Un protocolo simplificado para microscopía de localización de molécula única en núcleos de Arabidopsis

Summary

Este protocolo presenta un flujo de trabajo eficiente para la microscopía de localización de moléculas individuales de núcleos aislados de Arabidopsis, utilizando aislamiento, fijación y marcaje optimizados para lograr una visualización nanométrica fiable de la cromatina y la ARN polimerasa II. Este enfoque puede adaptarse fácilmente a otras proteínas asociadas a la cromatina o modificaciones de histonas para imágenes de alta resolución.

Abstract

Aunque la microscopía de fluorescencia confocal ha proporcionado valiosas perspectivas sobre la organización de la cromatina en núcleos vegetales, su resolución limitada por difracción limita la investigación de la arquitectura de la cromatina, lo que motiva el uso de técnicas de superresolución como la Microscopía de Localización de Molécula Única (SMLM). Entre estos enfoques, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) proporciona resolución a nanoescala en células individuales, permitiendo la visualización precisa de dominios de cromatina, modificaciones de histonas y organización nuclear. Aunque estos métodos se aplican cada vez más en sistemas de mamíferos, su uso en biología vegetal sigue siendo limitado, en gran parte debido a desafíos técnicos en la preparación de muestras.

Aquí presentamos un flujo de trabajo simplificado y reproducible para la imagen SMLM de núcleos aislados de Arabidopsis thaliana. Este protocolo comienza con la fijación de las plántulas para preservar la morfología nuclear, seguida de un corte suave de tejidos y centrifugación para enriquecer núcleos intactos. Los núcleos aislados se marcan luego con fluoróforo en medio líquido e inmovilizan en almohadillas de agarosa de baja fusión, una estrategia que mejora la estabilidad durante sesiones prolongadas de imagen con molécula única. Estos pasos minimizan colectivamente la fluorescencia de fondo, mejoran la consistencia del marcaje y aumentan la reproducibilidad entre réplicas biológicas.

Las preparaciones resultantes proporcionan una mayor claridad para visualizar modificaciones de la cromatina y la arquitectura nuclear en plantas. Al reducir las barreras técnicas para implementar la imagen SMLM en Arabidopsis, este protocolo proporciona un medio versátil para investigar la regulación epigenética, la organización de la cromatina y las variaciones topológicas nucleares a nanoescala. Este trabajo establece una base metodológica para aplicar la SMLM a las plantas, cerrando la brecha con la biología celular de mamíferos y abriendo nuevas oportunidades para estudiar cómo la arquitectura nuclear contribuye a la regulación genómica en respuesta a señales de desarrollo y ambientales en los sistemas vegetales.

Introduction

La microscopía ha sido durante mucho tiempo una piedra angular para estudiar la organización de la cromatina y la arquitectura nuclear, revelando cómo el ADN y las proteínas asociadas a histonas se organizan en el espacio nuclear 3D y afectan la regulación^{génica 1,2}. La microscopía de fluorescencia convencional ha proporcionado valiosos conocimientos sobre dominios de cromatina a gran escala como territorios cromosómicos, cromocentros y cuerpos^{nucleares 3,4}, factibles in situ, en particular en tejidos radicula....

Protocol

NOTA: La información detallada sobre los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo está disponible en la Tabla de Materiales. Salvo que se especifique lo contrario, los tampones se eliminan en filtros apirogénicos de 0,2 μm. Se utiliza H₂O ultrapuro destilado doble (_{ddH 2}O) en todo este protocolo. Los pasos de centrifugación se realizan en microtubos de 1,5 mL utilizando un rotor de ángulo fijo.

1. Fijación de las plántulas y liberación de núcleos

1. Coloque una placa de cultivo de 6 pozos sobre hielo bajo la campana extractora, y....

Results

El protocolo descrito anteriormente permite la preparación de núcleos de Arabidopsis thaliana de alta calidad adecuados para SMLM. Se realizaron varias rondas de optimización para mejorar la integridad nuclear y reducir los residuos citoplasmáticos y celulares que comprometen la calidad de la imagen. Tras cada paso de optimización, la calidad de las preparaciones nucleares se evaluaba mediante imágenes confocales utilizando un microscopio de disco giratorio Olympus IX81 antes de.......

