con ensayos posteriores.

Anteriormente se ha empleado un ensayo visual basado en reportes de ARN de brócoli^{divididos 18} conjugados con ARN marcados fluorescentemente de interés para permitir la detección directa del emparejamiento de bases intermoleculares durante la condensación de ARN in vitro⁴. En este contexto, el sistema Brócoli dividido informa sobre la probabilidad de interacciones intermoleculares entre reporteros o entre ARN que los transportan bajo condiciones definidas de agrupamiento in vitro . Así, el ensayo explora cómo el contexto de la secuencia y los factores ambientales influyen en la propensión al apareamiento de bases intermoleculares dentro de un entorno similar a un grupo de ARN.

El sistema de brócoli dividido consta de dos secuencias de ARN complementarias, superior e inferior, que se dimerizan para reconstituir el aptámero de ARN brócoli (Figuras 1A–C)¹⁸. Al dimerizarse, el aptámero se une al fluoróforo DFHBI-1T, lo que resulta en fluorescencia verde (Figuras 1A–C)¹⁸. Con este sistema, se demuestra que el grado de emparejamiento de bases intermoleculares entre secuencias complementarias reporteras dentro de los grupos de ARN depende del plegamiento del ARN. Comparando la proporción de fluorescencia DFHBI-1T con los niveles de ARN en diferentes condiciones experimentales, se puede evaluar cuantitativamente la influencia de las condiciones in vitro sobre el emparejamiento intermolecular de bases mediado por reporteros dentro de los clústeres de ARN.

Este ensayo complementa los enfoques de pull-down de ARN y electroforesis en gel para estudiar el emparejamiento de bases intermoleculares en clústeres de ARN. Sin embargo, la detección robusta de señales puede requerir reactivos de apiñamiento molecular, y la sensibilidad está limitada por la eficiencia de la dimerización y el plegamiento de los ARN de Brócoli divididos superior e inferior .

Protocol

Este protocolo proporciona un método paso a paso para implementar este ensayo y analiza sus aplicaciones. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de plantillas de ADN para la transcripción in vitro de ARN

1. Añadir una secuencia promotora T7 al extremo 5′ de cada plantilla de ADN que contiene las secuencias divididas de brócoli aptámero para la transcripción in vitro de ARN. Utiliza las secuencias de brócoli aptámero divididas (arriba e inferior) solas o insértalas en cualquier posición aguas abajo del promotor T7, con o sin una secuencia adicional de ARN de interés.
   NOTA: Las secuencias para el promotor T7, los reporteros de brócoli divididos y los cebadores usados para amplificar las plantillas de ADN se enumeran en la Tabla 1.
   NOTA: La ARN polimerasa T7 prefiere firmemente iniciar la transcripción con un "G" en la posición +1. La presencia de Gs adicionales inmediatamente aguas abajo en las posiciones +2 y +3 puede aumentar el rendimiento de^{transcripción 19}. Sin embargo, cuando la secuencia aguas abajo comienza con G, como en las construcciones superior e inferior que comienzan con dos G, la transcripción puede iniciarse en diferentes^{posiciones 20}. Como resultado, los transcripciones pueden llevar uno, dos o tres Gs en el extremo 5′ (por ejemplo, GATCC, GGATCC o GGGATCC), lo que puede afectar la interpretación del emparejamiento de bases en los constructos diseñados.
2. Utiliza bloques génicos sintetizados comercialmente, plásmidos o fragmentos de ADN como plantillas para la PCR. Si la plantilla original no contiene un promotor T7, utiliza un cebador frontal con un voladizo de promotor T7 de 5′ junto con el cebador inverso adecuado.
3. Preparar una reacción PCR de 50 μL en un tubo de PCR de 200 μL que contiene 2,5 μL de cebadores directos e inversos de 10 μM, plantilla de ADN de 20 ng, mezcla maestra de alta fidelidad 25 μL de 25 ×μL y agua libre de nucleasa. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga a 2.000 × g durante 2 segundos.
4. Ejecutar la reacción PCR en un ciclador térmico usando el siguiente programa: 98 °C durante 30 s (1 ciclo); 98 °C durante 10 s, temperatura de recocido optimizada para 30 s y 72 °C para 30 s por kilobase (35 ciclos); 72 °C durante 2 minutos (1 ciclo).
   NOTA: Determina la temperatura optimizada de recocido usando una herramienta online como una calculadora de TM. Los productos de PCR pueden almacenarse a 4 °C tras su finalización.
5. Mezclar 2 μL de producto PCR con 8 μL de agua libre de nucleasa y 2 μL de 6× de colorante de carga. Carga la mezcla sobre un gel de agarosa al 1% para electroforesis.
   NOTA: El producto de PCR debe aparecer como una sola banda. Si se observan múltiples bandas, extirpe la banda correcta y purífica con un kit de extracción en gel antes de continuar.
6. Purificar el producto de PCR o el ADN extraído en gel usando un kit de purificación de ADN y eluir en 20–30 μL de agua libre de nucleasa en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
7. Mide la concentración y pureza del ADN usando un espectrofotómetro de microvolumen. Asegúrate de que A260/A280 sea aproximadamente 1.8 y A260/A230 sea mayor que 2.0.
   NOTA: Si A260/A230 está por debajo de 2,0, realiza un paso adicional de purificación.
8. Guarda la plantilla de ADN a −20 °C hasta su uso.

