Este protocolo presenta un flujo de trabajo eficiente para la microscopía de localización de moléculas individuales de núcleos aislados de Arabidopsis, utilizando aislamiento, fijación y marcaje optimizados para lograr una visualización nanométrica fiable de la cromatina y la ARN polimerasa II. Este enfoque puede adaptarse fácilmente a otras proteínas asociadas a la cromatina o modificaciones de histonas para imágenes de alta resolución.
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Artículo de método
Un protocolo simplificado para microscopía de localización de molécula única en núcleos de Arabidopsis
En este artículo
Resumen
Resumen
Aunque la microscopía de fluorescencia confocal ha proporcionado valiosas perspectivas sobre la organización de la cromatina en núcleos vegetales, su resolución limitada por difracción limita la investigación de la arquitectura de la cromatina, lo que motiva el uso de técnicas de superresolución como la Microscopía de Localización de Molécula Única (SMLM). Entre estos enfoques, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) proporciona resolución a nanoescala en células individuales, permitiendo la visualización precisa de dominios de cromatina, modificaciones de histonas y organización nuclear. Aunque estos métodos se aplican cada vez más en sistemas de mamíferos, su uso en biología vegetal sigue siendo limitado, en gran parte debido a desafíos técnicos en la preparación de muestras.
Aquí presentamos un flujo de trabajo simplificado y reproducible para la imagen SMLM de núcleos aislados de Arabidopsis thaliana. Este protocolo comienza con la fijación de las plántulas para preservar la morfología nuclear, seguida de un corte suave de tejidos y centrifugación para enriquecer núcleos intactos. Los núcleos aislados se marcan luego con fluoróforo en medio líquido e inmovilizan en almohadillas de agarosa de baja fusión, una estrategia que mejora la estabilidad durante sesiones prolongadas de imagen con molécula única. Estos pasos minimizan colectivamente la fluorescencia de fondo, mejoran la consistencia del marcaje y aumentan la reproducibilidad entre réplicas biológicas.
Las preparaciones resultantes proporcionan una mayor claridad para visualizar modificaciones de la cromatina y la arquitectura nuclear en plantas. Al reducir las barreras técnicas para implementar la imagen SMLM en Arabidopsis, este protocolo proporciona un medio versátil para investigar la regulación epigenética, la organización de la cromatina y las variaciones topológicas nucleares a nanoescala. Este trabajo establece una base metodológica para aplicar la SMLM a las plantas, cerrando la brecha con la biología celular de mamíferos y abriendo nuevas oportunidades para estudiar cómo la arquitectura nuclear contribuye a la regulación genómica en respuesta a señales de desarrollo y ambientales en los sistemas vegetales.
Introducción
La microscopía ha sido durante mucho tiempo una piedra angular para estudiar la organización de la cromatina y la arquitectura nuclear, revelando cómo el ADN y las proteínas asociadas a histonas se organizan en el espacio nuclear 3D y afectan la regulacióngénica 1,2. La microscopía de fluorescencia convencional ha proporcionado valiosos conocimientos sobre dominios de cromatina a gran escala como territorios cromosómicos, cromocentros y cuerposnucleares 3,4, factibles in situ, en particular en tejidos radiculares de plantas 3,5,6. Sin embargo, estas técnicas están fundamentalmente limitadas por la barrera de difracción de la luz, restringiendo la resolución espacial a aproximadamente 200 nm lateralmente y 500 nmaxialmente 7. Esta limitación oculta los detalles a escala nanométrica del plegamiento de la cromatina, los patrones de modificación de las histonas y la compartimentación transcripcional que subyacen a la regulación epigenética. Para superar esta barrera, se desarrollaron enfoques de microscopía de superresolución (SRM) como la microscopía de iluminación estructurada (SIM)8, la depleción de emisión estimulada (STED)9,10 y la microscopía de localización de molécula única (SMLM)11,12, que alcanzaron resoluciones que van desde 100 nm hasta unos pocosnm 13.
