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Artículo de método

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

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DOI:

10.3791/70894

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23 de junio de 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) son partículas nanodimensionadas unidas a lípidos que median la comunicación intercelular mediante la transferencia de proteínas, lípidos y ácidos ribonucleicos (ARN). El aislamiento de los sEVs de tejidos sólidos como el músculo esquelético (SkM) y la médula ósea (BM) sigue siendo complicado debido al bajo rendimiento y la contaminación por componentes no vesiculares. Este protocolo describe un flujo de trabajo reproducible para aislar las sEVs de SkM y BM de ratones. SkM se digiere enzimáticamente, mientras que BM se procesa directamente y posteriormente se somete a centrifugación diferencial y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Para SkM, se descarta el volumen vacío (~2,5 mL) y los siguientes ~1,6 mL se recogen como fracciones enriquecidas con EV, típicamente subdivididas en fracciones secuenciales de 400 μL (F1–F4). Para BM, se descarta un volumen vacío de 700 μL, seguido de la recogida de una fracción enriquecida con EV de ~850 μL, que puede subdividirse en fracciones secuenciales de ~170 μL (F1–F5) y agruparse según el enriquecimiento de marcadores EV. Con este enfoque, los sEVs pueden aislarse de pequeños volúmenes tisulares (aproximadamente 500 μL de un solo cuádriceps y 150 μL de la evacuación acumulada de fémur y tibia), produciendo ~108 partículas·mL−1·mg−1 tejido con diámetros de partículas predominantemente <200 nm. La integridad y pureza de las vesículas se validan mediante microscopía electrónica de transmisión, análisis de seguimiento de nanopartículas y Western blot para marcadores canónicos de EV, con caracterización adicional mediante detección interferométrica de partícula única para cuantificar subpoblaciones de vesículas definidas por tetraspanina. Este método permite el aislamiento reproducible de sEVs de alta pureza a partir de tejidos estructuralmente complejos utilizando material de entrada mínimo, apoyando análisis moleculares y funcionales posteriores de vesículas derivadas de tejidos.

Introducción

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) son partículas de tamaño nanométrico unidas a lípidos que median la comunicación intercelular mediante la transferencia de proteínas, lípidos y ácidosnucleicos. Son liberados por todos los tipos celulares y están presentes en prácticamente todos los fluidos biológicos, donde funcionan como portadores clave de carga bioactiva, incluidos péptidos y microácidos ribonucleicos (ARN)2. Su carga se clasifica selectivamente, lo que permite la entrega precisa de señalesespecíficas 3, y su estructura vesicular les permite eludir las típicas restricciones de gradiente y dilución de factores libremente secretados entregando cargas moleculares concentradas a largasdistancias 4. Aunque los EV procedentes de biofluidos (por ejemplo, plasma, suero y saliva) proporcionan una instantánea conveniente de la señalización sistémica, representan una población altamente mixta que se origina en muchostejidos 5. Esto dificulta determinar qué órgano está produciendo una señal biológica específica o cómo se regula la comunicación de los EV a nivel de tejido. Como los EVs circulantes se agrupan, los cambios específicos de los tejidos pueden diluirse o enmascararse, limitando la capacidad de identificar la verdadera fuente deseñales 6.

El músculo esquelético (SkM) y la médula ósea (BM) son tejidos metabólica y funcionalmente activos con composiciones celulares y roles de señalizacióndistintos 7,8. Ambos tejidos pueden liberar poblaciones de EV enriquecidas con cargas únicas y específicas de tejido; sin embargo, estas señales pueden ser fácilmente eclipsadas en plasma por los VEs provenientes de tejidos de alta renovación como las célulasinmunitarias 8,9. Aislar directamente los EVs del músculo o del defecar aumenta la sensibilidad y permite detectar adaptaciones sutiles específicas de tejido que pueden no ser observables en circulación. Por tanto, los EVs derivados de tejidos proporcionan información complementaria esencial, revelando cuándo un órgano específico libera EVs, cuánto tiempo persisten esas señales y qué adaptaciones son agudas frente a crónicas. A pesar del creciente interés en los vehículos eléctricos, la mayoría de los métodos de aislamiento establecidos se han desarrollado para biofluidos (por ejemplo, plasma y suero) o sistemas de cultivo celular. En estos contextos, los VE pueden obtenerse con un rendimiento relativamente alto y una mínima alteración estructural. Sin embargo, aislar los VE directamente de tejidos sólidos como SkM y BM presenta desafíos técnicos notables. Estos tejidos son estructuralmente complejos y heterogéneos, lo que requiere pasos mecánicos o enzimáticos de disociación que pueden introducir artefactos, incluyendo altos niveles de proteínas solubles, fragmentos de orgánulos y nanopartículas no vesiculares, lo que dificulta el obtención de preparaciones EV de alta pureza.