2. Preparación de la reacción de transcripción de ARN in vitro

1. Limpia la superficie de trabajo, los estantes de tubos y las pipetas con solución de descontaminación RNasa. Usa puntas filtradas y sin RNasa.
2. El tampón de reacción de deshielo y las soluciones de nucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP) suministradas con el kit de transcripción T7, junto con UTP-Cy5, en hielo. Centrifuga todos los tubos a 2.000 × g durante 2 segundos antes de su uso.
   NOTA: Protege el UTP-Cy5 de la luz.
3. Calcular el número de bases de timina en la plantilla de ADN (excluyendo el promotor T7) y determinar los volúmenes requeridos de UTP y UTP-Cy5 para una reacción transcripcional de 20 μL. Mantener una densidad de marcado consistente entre especies de ARN.
   NOTA: Por ejemplo, para marcar un ARN que contiene 100 bases de uracilos con aproximadamente tres uracilos marcados con Cy5, añadir 4,5 μL de 1 mM UTP-Cy5 y 1,9 μL de 75 mM UTP.
4. Prepara una reacción de transcripción de 20 μL combinando 2 μL de ATP, CTP y GTP, volúmenes calculados de UTP (todos suministrados con el kit) y UTP-Cy5, 2 μL 10× tampón de reacción, mezcla enzimática de 2 μL, plantilla de ADN de 200 ng y agua libre de nucleasa. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga a 2.000 × g durante 2 segundos.
5. Incubar la reacción a 37 °C durante 6 horas.
6. Añade 1 μL de DNasa que viene con el kit. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga a 2.000 × g durante 2 segundos.
7. Incuba a 37 °C durante 15 minutos adicionales.
8. Transfiere la reacción (~20 μL) a un tubo de 1,5 mL. Añade 115 μL de agua sin nucleasas y 15 μL de solución de parada de acetato de amonio suministrada con el kit. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo y centrifuga a 2.000 × g durante 2 segundos.
   NOTA: Se puede utilizar un kit comercial de purificación de ARN en lugar de los pasos 2.9–3.7.
9. Añade 150 μL de fenol/cloroformo y mezcla suavemente.
   PRECAUCIÓN: Manipula fenol/cloroformo en una campana extractora química.
10. Centrifugar a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
11. Transfiere la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
    NOTA: Evita perturbar la interfase; la capa inferior puede parecer azul debido a un tinte no incorporado.
12. Añade un volumen igual de cloroformo y mezcla bien.
    PRECAUCIÓN: Manipula cloroformo en una campana extractora química.
13. Centrifugar a 16.000 × g durante 2 minutos a 4 °C.
14. Repite los pasos 2.11–2.13.
15. Transfiere la capa acuosa (~100–150 μL) a un tubo nuevo. Añade 900 μL de isopropanol y mezcla bien.
16. Aliquot en tres volúmenes iguales en tubos separados.
    NOTA: Cada aliteracia es suficiente para múltiples reacciones de agrupamiento de ARN.
17. Conservar a −20 °C durante la noche o hasta un mes.

3. Purificación de ARN transcrito in vitro

1. Centrifuga la muestra de ARN en isopropanol a 16.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
2. Retira cuidadosamente el isopropanol sin alterar el pellet de ARN.
3. Añade 1 mL de etanol al 70% preparado en agua libre de nucleasa.
4. Centrifugar a 16.000 × g durante 2 minutos a 4 °C.
5. Retira el etanol y repite los pasos 3.3–3.4.
6. Durante el lavado final con etanol, retira la mayor parte del etanol usando una pipeta de 1000 μL. Centrifugar brevemente a 2.000 × g durante 2 s en una minicentrífuga de mesa y eliminar cualquier etanol restante usando una pipeta de 20 μL.
7. Seca al aire el pellet de ARN durante 1–2 minutos a temperatura ambiente (RT).
8. Resuspende el bolíto de ARN en 20 μL de agua libre de nucleasa. Guarda la muestra en hielo y protégela de la luz.
9. Mide la concentración y pureza del ARN usando un espectrofotómetro de microvolumen. Asegúrate de que A260/A280 sea aproximadamente 2.0 y A260/A230 mayor que 2.0.

4. Preparación de la reacción de agrupamiento de ARN in vitro

NOTA: En este protocolo, la inducción del agrupamiento de ARN requiere espermina y PEG 8000, según estudios ^{previos 2,4,5}. Concretamente, se alocó una solución de 100 mM de tetracloruro de espermina preparada en agua libre de nucleasas en múltiples tubos microcentrífugas de 1,5 mL y se almacenó a −20 °C.