Entre las técnicas de SRM, el SMLM —incluyendo la Microscopía de Localización Fotoactivada (PALM)13 y la Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica Directa (dSTORM)— ofrece una resolución espacial excepcional combinada con especificidadmolecular 14. Al detectar las posiciones de fluoróforos individuales a lo largo del tiempo, SMLM reconstruye imágenes de alta precisión a nanoescala de dominios de cromatina, marcas de histonas y estructuras nucleares en célulasindividuales 15,16. Esta capacidad ha transformado la investigación sobre la cromatina en sistemas de mamíferos, donde el SMLM se ha aplicado para visualizar el agrupamiento de nucleosomas, la compactación de la cromatina y los patrones de modificación de histonas con un detalle sinprecedentes 15,16,17. En cambio, la aplicación de SMLM a núcleos vegetales sigue siendo limitada, en gran parte debido a desafíos técnicos asociados a las propiedades del tejido vegetal, como alta autofluorescencia, rigidez de la pared celular y la presencia de compuestos dispersores de luz como el almidón yla clorofila 18. Además, la naturaleza delicada de los núcleos durante el aislamiento y el marcado requiere flujos de trabajo optimizados para mantener la integridad estructural y minimizar la fluorescencia de fondo durante sesiones prolongadas de imagen.
El protocolo descrito aquí fue desarrollado originalmente por Elizabeth Kracik-Dyer y Célia Baroux para la microscopía de depleción de emisión estimulada (STED) 19. Posteriormente fue optimizado y adaptado para satisfacer los requisitos específicos de la imagen STORM con la integración de conocimientos procedentes de aplicaciones de microbiologíapublicadas 20,21,22. El objetivo general es proporcionar un flujo de trabajo optimizado y reproducible para la imagen de SMLM de núcleos aislados de Arabidopsis thaliana. Al integrar fijación optimizada, suave alteración mecánica y marcaje con fluoróforos en suspensión, este método preserva la morfología nuclear mientras elimina eficientemente contaminantes citoplasmáticos que a menudo comprometen la calidad de imagen. La inmovilización de núcleos marcados en almohadillas de agarosa de baja fusión garantiza estabilidad mecánica durante la adquisición, permitiendo la obtención de imágenes a largo plazo de molécula única a nanoescala. En comparación con los protocolos SRM descritos anteriormente para núcleos de plantas—especialmente los basados en la microscopíaSTED 19,23—este flujo de trabajo utiliza fluoróforos fotoconmutables (por ejemplo, AF647, JF549), y reduce la fluorescencia de fondo gracias a pasos de lavado que eliminan clorofila y residuos tisulares, y mejora la homogeneidad del marcaje añadiendo las moléculas de marcaje directamente a los núcleos fijos y permeabilizados. En consecuencia, permite una visualización consistente de modificaciones de la cromatina, compartimentos nucleares y patrones epigenéticos en núcleos individuales. Al reducir las barreras técnicas para implementar la SMLM en plantas, este método amplía el acceso a la imagen a escala nanométrica y proporciona una base para estudiar cómo la organización de la cromatina y la arquitectura nuclear contribuyen a la regulación génica en respuesta a señales de desarrollo y medioambientales.
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Protocolo
NOTA: La información detallada sobre los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo está disponible en la Tabla de Materiales. Salvo que se especifique lo contrario, los tampones se eliminan en filtros apirogénicos de 0,2 μm. Se utiliza H2O ultrapuro destilado doble (ddH 2O) en todo este protocolo. Los pasos de centrifugación se realizan en microtubos de 1,5 mL utilizando un rotor de ángulo fijo.
1. Fijación de las plántulas y liberación de núcleos
- Coloque una placa de cultivo de 6 pozos sobre hielo bajo la campana extractora, y luego añada a cada pozo aproximadamente 4 mL de solución de fijación fría preparada extemporáneamente bajo una campana extractora (formaldehído estabilizado con metanol al 4% (v/v), 0,1% Triton X-100 en 1× solución salina tamponada con fosfato [PBS]).