Otro gran desafío en el aislamiento de EV derivado de tejidos es la falta de flujos de trabajo estandarizados para la definición y separación defracciones 10. La centrifugación diferencial por sí sola suele resultar en el coaislamiento de agregados proteicos y vesículas grandes, mientras que los métodos basados en ultracentrifugación, aunque ampliamente utilizados, pueden provocar agregación, deformación y recuperación variable de vesículas dependiendo del tipo de rotor y las condiciones experimentales. Los enfoques de gradiente de densidad mejoran la pureza pero requieren mucho tiempo, tienen bajo rendimiento y son difíciles de estandarizar en loslaboratorios 11. En consecuencia, actualmente no existe un método ampliamente adoptado y reproducible optimizado para aislar pequeños vehículos eléctricos de tejidos sólidos con alta pureza y rendimientoconsistente 10.

La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) ha surgido como una alternativa prometedora para el aislamiento de EV porque separa partículas en función del tamaño sin someter las vesículas a altas fuerzas centrífugas. La SEC permite la separación eficiente de pequeños EVs de proteínas solubles y contaminantes de bajo peso molecular, preservando la integridad de las vesículas y su función biológica. Es importante destacar que la SEC permite una definición clara de las fracciones de elución, facilitando la identificación reproducible de fracciones enriquecidas con EV y mejorando la consistencia entre losexperimentos 12. Sin embargo, los flujos de trabajo SEC requieren una optimización cuidadosa para las muestras derivadas de tejidos, especialmente en lo que respecta al procesamiento de tejidos aguas arriba, la eliminación de residuos y la recogida de fracciones. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un protocolo reproducible y estandarizado para aislar los sEVs de SkM y BM. Este método integra digestión enzimática controlada para tejidos fibrosos, centrifugación diferencial para la eliminación de residuos y purificación basada en SEC para aislar vesículas de alta pureza. El flujo de trabajo está específicamente optimizado para minimizar la contaminación por componentes intracelulares, preservando la integridad de las vesículas y permitiendo una recuperación constante de tejidos de bajo rendimiento.

Este protocolo cubre una carencia metodológica crítica al proporcionar un enfoque práctico y escalable para aislar los sEVs derivados de tisules, con fraccionamiento definido y pureza validada, logrado mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), Western blot de marcadores canónicos de EV, microscopía electrónica para evaluación morfológica y análisis de EV de partícula única mediante captura de anticuerpos, dimensionamiento interferométrico e imagen de fluorescencia multicanal. Es especialmente adecuado para estudios que requieren análisis de EV específico en tejido, donde las vesículas derivadas de biofluidos son insuficientes para resolver el origen celular de las señales. Los investigadores deberían utilizar este método cuando el objetivo es obtener sEVs de alta pureza a partir de tejidos sólidos con mínima contaminación y preservación de la integridad de las vesículas. En cambio, los métodos basados en ultracentrifugación pueden ser preferidos para aplicaciones de alto rendimiento donde la pureza es menos crítica, y se pueden seleccionar enfoques de gradiente de densidad al aislar subpoblaciones específicas de EV a pesar de un menor rendimiento. En conjunto, este protocolo proporciona un marco estandarizado para el aislamiento y caracterización de sEVs derivados de tejidos, permitiendo análisis moleculares, bioquímicos y funcionales reproducibles a continuación.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad McGill (DOUG10029) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