1. Descongela un tubo de solución de espermina de 100 mM y un 50% de PEG 8000 sobre hielo.
   NOTA: Tras la apertura, el 50% de PEG 8000 debe usarse no más de dos meses debido a la posible degradación.
2. Para preparar 500 μL de tampón de replegamiento de ARN recién elaborado de 10×, combine 50 μL de 2M KCl, 50 μL de 1M_{MgCl 2}, 50 μL de 1M Tris (pH 7,0) y 350 μL de agua sin nucleasas. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo. Centrifugar a 2.000 × g durante 2 segundos en una minicentrífuga de sobremesa.
   NOTA: El tampón de replegamiento debe prepararse el día del experimento de agrupamiento de ARN.
   NOTA: Los pasos 4.3-4.4 dependen de las condiciones experimentales y pueden ajustarse según sea necesario. A continuación se describen dos condiciones ejemplo para el agrupamiento de ARN utilizadas en este estudio. La condición de co-plegamiento está adaptada de un método utilizado para recocer oligonucleótidos antisentido en^{ARN 2}. En este método, los ARN se mezclan en un tampón de sal y se calientan juntos para promover el apareamiento intermolecular de bases entre ARN que transportan secuencias complementarias. En cambio, para la condición de plegamiento separado, cada ARN se pliega individualmente antes de mezclarse. Esta condición pretende aproximarse a un escenario celular en el que los ARN se pliegan antes de interactuar.
3. Co-plegado
   NOTA: Esta condición favorece el apareamiento intermolecular de bases entre ARN que contienen las secuencias superior e inferior . Sirve como control positivo para el emparejamiento de bases intermoleculares impulsado por reporteros bajo la condición de agrupamiento de ARN.
   1. En un tubo PCR de 200 μL, combina 16 pmol de cada ARN transcrito in vitro con secuencia superior o inferior , 2 μL de 10× tampón de ARN replegado y agua sin nucleasas hasta un volumen final de 14 μL. Mezcla a fondo pipeteando arriba y abajo. Centrifugar a 2.000 × g durante 2 segundos en una minicentrífuga de mesa.
      NOTA: Para calcular la masa de ARN correspondiente a 16 pmol.
   2. Calienta la muestra de ARN a 90 °C durante 2 minutos.
   3. Transfiere inmediatamente la muestra a RT y protégela de la luz. Incuba la reacción en RT durante 1 hora.
4. Plegado separado
   1. Calienta la muestra de ARN a 90 °C durante 2 minutos y luego colócala inmediatamente sobre hielo durante al menos 15 minutos.
   2. En un tubo PCR de 200 μL, combinar 16 pmol de ARN transcrito in vitro que transporta la secuencia superior o inferior , 1 μL de 10× tampón de ARN replegado y agua sin nucleasas hasta un volumen final de 7 μL.
      NOTA: Para calcular la masa de ARN correspondiente a 16 pmol.
   3. Incuba la reacción en RT durante 30 minutos, protegido de la luz.
   4. Combina las muestras de ARN que contienen las secuencias superior e inferior en un único tubo de PCR. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo. Centrifugar a 2.000 × g durante 2 segundos en una minicentrífuga de mesa. Incubar en RT durante 30 minutos.
5. Añade 6 μL de una mezcla premezcla 1:2 (v/v) de 100 mM de espermina y 50% de PEG 8000. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo. Centrifugar a 2.000 × g durante 2 s en una minicentrífuga de mesa.
   NOTA: El PEG 8000 al 50% es muy viscoso. Pipete despacio y con cuidado.
6. Añade 2 μL de 1 mM de DFHBI-1T a la reacción. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo. Centrifugar a 2.000 × g durante 2 s en una minicentrífuga de mesa. La reacción debería parecer amarillo-verdosa.
   NOTA: Para preparar una solución stock de DFHBI-1T de 20 mM a partir de 1 mg de tinte liofilizado DFHBI-1T (MW: 320.21), añade 156 μL de DMSO anhidro de grado biológico molecular. Alicuota el material en pequeñas cantidades en varios tubos microcentrífugas y almacena a -20 °C. Evita ciclos repetitivos de congelación y descongelación para el tinte. Prepara una solución de trabajo DFHBI-1T recién diluida de 1 mM diluyendo el stock de 20 mM en agua libre de nucleasas y almacenándolo sobre hielo.
7. Carga la reacción en un tapa con cámara de vidrio.
8. Incuba la cámara en RT durante 4 horas en la oscuridad con la tapa puesta para minimizar la evaporación.

5. Preparación para la imagen

1. Adquirir imágenes tridimensionales utilizando un microscopio de iluminación estructurada o confocal equipado con láseres y objetivos adecuados.
   NOTA: Se requiere microscopía confocal para minimizar la luz desenfocada.
2. Configura el microscopio para obtener imágenes de cada región de interés (ROI) con el canal Cy5 primero en cada plano z, seguido de obtener imágenes del mismo ROI usando el canal GFP.
3. Ajusta el tiempo de exposición a 500 ms para todos los canales. Ajusta la potencia del láser al 80% para GFP y al 40% para Cy5.
4. Imagina una región de deslizamiento de cobertura fuera de la gota de reacción en RT usando un tamaño de paso z de 150 nm.