- Utilizando pinzas limpias, retira las plántulas (entre 8 y 15 días después de la germinación) que han sido cultivadas en sales sólidas (0,8% agar) de media concentración de Murashige y Skoog Medium 2,2 g/L, 1% de sacarosa (p/v), pH 5,7, tal como se describe para plántulas de EM en la referencia24, y sumergérselas inmediatamente en la solución de fijación. Utilizar un pozo para aproximadamente 20 plántulas (fueron necesarios 3 pozos para obtener suficiente material por muestra).
- Coloca la placa en la cámara de vacío llena de hielo y aplica un vacío a presiones que oscilan entre 0,2 bar y 0,8 bar durante 15 minutos para eliminar el aire atrapado y permitir una penetración profunda del fijador en los tejidos de laplanta 25. Suelta el vacío lentamente, remueve la muestra y luego aplica el vacío durante otros 15 minutos.
- Bajo la campana extractora, retira la solución de fijación con una pipeta y lava cada pozo 3 veces durante 10 minutos con una agitación suave, usando 5 mL de PBS bien frío.
- Retira PBS y utiliza pinzas para transferir el tejido fijo a una placa de Petri de 120 mm × 120 mm. Añadir a las plántulas fijas 50 μL de Buffer de Aislamiento de Núcleos (NIB), preparado según lo descrito por Kracik-Dyer y Baroux (45 mMMgCl 2, 20 mM MOPS, 30 mM citrato de sodio, 0,3% Triton X-100). Ajusta a pH 7 usando 1 N HCl)19. Chipa con una cuchilla.
NOTA: Las cuchillas Microtome resultaron ser más eficientes que las cuchillas convencionales para esta tarea. - Raspa el tejido picado en un borde de la placa de Petri con la misma hoja y añade 600 μL de nib, asegurándote de quitar también cualquier tejido pegado a la hoja.
- Transfiere la suspensión de tejido al tubo homogeneizador Dounce de 2 mL y acaricia 5–10 veces con el mortero más pequeño, y luego con el más grande hasta que se mueva suavemente dentro del tubo (normalmente se requieren 5–10 movimientos).
- Filtrar la muestra homogeneizada resultante a través de un filtro de malla de 30 μm hasta un microtubo de 1,5 mL.
- Centrifuga la suspensión durante 10 minutos a 800 × g usando la rampa más baja tanto para la aceleración como para la desaceleración. Un pequeño pellet blanco es visible entre los restos de tejido verde.
- Desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 150 μL de NIB.
- Centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 800 × g y retira el sobrenadante. Si hay algún residuo verde visible, lávate una segunda vez. Resuspende en 50 μL a 150 μL de NIB, según el tamaño del proyectil.
- Almacenar la suspensión de núcleos aislados resultante a 4 °C durante un máximo de 1 semana antes de realizar la tinción. Sin embargo, se recomienda proceder inmediatamente.
2. (Inmuno)tinción
NOTA: En los siguientes pasos, el protocolo se aplica a un volumen de 50 μL de suspensión de núcleos, que corresponde típicamente a 20 plántulas. Salvo que se especifique, los siguientes pasos se realizan a temperatura ambiente.
- Centrifuga la solución durante 10 minutos a 800 × g y descarta el sobrenadante. Ten cuidado de no tocar el pellet.
- Resuspende los núcleos pipeteando suavemente 50 μL de buffer bloqueante (143 mM NaCl, 4% BSA en PBS, almacenado a 4 °C). Incuba durante 30 minutos con agitación suave.
- Centrifuga la solución durante 10 minutos a 800 × g y descarta el sobrenadante sin tocar la pelota de núcleos.