Discussion

La preparación de núcleos de Arabidopsis thaliana para la microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) requiere varios pasos críticos que influyen fuertemente en la calidad final de la muestra. Como se describió^{anteriormente, es esencial un} corte de tejido exhaustivo y consistente para maximizar la recuperación de núcleos intactos. El uso de cuchillas de microtomo en lugar de cuchillas estándar produce un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpo repetido YSPTSPS (fosfo S2) de la anti-ARN polimerasa II CTD	Abcam	AB5095	Anticuerpo primario utilizado a 1/200 de dilución en un tampón de inmunotinción para visualizar la forma activa de la polimerasa (anticuerpo policlonal elevado en conejo)
Software de adquisición	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Agarosa certificada de baja fusión	Bio-Rad	1613111
Toplings de grosor de 1,5H	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucosa, anhidro, 99%	Termo Científica	A16828-36
Espejo dicróico	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Espejo dicróico para la separación excitación/emisión
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato 10 y aguda;	BioWest	X0515 - 500	Trabajo en condiciones estériles
Cuchillas Epredia Ultra Desechables Microtomo	FisherScientific	12191830	Perfil bajo, de un solo uso
Placa de cultivo celular multipozo tratada con TC de 6 pozos transparentes y fondo plano, con tapa	Halcón	353046
Solución de formaldehído 37%	Carl Roth	7398	Trabaja bajo la campana extractora
Glucosa oxidasa	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerol	VWR	24388.295
Anti-IgG anticonejo de cabra (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor Plus 647	Termo Científica	A32733TR	Usado a 1/200 como anticuerpo secundario acoplado a AF647
Solución Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Usado a 1/500 para contrateñir el ADN, añadido a la almohadilla de agarosa
Solución de ácido clorhídrico	Laboratorio de Química	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Laboratorio Lavis y equipo de Química Abierta (Janelia)	JF549-Hoechst	Se utiliza para contrateñir el ADN, añadido a la almohadilla de agarosa a una concentración final de 1,5 nM
Juego de molienda de tejido KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	Tubo de 2 mL con morteros de espacio tanto grandes (0,0030-0,0050 pulgadas) como pequeños (0,0005-0,0025 pulgadas)
Unidad láser	Oxxius	L6Cc	Equipado con seis láseres: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW y 730 nm - 30 mW
Cloruro de magnesio hexahidrato	Carl Roth	HN03
Mercaptoetilamina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sal sódica 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtro de emisión multibanda	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtración por emisión multibanda para bloquear la luz de dispersión láser
Nanodiamantes	Adamas Nanotecnologías	NDNV100nmHiWGA2ml	Estojo 1 mg/mL
Cámara CMOS digital ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Placa de Petri, 100/20 mm, PS, transparente, con ventilación, estéril	Greiner Bio-One	664161	Se usaba para cultivar plantas con medio medio MS
Placa de Petri, cuadrada, PS, transparente, 120/120/17 mm, estéril	Greiner Bio-One	688161	Se usa al cortar las plántulas de la planta
pluriStrainer Mini colador de células	pluriSelect	43-10030-50	Tamaño de malla 30 y micro; m, adecuado para tubo Eppendorf de 1,5 mL
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9333
Filtro de emisión de banda única	Semrock	FF01-698/70	Filtro de emisión específico para el canal AF647
Filtro de emisión de banda única	Chroma	ET600/50m	Filtro de emisión específico para el canal JF549
Cloruro de sodio (99,5%) y nbsp;	Euromedex	1112-A
Deslizamientos Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Filtro de jeringuilla estéril y barra de hueso; 33 mm porosidad 0,2 y micro; m Cono de esclusa de Luer	ClearLine	146560
Sistema de superresolución	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipado con objetivo de inmersión en aceite 100x NA1.5
Biomole de Tri-Sodio Citrato 2H2O Gen-Apex	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxietil)fosfina cloruro (TCEP)	Termo Científica	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Preadolescentes 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodente	13001002	Sellador de silicona
Sistema de limpieza por ozono ultravioleta horno UVOCS	UVOCS Inc.	T10X10	20 minutos de exposición para limpieza de la cubierta y nbsp;
Bomba de vacío	Vacuubrand	VP 100C
Centrífuga Heraeus Megafuge 16R	Termo Científica		Rotor TX-400 75003629. Centrifugación realizada con tubos de Eppendorf.