6. Cuantificación del emparejamiento intermolecular de bases

1. Importar imágenes en el software de análisis^{de imágenes 21}. Identificar los canales de GFP (DFHBI-1T) y Cy5 (ARN).
2. Dibuja un ROI de 5 × 5 píxeles dentro de un clúster de ARN y mide la densidad integrada para ambos canales en el mismo plano z. Selecciona entre 5 y 8 ROI de diferentes agrupaciones de ARN en cada imagen.
   NOTA: Ajusta el tamaño del ROI según la configuración de la cámara, pero mantén la coherencia entre los experimentos.
3. Seleccione 5–8 ROIs fuera de la gota de reacción para la medición de fondo y calcule la densidad integrada media para ambos canales.
4. Calcula la intensidad normalizada de DFHBI-1T para cada ROI usando:
   

7. Problemas comunes y solución de problemas

1. Si no se observa ningún pellet de ARN tras la centrifugación, considera la degradación del ARN, el tiempo de transcripción insuficiente, la polimerasa inactiva, sales residuales o una baja concentración de ARN. Utiliza reactivos libres de RNasa, amplía el tiempo de transcripción, usa enzimas frescas y purifica plantillas.
2. Si no se observan agrupaciones de ARN marcadas con Cy5, considere la degradación del ARN o la degradación de PEG 8000 o UTP-Cy5. Utiliza reactivos frescos y condiciones libres de RNasa.
3. Si no se observa señal de DFHBI-1T bajo condiciones de co-plegamiento, se consideren mala calidad del colorante, falta de formación de estructuras brócoles o transcritos truncados. Utiliza tinte fresco, asegúrate de la composición adecuada del tampón y verifica el tamaño del transcrito mediante análisis en gel.
4. Si la señal de fluorescencia se blanquea, reduce la potencia del láser y el tiempo de exposición, minimiza los pasos de imagen y protege las muestras de la luz durante la incubación.

Results

En este experimento demostrativo, se evaluó primero la capacidad de los reporteros de ARN superior e inferior para emparejar bases y formar la estructura del brócoli utilizando el protocolo de agrupamiento de ARN in ^{vitro 4} descrito anteriormente. El emparejamiento de bases entre la parte superior e inferior genera dos brazos de brócoli, cada uno capaz de intercalar una molécula DFHBI-1T (Figuras 1A–C)^18,22.

Tras la inducción del agrupamiento de ARN con espermina y PEG 8000, ambos ARN formaron racimos individualmente o juntos (Figuras 1D–Eii). Cuando se examinaron los ARN superior o inferior en aislamiento, la fluorescencia de DFHBI-1T dentro de los grupos de ARN fue sustancialmente menor que en la condición de co-plegamiento, en la que los dos ARN se combinaron antes de la desnaturalización y replegue térmicos (Figura 1F). En la condición de co-plegamiento, se estimó que la proporción molar de DFHBI-1T (0,1 mM) respecto a la parte superior (0,8 μM) y la base (0,8 μM) era de 125:1:1. Esto corresponde a un exceso de DFHBI-1T de aproximadamente 62,5 veces en comparación con el número máximo de posibles estructuras brócoli.

La señal baja pero distinta de cero de DFHBI-1T observada solo para la parte superior e inferior es coherente con informes previos que mostraron una fluorescencia mínima de DFHBI-1T cuando cada reportero se expresa^{individualmente como 18}. DFHBI-1T también mostró una fluorescencia de fondo muy baja pero detectable en ausencia de ARN (Figura 1F). En conjunto, estos resultados demuestran que DFHBI-1T es compatible con el ensayo in vitro de agrupamiento de ARN y que el co-plegamiento mejora el apareamiento intermolecular de bases entre los ARN superior e inferior .

Tras la normalización a intensidad de ARN, la intensidad de fluorescencia normalizada de DFHBI-1T en la condición de co-plegamiento alcanzó 1,03, lo que fue significativamente mayor que la de la parte superior e inferior (0,054 y 0,023, respectivamente) (Figura 1D, Figura 1Ei y Figura 1F). Luego se examinaron los grupos de ARN formados mezclando ARN superior e inferior que se plegaban por separado antes de la agrupación (Figura 1D, Figura 1Eii y Figura 1F). En esta condición de plegamiento separado, la señal normalizada de DFHBI-1T fue de 0,031, comparable a los niveles de referencia observados en los controles negativos (solo arriba o abajo ) (Figura 1F). Estos resultados indican que el co-plegamiento favorece el apareamiento intermolecular de bases entre los ARN superior e inferior , mientras que el plegamiento separado restringe tales interacciones.

Las secuencias superior e inferior se insertaron después en la región no traducida (UTR) 3′ del apagado (shu) de Drosophila melanogaster, un ARNm germinal ^4,23,24 y su contraparte antisentido (shu^anti). El shu 3′ UTR fue seleccionado porque trabajos previos demostraron que este ARN existe predominantemente como monómero en Drosophila melanogaster y no se dimeriza ni siquiera a altas concentraciones molares en los ensayos de gel^{de ARN 4,24}. Además, shu-top y shu-bottom no forman homodímeros en los geles^{de ARN 4}, lo que permite una evaluación más directa de las interacciones intermoleculares entre top y bottom y la influencia de secuencias de flanqueo derivadas del shu.
Las plantillas de ADN para shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} y shu^anti-bottom se enumeran en la Tabla 2. Las secuencias superior e inferior se insertaron en el centro del shu o ^{shu anti} 3′ UTR, requiriendo remodelación estructural para facilitar la interacción y imitar mejor las interacciones fisiológicas ARN–ARN, en las que las regiones interactuantes suelen estar incrustadas dentro de los^{transcritos 4}.