- Resuspende los núcleos pipeteando suavemente 50 μL de 1× PBS. Centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 800 × g. Descarta el sobrenadante como antes.
- Resuspender los núcleos en 50 μL de solución primaria de anticuerpos preparada en un tampón inmunotinzante compuesto por 143 mM de NaCl, 1% BSA y 0,05% Tween 20 en PBS (anticuerpos y diluciones de trabajo se detallan en la Tabla de Materiales). Incuba las muestras durante 60 minutos bajo una agitación suave.
- Procede con 2 lavados (repite los pasos 2.3 y 2.4).
- Resuspender los núcleos en 50 μL de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra AF647 a 1/200 dedilución 26. Envuelve los tubos en papel de aluminio para proteger el fluoróforo de la luz. Incuba los tubos durante 60 minutos con una agitación suave.
- Procede con 2 lavados (repite los pasos 2.3 y 2.4).
- Resuspende el pellet en 50 μL de NIB. Guarda la suspensión en microtubos de 1,5 mL envueltos en papel de aluminio. El marcado es estable durante varias semanas a 4 °C.
3. Montaje
- Para la imagen STORM, prepara una solución de agarosa de baja fusión (LMA 1,5% p/v) disolviendo el polvo en un tampón B de 1,25× compuesto por 50 mM de pH 8 Tris, 10 mM de NaCl, 10% de glucosa. Prepara 1,25× solución de fondo y guárdala a 4 °C.
- Calienta a 90 °C durante 1 minuto para disolver el polvo y obtener una solución clara. Enfría y mantiene la solución LMA fundida a 37 °C antes de pasar al siguiente paso para evitar la desnaturalización térmica del tampón de glucosa oxidasa (GLOX) (preparar 10x solución stock almacenada a -20°C compuesta por 100 mM de pH Tris 7,5, 25 mM de KCl, 1 mM de pH TCEP 7,0, 5 mg/mL de glucosa oxidasa, 0,4 mg/mL de Catalasa, 50% v/v glicerol).
- Cuando la solución LMA alcanza los 37 °C, se prepara el tampón STORM añadiendo 100 mM de Mercaptoetilamine (MEA) y GLOX a la solución LMA tibia para lograr 1× concentración final. Conserva la solución de stock de MEA 1 M hasta 1 mes a 4 °C, pero se recomienda usar una solución recién preparada. Mezcla suavemente.
NOTA: Para el marcaje opcional de ADN, añade 1,5 nM (concentración final, 1 mM de solución original en DMSO) del Hoechst conjugado JF549. Mantén la suspensión a 37 °C hasta el uso. - Mezcla suavemente la suspensión de núcleos con nanodiamantes a 1/1500 de dilución. Incubalos con la muestra durante 5 minutos.
NOTA: Los nanodiamantes sirven como marcadores fiduciales para corregir la deriva de la muestra. - Deposita 10 μL de la mezcla sobre un cobertor de 1,5 horas tratado con ozono (20 minutos en el sistema de limpieza con ozono ultravioleta) y espera 3 minutos para que los núcleos se depositen en el cobertor.
- Retira el exceso de líquido, espera 2 minutos. Añadir 10 μL del LMA preparado en el paso 3.3 al abrigo y cubrir inmediatamente con una lámina de microscopio.
- Sella la cubierta con sellador de silicona. Mezcla cantidades iguales de solución A y B en una pequeña placa de Petri usando una punta de micropipeta. Aplica la mezcla sobre los bordes del abrigo para sellar la muestra. El sellador de silicona se endurece en 5 minutos.
- Una vez montada, realizar imágenes de las láminas sin demora, finalmente en las siguientes 4–5 horas, para evitar la pérdida de las propiedades de absorción de oxígeno de la almohadilla.