1. Protocolo de aislamiento sEV (SkM-sEV) derivado de SkM

  1. Recogida de muestras y disociación de tejidos
    1. Extracción y preservación de tejidos
      1. Congelar rápidamente el tejido SkM inmediatamente después de la excisión sumergiéndolo en metilbutano preenfriado.
        NOTA: Para preparar metilbutano preenfriado, coloque un recipiente de metilbutano en un baño de hielo seco y añada gradualmente pequeños trozos de hielo seco directamente en el líquido. Deja que la solución se enfríe, la temperatura suele estar en el rango de −70°C a −80°C. Mantén el metilbutano en el baño de hielo seco durante el uso para preservar la temperatura. Sumergir el tejido durante aproximadamente 3–4 segundos hasta que esté completamente congelado, como indica el endurecimiento total del tejido y la pérdida de flexibilidad.
      2. Transfiere el tejido a crioviales.
      3. Coloca las muestras sobre hielo seco.
        NOTA: Almacenar las muestras a −80°C hasta el procesamiento adicional. Evita ciclos repetidos de congelación y deshielo. La congelación rápida rápidamente preserva eficazmente los vehículos eléctricos cuando las muestras están correctamente selladas. La deshidratación o daño en las vesículas puede producirse si los tejidos quedan expuestos o sufren múltiples ciclos decongelación-deshielo 13.
    2. Disociación tisular
      NOTA: Realiza todos los pasos en un armario de bioseguridad utilizando instrumentos y guantes estériles para evitar contaminaciones, que de otro modo podrían comprometer la pureza de los vehículos eléctricos.
      1. Pesar tejido
        1. Esteriliza las pinzas con etanol al 70% y déjalas secar al aire.
        2. Transfiere el tejido congelado a una placa de cultivo con suspensión prepesada.
        3. Pesa el tejido usando una balanza de miligramos (normalmente ~80–120 mg por muestra, dependiendo de la edad y el sexo del ratón).
          NOTA: El protocolo está validado para masas de tejido de entrada de ~80–120 mg. Para muestras dentro de este rango, utilice los volúmenes de reactivos especificados en los pasos 1.2.3.1, 1.3.1.3 y 1.3.2.1 sin modificaciones. Para muestras fuera de este rango, escala todos los volúmenes de reactivos proporcionalmente a la masa tisular manteniendo la proporción validada de RPMI-1640, colagénasa D y DNasa I (1000:40:4 μL por tejido de 100 mg). Esto corresponde aproximadamente a 10 μL de RPMI-1640, 0,4 μL de colagénasa D (stock de 100 mg/mL) y 0,04 μL de DNasa I (stock de 20.000 U/mL) por mg de tejido. Mantén estas proporciones para preservar las concentraciones finales de enzimas durante la reacción. La eficiencia digestiva y el rendimiento del VE deben validarse empíricamente cuando se trabaja sustancialmente fuera del rango de 80–120 mg.
        4. Devuelve la muestra a un tubo preenfriado y guárdala en hielo.
      2. Prepara enzimas
        1. Descongelar alicuotas de colagenasa D (stock de 100 mg/mL) y DNasa I (stock de 20.000 U/mL) sobre hielo (véase Archivo Suplementario 1, Paso 1.4 para la preparación del stock enzimático). Estas enzimas se añaden en el Paso 1.3.2.1 para alcanzar concentraciones finales en reacción de 3,8 mg/mL de colagenasa D y 77 U/mL de DNasa I. El volumen final de digestión es de 1,044 mL.
        2. Mezcla DNasa I suavemente por inversión. No te pongas en vórtice.
      3. Preparación de tejidos para la digestión
        1. Añadir 800 μL de RPMI-1640 a una placa de cultivo de suspensión estéril colocada sobre hielo.
        2. Transfiere el pañuelo al plato.
        3. Corta el tejido en 6–8 trozos de tamaño aproximadamente uniforme (2–3 mm por lado) usando un bisturí desechable estéril. Estabiliza el tejido con pinzas estériles durante el corte para asegurar una fragmentación uniforme. Completa este paso en 1 minuto/muestra para mantener la consistencia entre muestras.
        4. Mantén el plato en hielo durante todo el procedimiento para minimizar la degradación.
    3. Transferencia de tejidos y digestión enzimática
      1. Transferencia de tejido
        1. Recorta el extremo de una punta de pipeta P1000 estéril usando una hoja estéril para producir una abertura de 2–3 mm de diámetro, suficiente para permitir el libre paso de los fragmentos de tejido generados en el Paso 1.2.3.3.
          NOTA: Alternativamente, utilice puntas de pipeta de 1 mL de orificio ancho (orificio ancho) disponibles comercialmente, que proporcionan una abertura estandarizada (normalmente ~2–3 mm de diámetro interno) y eliminan la variabilidad asociada al recorte manual.