Al inducir el agrupamiento de ARN, shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} y ^{shu anti-bottom} mostraron individualmente una fluorescencia mínima de DFHBI-1T, similar a la de top y bottom solos (Figuras 2A y 2B). De forma consistente, el co-plegado de shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con shu^anti-bottom producía una señal DFHBI-1T mayor que el plegado separado (Figuras 2Ci y Cii). Tras la normalización a controles de intensidad de ARN y negativos (definidos como la señal media normalizada de DFHBI-1T de cada ARN por separado), el co-plegamiento de shu-top y shu-bottom resultó en un aumento de 5,63 veces en la fluorescencia normalizada de DFHBI-1T (Figuras 2Di y 2Dii). En contraste, el plegamiento separado mostró solo un aumento de 1,04 veces, comparable a los niveles basales observados individualmente para shu-top y shu-bottom. Se observaron tendencias similares para ^{shu anti-top} y ^{shu anti-bottom} bajo condiciones de co-plegado y plegado separado (Figuras 2Di y 2Dii). Estos resultados indican que el plegamiento separado no promueve el emparejamiento intermolecular de bases entre shu-top y shu-bottom ni shu^anti-top y shu^anti-bottom, mientras que el co-plegamiento potencia estas interacciones, probablemente debido a las secuencias reporteras insertadas.

Para comprobar si el par base shu y ^{shu anti-can}, se mezcló shu-top con shu^anti-bottom, y shu^anti-top se mezcló con shu-bottom. Ambas combinaciones mostraron una fluorescencia DFHBI-1T más alta tanto bajo co-plegamiento como en condiciones de plegamiento separado en comparación con shu-top con shu-bottom o ^{shu anti-top} con ^{shu anti-bottom} (Figuras 2Ci y 2Cii). Tras la normalización, el co-plegamiento de shu-top con ^{shu anti-bottom} y shu^anti-top con shu-bottom resultó en aumentos de 61,86 y 82,60 veces en la fluorescencia de DFHBI-1T, respectivamente (Figuras 2Di y 2Dii). En cambio, el plegamiento separado solo produjo aumentos de 2,69 y 4,94 veces, respectivamente (Figuras 2Di y 2Dii). Aunque sustancialmente más bajos que bajo condiciones de co-plegamiento, estos valores fueron mayores que los observados para shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con ^{shu anti-bottom} (1,04 y 1,16, respectivamente).

En conjunto, estos resultados indican que los reporteros que llevan secuencias complementarias adicionales tienen una mayor capacidad para emparejar bases que aquellos que no disponen de tales secuencias. Este efecto se potencia aún más bajo la condición de co-plegamiento, que promueve interacciones intermoleculares.