4. Imagen
NOTA: Los parámetros de imagen deben optimizarse cuidadosamente según la naturaleza de la muestra, las propiedades fotofísicas de los fluoróforos y la configuración óptica del microscopio. Es fundamental asegurar una alta relación señal-ruido para cada fluoróforo, minimizando al mismo tiempo el sangrado espectral y la excitación cruzada entre canales fluorescentes. Las muestras se observaron con un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un objetivo de inmersión en aceite de alta NA 100x, una unidad de mantenimiento del foco y un LED blanco para imágenes en campo claro. Las etiquetas fluorescentes AlexaFluor647 (AF647) se excitaron a 640 nm y JF549-Hoechst a 561 nm. La luz emitida fue filtrada con un espejo dicróico compatible y un filtro pasa-banda, y finalmente se recogieron imágenes con una cámara científica Complementaria de Semiconductor de Óxido Metálico (sCMOS).
- Monta la lámina de muestra y encuentra el enfoque. Activa un módulo de mantenimiento de foco si el sistema tiene uno (muy recomendable para adquisiciones largas).
- Encuentra y céntrate en un núcleo. Es mejor tener uno o varios nanodiamantes cerca del núcleo de interés para corregir la deriva de forma más eficiente durante la reconstrucción.
- (Opcional) Capturar instantáneas limitadas por difracción del campo brillante y de cada canal fluorescente a baja potencia láser.
- Al realizar imágenes de dos colores, comienza con la adquisición del canal de longitud de onda más larga y luego cambia al canal de longitud de onda más corta (es decir, adquiere el canal AF647 antes de JF549).
NOTA: Ejemplo de parámetros de adquisición utilizados en este trabajo:
Canal A - etiquetado de epítopos - AF647
Tiempo de exposición: 20 ms
Intensidad láser: 640 nm – 2,2 kW/cm 2
Modo de excitación: HiLo27
Canal B - Marcado de ADN - JF549-Hoechst
Tiempo de exposición: 50 ms
Intensidad láser: 561 nm - 1 kW/cm 2
Modo excitación: Epi
Número de imágenes registradas: 10.000-30.000 por canal, asegurando que la densidad de fluoróforos por fotograma siga siendo lo suficientemente escasa para una localización precisa de molécula única, mientras que el número acumulado de localizaciones se determinó empíricamente usando la Calificación y Reporte de Ubicaciones de Error de Imágenes Cantativas de Superresolución (SQUIRREL)28, que también indica el número suficiente de fotogramas.
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Resultados
El protocolo descrito anteriormente permite la preparación de núcleos de Arabidopsis thaliana de alta calidad adecuados para SMLM. Se realizaron varias rondas de optimización para mejorar la integridad nuclear y reducir los residuos citoplasmáticos y celulares que comprometen la calidad de la imagen. Tras cada paso de optimización, la calidad de las preparaciones nucleares se evaluaba mediante imágenes confocales utilizando un microscopio de disco giratorio Olympus IX81 antes de...
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Discusión
La preparación de núcleos de Arabidopsis thaliana para la microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) requiere varios pasos críticos que influyen fuertemente en la calidad final de la muestra. Como se describióanteriormente, es esencial un corte de tejido exhaustivo y consistente para maximizar la recuperación de núcleos intactos. El uso de cuchillas de microtomo en lugar de cuchillas estándar produce un...