Figura 1: Estructuras secundarias predichas de ARN superior e inferior y cuantificación de su emparejamiento intermolecular de bases en clústeres de ARN in vitro. (A–B) Ejemplos de estructuras secundarias de la parte superior (A) y la inferior (B) se plegaban individualmente, tal como predijo el^{RNAfold 25}. Cuando se pliegan por separado, la parte superior e inferior no reconstituyen el aptámero del brócoli, y DFHBI-1T (estrella gris) produce una fluorescencia mínima. (C) Ejemplo de la estructura secundaria de ARN superior e inferior emparejados con bases, tal como lo predijo RNAcofold²⁵. El emparejamiento intermolecular de bases entre ambos ARN reconstituye dos brazos de^{brócoli 18}, permitiendo la unión a DFHBI-1T y resultando en una fuerte fluorescencia verde (estrellas verdes). (D) Imágenes de DFHBI-1T solo (control solo con colorante) y de racimos de ARN in vitro (magenta) formados por ARN superior e inferior en presencia de DFHBI-1T (verde). (Ei, ii) Agrupaciones de ARN in vitro (magenta) formadas por ARN superior e inferior bajo condiciones de co-plegamiento (i) y plegamiento separado (ii) en presencia de DFHBI-1T (verde). En los paneles D y E, los ARN se marcaron con Cy5 de modo que, de media, aproximadamente un tercio de los ARN contienen un solo uracilo marcado con Cy5, mientras que los dos tercios restantes no están marcados. Las imágenes representan proyecciones Z promedio de 27 cortes adquiridas con un paso de 150 nm, utilizando la misma exposición y potencia láser para cada canal en todas las condiciones. La fluorescencia de DFHBI-1T se normalizó al mismo rango de intensidad en distintas condiciones. Barras de escala: 2 μm. (F) La intensidad de DFHBI-1T se normalizó a abundancia de ARN, medida por fluorescencia Cy5. Los datos se presentan como media ± SEM. Valores p para la prueba t de dos colas (**** vs. co-plegamiento): 1,0 × 10⁻²² (solo con tinte), 2,3 × 10⁻²² (arriba), 4,9 × 10⁻²³ (abajo) y 7,0 × 10⁻²³ (plegado separado). n = 30 regiones para la condición de solo colorante y 30–31 agrupaciones de ARN para todas las demás condiciones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas y cuantificación del emparejamiento de bases intermoleculares para reporteros antiportadores de shu y shu superior e inferior. (A) Imágenes de DFHBI-1T solo (control solo con colorante) y clusters de ARN in vitro (magenta) formados por ARN shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} y shu^anti-bottom en presencia de DFHBI-1T (verde). Los ARN se marcaron con Cy5 de tal manera que, de media, se incorporaron tres uracilos UTP-Cy5 durante la transcripción in vitro. Las imágenes representan proyecciones Z promedio de 27 cortes adquiridas con un paso de 150 nm, utilizando la misma exposición y potencia láser para cada canal en todas las condiciones. La fluorescencia de DFHBI-1T se normalizó al mismo rango de intensidad en distintas condiciones. Barras de escala: 2 μm. (B) La intensidad de DFHBI-1T se normalizó a abundancia de ARN, medida por fluorescencia Cy5. Los datos se presentan como media ± SEM. n.s., no significativos. Valores p para la prueba t bilateral (vs. solo con colorante): 3,1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (n.s.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; Shu anti-top), y 2,2 × 10⁻² (; Shu^Anti-Bottom). n = 30 regiones para la condición solo de colorante y 30–32 agrupaciones de ARN para todas las demás condiciones. (Ci, ii) Imágenes de cúmulos de ARN in vitro (magenta) formados mezclando shu-top con shu-bottom, shu^anti-top con shu^anti-bottom, shu-top con ^{shu anti-bottom} y shu^anti-top con shu-bottom en presencia de DFHBI-1T (verde) bajo co-plegado (i) y plegado separado ( ii) condiciones. Las imágenes representan proyecciones Z promedio de 27 cortes adquiridas con un paso de 150 nm, utilizando la misma exposición y potencia láser para cada canal en todas las condiciones. Para el rango bajo, la fluorescencia DFHBI-1T se normalizó al mismo rango de intensidad que la Figura 1D–Eii y la Figura 2A. Para el rango alto, la fluorescencia de DFHBI-1T se normalizó a un rango de intensidad mayor pero constante en todas las condiciones en los paneles Ci y Cii. Barras de escala: 2 μm. (Di, ii) La intensidad de DFHBI-1T se normalizó primero a intensidad de ARN y luego a controles negativos, definidos como la señal media normalizada de DFHBI-1T de cada ARN por separado. Los datos se presentan como media ± SEM. n.s., no significativos. (i) Valores p para la prueba t de dos colas (**** vs. shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (shu^anti-top + ^{shu anti-bottom}), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + ^{shu anti-bottom}) y 4,3 × 10⁻²⁷ (^{shu anti-top} + shu-bottom). (ii) valores p para la prueba t de dos colas (frente a shu-top + shu-bottom): 2,2 × 10⁻¹ (s.s.; shu anti-top + shu anti-bottom), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + ^{shu anti-bottom}), y 1,3 × 10⁻¹⁵ (; shu anti-top + shu-bottom). n = 29–32 agrupaciones de ARN para todas las condiciones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Nombre	Secuencias (5′-3′)
Promotor T7	TAATACGACTCACTATAG
arriba	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
Abajo	GGATCCCCCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Delantero top-T7	TAATACGACTCACTATAG GGATGGAGACGGTCG
Reversa superior	ATCCGCATCATCCCCCCCC
Delantero de la parte baja T7	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Reverso inferior	GGATGATGGAGCCCACACT
Los cebadores frontales contienen un sobresaliente de secuencia promotora T7 (en negrita), seguido de secuencias dirigidas al extremo 5′ del ARN.

Tabla 1: Secuencias de promotores de T7, reporteros de brócoli divididos y cebadores usados para amplificar plantillas de ADN para la transcripción de T7. Los cebadores listados se utilizaron para generar plantillas de ADN para la transcripción in vitro de los ARN superior e inferior , que posteriormente se emplearon en ensayos de agrupamiento de ARN descritos en este estudio.

Nombre	Secuencias (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATTATTCATCATCATCATCATTACTAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACTTAAGTTTTTTTAAAAAACCACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCCCAGTATTTCATTATTCATTATTCATCATCAAAAAGGATCCCCCCCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTCAACCCACATACTCTG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTATTTTTTGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTATTTAGAGCAACGTAGACCCTTAAGTTTTTTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGTGTCATTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATATGAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGTGTCATTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTTTT GGATCCGCCATCATCTGTCGAGTAGTGTGTGCTCTTGCGTGTGTGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGGGCTCATCATCCTTTTTTTGAGTAA GATATGAAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
shu-top o shu-bottom-delantero T7	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
Shu-top o shu-bottom-Reverso	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanti-top o shu anti-bottom-T7 forward	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanti-Top o shuAnti-bottom-Reverso	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Los cebadores frontales contienen un sobresaliente de secuencia promotora T7 (en negrita), seguido de secuencias dirigidas al extremo 5′ del ARN. Se incluyeron uno o dos G adicionales entre el promotor T7 y shu-top y shu-bottom oshu anti-top y shuanti-bottom, respectivamente. Esto se debe a que tener Gs en las posiciones +2 y +3 puede aumentar significativamente el rendimiento detranscripción 19. Sin embargo, estas G adicionales pueden afectar potencialmente la interpretación del emparejamiento de bases en los constructos diseñados. Véase la nota en el paso 1.1.

Tabla 2: Secuencias de shu-top, shu-bottom, ^shu anti-top, ^{shu anti-bottom} y cebadores usados para amplificar plantillas de ADN para la transcripción T7. Los cebadores listados se utilizaron para generar plantillas de ADN para la transcripción in vitro de antiARN shu y shu que transportan los reporteros superior e inferior, que posteriormente se emplearon en ensayos de agrupamiento de ARN descritos en este estudio.

Discussion

En este estudio, el sistema de aptámero de brócoli^{dividido 18} fue adaptado para la visualización directa y cuantificación del apareamiento intermolecular de bases bajo condiciones in vitro de agrupamiento de ARN. Este enfoque permite evaluar el apareamiento intermolecular de bases a través de diferentes condiciones in vitro y complementa ensayos bioquímicos posteriores, como experimentos de arrastre de ARN usando reticuladores de emparejamiento^{de bases 15,16,17} y electroforesis^{en gel 4,6,7}. A diferencia de estos métodos bioquímicos, que carecen de la resolución espacial necesaria para distinguir el emparejamiento de bases dentro de los cúmulos de ARN del que ocurre fuera de ellos, este enfoque permite la visualización espacial directa de estas interacciones dentro de los conglomerados. Específicamente, permite monitorizar el emparejamiento de bases entre ARN superior e inferior, o ARN que portan estos reporteros, bajo condiciones definidas de agrupamiento de ARN. Además, proporciona una lectura cuantitativa y en tiempo real del emparejamiento de bases entre ARN reporteros sin requerir reticulación cruzada ni extracción de ARN, minimizando así la pérdida de muestras e incompatibilidad del búfer.

Mediante microscopía de fluorescencia, se midió cuantitativamente el emparejamiento intermolecular de bases entre las secuencias de aptámeros de brócoli divididos mediante la señal DFHBI-1T, demostrando la compatibilidad de DFHBI-1T con el protocolo de agrupamiento de ARN in vitro . El grado de emparejamiento de bases intermoleculares varió según las condiciones de plegamiento del ARN, como se observa bajo condiciones de co-plegamiento y plegamiento separado (Figura 1F y Figura 2Di–2Dii). Estos hallazgos indican que las condiciones de plegamiento del ARN influyen críticamente en las interacciones intermoleculares del ARN y deben considerarse cuidadosamente al interpretar los resultados experimentales.

Este ensayo también proporciona una plataforma para evaluar si las secuencias que flanquean los reporteros superior e inferior mejoran el emparejamiento de bases intermoleculares, como se demuestra usando shu. La fluorescencia de DFHBI-1T fue mayor para shu-top con ^{shu anti-bottom} y shu^anti-top con shu-bottom que para shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con ^{shu anti-bottom}, lo que indica que interacciones intermoleculares involucran shu y ^{shu anti} potencian aún más la señal de Brócoli. Estas observaciones sugieren que la señal de fluorescencia DFHBI-1T obtenida solo por el co-plegamiento de los reporteros superior e inferior no representa el límite superior del ensayo.

La fluorescencia de DFHBI-1T medida en estos experimentos abarcó un amplio rango dinámico, desde un aumento de 1,04 veces (shu-top con shu-bottom bajo plegado separado) hasta un aumento de 82,60 veces (^{shu anti-top} con shu-bottom bajo condiciones de co-plegamiento). Este rango dinámico permite la detección de diferencias en las interacciones de ARN intermolecular entre los ARN que portan estos reporteros.

Varios pasos de este protocolo son fundamentales para la detección exitosa del apareamiento de bases de ARN intermolecular entre ARN superior e inferior divididos en los grupos de ARN. Se deben usar alicotas frescas de PEG 8000 para inducir de forma fiable el agrupamiento de ARN, y los ciclos repetidos de congelación-deshielo deben minimizarse debido a la inestabilidad de los reactivos. DFHBI-1T debe ser alicitado y almacenado a −20 °C para preservar las propiedades de fluorescencia. Los productos de transcripción in vitro deben analizarse en un gel de ARN desnaturalizante antes de agruparse para confirmar el tamaño correcto del transcrito. Además, mantener condiciones libres de RNasa, incluyendo un entorno de trabajo limpio y una cámara de imagen, es esencial porque las gotas de ARN se incuban a temperatura ambiente durante largos periodos antes de la imagen.

Una limitación de este ensayo es que DFHBI-1T informa específicamente de emparejamientos intermoleculares de bases mediados por las secuencias superior e inferior. No pueden detectarse otros eventos de apareamiento de bases intermoleculares que ocurren en diferentes regiones de ARN. Además, la estructura de brócoli formada por el apareamiento de bases entre las hebras superior e inferior es termodinámicamente^{estable 26} y puede no reflejar completamente interacciones más débiles o transitorias, como las formadas por bases dispersas expuestas en la superficie, como se observó^{en los grupos} 4 de ARNm germinal de Drosophila.

Además, las interacciones intermoleculares ARN–ARN pueden ser promiscuas e inespecíficas, y las secuencias que flanquean los reporteros superior e inferior pueden influir en la fluorescencia de DFHBI-1T. Estas regiones flanqueantes pueden interactuar directamente con las secuencias reporteras, inhibiendo la formación de brócoli o alterando la estructura del ARN, afectando así las interacciones entre ARN que transportan a los reporteros. En consecuencia, el ensayo refleja los efectos combinados de la estructura del ARN, el emparejamiento de bases arriba–abajo , las interacciones entre secuencias flanqueadoras y las interacciones entre las secuencias flanqueadoras y los reporteros.