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Divulgaciones
Los autores declaran no haber conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Lavis Lab y al equipo de Open Chemistry de Janelia por proporcionar generosamente los tintes JF y JFX. También estamos agradecidos a Elizabeth Kracik-Dyer y Célia Baroux por compartir amablemente su protocolo, así como a Aline Probst y Guillermo Orsi por sus consejos tan útiles. La imagen óptica se realizó en la plataforma de imagen M4D del centro Instruct-ERIC de Grenoble (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) dentro de la Asociación de Grenoble para Biología Estructural, apoyada por la Infraestructura Francesa para Biología Estructural Integrada (ANR-10-INBS-0005-02) y la Alianza de Grenoble para la Biología Estructural y Celular Integrada, un proyecto de la escuela de posgrado de la Universidad de Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Agradecemos a Tip ten Brink por el paquete AnalyzeFRC Python desarrollado en el Departamento de Física de la Imagen (ImPhys), Facultad de Ciencias Aplicadas, TU Delft.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody | Abcam | ab5095 | Anticuerpo primario usado a una dilución de 1/200 en tampón de inmunocoloración para visualizar la forma activa de la polimerasa (Anticuerpo policlonal producido en conejo ) |
| Software de adquisición | Abbelight | NEO LiveImaging v2.18 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Certified Low Melting Agarose | Bio-Rad | 1613111 | |
| Coverslips thickness 1.5H round | Marienfeld | 117640 | Ø: 24 mm |
| D-(+)-Glucose, anhydrous, 99% | Thermo Scientific | A16828-36 | |
| Dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t1 | Espejo dicróico para separación de excitación/emisión |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´ | biowest | X0515 - 500 | Trabajar en condiciones estériles |
| Epredia Ultra Disposable Microtome Blades | FisherScientific | 12191830 | Bajo perfil, de un solo uso |
| Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | Falcon | 353046 | |
| Formaldehyde solution 37% | Carl Roth | 7398 | Trabajar bajo la campana de extracción |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Scientific | A32733TR | Utilizado a 1/200 como anticuerpo secundario acoplado a AF647 |
| Hoechst 33258 solution | Sigma-Aldrich | 94403 | Utilizado a 1/500 para contracolorear el ADN, añadido al almohadillado de agarosa |
| Hydrochloric Acid Solution | Chem-Lab | CL05.0311.1000 | |
| JF549-Hoechst | Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia) | JF549-Hoechst | Utilizado para contracolorear el ADN, añadido al almohadillado de agarosa a una concentración final de 1,5 nM |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Tubo de 2 mL con ambos pistillos de gran (0,0030-0,0050 pulgadas) y pequeño (0,0005-0,0025 pulgadas) espacio |
| Lasers unit | Oxxius | L6Cc | Equipado con seis láseres: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW y 730 nm - 30 mW |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | HN03 | |
| Mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| MOPS sodium salt 98% | Fisher Scientific SAS | 352590010 | |
| Multiband emission filter | Semrock | FF01-446/523/600/677 | Filtración de emisión multibanda para bloquear la luz dispersa del láser |
| Nanodiamonds | Adamas Nanotechnologies | NDNV100nmHiWGA2ml | Stock 1 mg/mL |
| ORCA-Fusion Digital CMOS camera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile | Greiner Bio-One | 664161 | Utilizado para cultivar plantas en medio 1/2 MS |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio-One | 688161 | Utilizado al cortar las plántulas de las plantas |
| pluriStrainer Mini cell strainer | pluriSelect | 43-10030-50 | Tamaño de malla 30 µm, adecuado para tubo Eppendorf de 1,5 mL |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Single band emission filter | Semrock | FF01-698/70 | Filtro de emisión específico para el canal AF647 |
| Single band emission filter | Chroma | ET600/50m | Filtro de emisión específico para el canal JF549 |
| Sodium chloride (99,5%) | Euromedex | 1112-A | |
| Star-Frost slides 76 x 26 mm | Knittel | VS112711FKB.01 | |
| Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone | ClearLine | 146560 | |
| Super-resolution system | Abbelight | SAFe360 | Olympus IX83 equipado con objetivo de inmersión en aceite 100x NA1.5 |
| Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole | Prolabo | PRO-33615.268 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000-B | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-B | |
| Twinsil Speed | Picodent | 13001002 | Sellador de silicona |
| Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven | UVOCS Inc. | T10X10 | Exposición de 20 minutos para limpieza de coverslips |
| Vacuum pump | Vacuubrand | VP 100C | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Scientific | Rotor TX-400 75003629. Centrifugación realizada con tubos Eppendorf. |
Referencias
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