Este ensayo ofrece oportunidades para futuras investigaciones. Por ejemplo, alterar secuencias de ARN que flanquean a los reporteros, introducir helicases o chaperonas de ARN, o modificar las condiciones salinas puede influir en el emparejamiento de bases intermoleculares en los cúmulos de ARN. Estos efectos pueden evaluarse midiendo la señal DFHBI-1T bajo condiciones de co-plegamiento y plegamiento separado. Dado que apámeros de ARN similares se han utilizado en células, bacterias y^levaduras 26,27,28,29,30, este enfoque puede extenderse a sistemas celulocelulares o organismos modelo para examinar el emparejamiento intermolecular de bases en clústeres de ARNm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Un niño con MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Usado para la preparación de 10 y veces; Amortiguador de replegamiento de ARN.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	AM9640G	Usado para la preparación de 10 y veces; Amortiguador de replegamiento de ARN.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Componente del kit de ligasa de ARN T4; se usó como reactivo de apiñamiento molecular para inducir el agrupamiento de ARN. & nbsp;
Etanol absoluto, 200 proof	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	T038181000CS	Utilizado para la preparación del tampón de lavado de ARN.
Ácido fenol:cloroformo, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	AM9722	Se usa para la purificación de ARN.
Aminoalil-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Se utiliza para el marcaje de ARN durante la transcripción in vitro.
Tapa de cristal con cámara	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Cámara de imagen para reacciones de agrupamiento de ARN.
Cloroformo	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	C298-500	Se usa para la purificación de ARN.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Utilizado como fluoróforo para la detección de aptámeros de ARN brócoli.
DMSO	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	D12345	anhidro; grado en biología molecular; utilizado para la preparación del DFHBI-1T.
ADN Limpio y Kit de concentrador	Zymo	D4014	Se utiliza para la limpieza de productos de ADN antes de la transcripción de T7.
Kit de extracción de gel de ADN	NEB	T1020L	Se usa para extracción de gel.
Baño seco	Benchmark Scientific	BSH1001	Utilizado para calentar muestras de ARN en tubos de microcentrífuga.
FIJI/ImageJ	NIH (Institutos Nacionales de Salud)	N/A	software de análisis de imágenes de código abierto; utilizado para la cuantificación de la intensidad de fluorescencia y el análisis de ROI.
Sistema de electroforesis en gel	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Se usa para hacer electroforesis en gel de ADN.
Tinte de carga en gel, morado (6 y más veces)	NEB	B7024S	Se utiliza como colorante de carga para la electroforesis en gel de ADN.
Microscopio de iluminación estructurada instantánea	VisiTech internacional	VT-iSIM	Un microscopio confocal capaz de obtener imágenes de fluorescencia GFP y Cy5.
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	327272500	Se usa para la purificación de ARN.
Kit de transcripción MEGAscript T7	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	AM1334	Usado para transcripción in vitro de T7. El kit incluye soluciones de nucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP) y DNasa.
Tubos microcentrífugas	Genesee Scientific	22-284	tubo de 1,5 mL; utilizado para almacenar plantillas de ADN para transcripción in vitro, productos de ARN y alícuotas de espertina y DFHBI-1T.
Mini centrífuga	Benchmark Scientific	Z763845	Se usa para centrifugación breve.
Espectrofotómetro Nanodrop One	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Espectrofotómetro de microvolumen para medir la concentración y calidad del ADN y ARN.
Agua libre de nucleasa y nbsp;	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	AM9937	Se utiliza para la resuspensión de bolitas de ARN, preparación de lavado de ARN y buffers de replegamiento, y dilución de espermina y DFHBI-1T.
Calculadora de masa molar online	Biolabs de Nueva Inglaterra (NEB)	N/A	Herramienta online utilizada para calcular la masa de ARN a partir de la cantidad molar (por ejemplo, pmol).
Tubos de PCR de polipropileno	Corning	3745	200 & mu; Tubos de L PCR utilizados para PCR, transcripción in vitro y reacciones de agrupamiento de ARN
Fuente de alimentación básica PowerPac	Bio-rad	1645050	Se usa para hacer electroforesis en gel de ADN.
Ciclador térmico Proflex PCR	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Utilizado para PCR, transcripción in vitro y calentamiento de muestras de ARN en tubos de PCR.
Q5 Alta Fidelidad 2 veces; Master Mix	NEB	M0492S	Usado como 2 veces; Mezcla maestra de alta fidelidad.
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5424R	Utilizado para purificación y pelleteo de ARN.
Solución de descontaminación de RNasa	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	AM9782	Se utiliza para limpiar bancos de laboratorio y superficies para minimizar la contaminación por RNasa.
Espermina  tetrahidrocloruro	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Se utiliza para inducir el agrupamiento de ARN.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Utilizado para la preparación del tampón Tris (pH 7,0).
Agarosa ultrapura	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	16500500	Utilizado para electroforesis en gel de ADN.