        2. Transfiere los fragmentos de tejido y el medio RPMI-1640 a tubos premarcados de 1,5 mL utilizando una pipeta P1000 equipada con la punta modificada. Realizar 2–3 aspiraciones sucesivas para recuperar fragmentos y el medio residuales. Inspecciona visualmente la cuenca y la punta de la pipeta tras la transferencia y utiliza pinzas estériles para transferir los fragmentos restantes y asegurarte de que no quede tejido visible.
        3. Añade 200 μL de RPMI-1640 a cada tubo.
      2. Digestión enzimática
        1. Añade 40 μL de colágeno D stock (100 mg/mL) y 4 μL de DNasa I stock (20.000 U/mL) a cada tubo de alícuotas descongeladas sobre hielo. Esto produce concentraciones finales en la reacción de 3,8 mg/mL de colagénasa D y 77 U/mL de DNasa I. Para muestras fuera del rango de tejido de 80–120 mg, ajustar los volúmenes enzimáticos proporcionalmente según se describe en la NOTA siguiente al paso 1.2.1.3.
          NOTA: Estos volúmenes están calibrados para masas tisulares dentro del rango típico de 80–120 mg. Para masas tisulares fuera de este rango, escalar todos los volúmenes de reactivos proporcionalmente como se describe en la NOTA siguiente al paso 1.2.1.3 (0,4 μL de stock de colagénasa D y 0,04 μL de stock de DNasa I por mg de tejido), lo que preserva las mismas concentraciones finales de enzimas en la reacción independientemente de la masa tisular.
        2. Añadir las enzimas a todas las muestras simultáneamente al procesar varias muestras.
        3. Mantén los tubos sobre hielo durante la adición de enzimas.
        4. Invierte suavemente los tubos para mezclar. No te pongas en vórtice.
        5. Incubar los tubos a 37°C durante 30 minutos en un mezclador nutador (24 rpm, ángulo de inclinación de 20°; véase Tabla de Materiales). Asegúrate de mezclar de forma uniforme durante la incubación.
          NOTA: Digiera cada muestra en un volumen total de 1,044 mL (1000 μL RPMI-1640, 40 μL de colagénasa D y 4 μL de DNasa I por muestra; equivalente a una relación tampón-colagenasa de ~25:1).
    4. Eliminación de escombros
      NOTA: Iniciar el equilibrio de columna SEC al inicio de la primera centrifugación (Paso 1.4.1.1). La columna SEC requiere entre 20 y 25 minutos para el lavado y el equilibrio. Iniciar la equilibración en este punto asegura que la columna esté lista para cargar la muestra inmediatamente después de completar el paso de filtración (Paso 1.4.3).
      1. Primera centrifugación
        1. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 10 minutos a 4°C para pelletar los restos no digeridos, las células intactas y los fragmentos de tejido restantes.
        2. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos estériles nuevos de microcentrífuga de 1,5 mL sin alterar el perdigón.
      2. Segunda centrifugación
        1. Centrifugar las muestras a 2.000 × g durante 15 minutos a 4°C para pelletar restos grandes, células muertas, cuerpos apoptóticos y vesículas grandes.
        2. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos estériles nuevos de microcentrífuga de 1,5 mL sin alterar el perdigón.
          NOTA: La segunda centrifugación es opcional y debe incluirse cuando se requiera la eliminación adicional de restos. Realiza este paso si el sobrenadante parece visiblemente turbio o contiene material particulado residual tras la primera centrifugación. Este paso también se recomienda si preparaciones previas han mostrado contaminación por marcadores intracelulares (por ejemplo, Calnexina o BiP) en fracciones de SEC enriquecidas con EV o la presencia de partículas no vesiculares mediante microscopía electrónica de transmisión. La necesidad de este paso debe validarse durante la optimización inicial del protocolo para cada tipo de tejido.
      3. Filtración
        1. Pre-humedece los coladores estériles de 30 μm enjuagándolos con RPMI-1640 para equilibrar la membrana y minimizar la pérdida de muestras. Descarta el enjuague.
        2. Filtrar cada muestra a través del colador celular de 30 μm previamente humedecido hacia tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mL que se unen a proteínas y se unirían a las proteínas para eliminar los restos celulares y partículas grandes antes de la SEC.
        3. Permite que las muestras pasen por el filtro por gravedad.
        4. Deja filtrar entre 10 y 15 minutos por muestra.
          NOTA: La filtración se completa cuando no queda líquido visible por encima de la membrana filtrante y el volumen de filtrado en el tubo de recogida se ha estabilizado. Si la filtración es más lenta o se estanca, esto puede indicar obstrucción debido a residuos residuales; En tales casos, considera repetir el paso de aclaración o reducir la carga de muestras.
        5. Recoger entre 550 y 600 μL de sobrenadante filtrado para la carga posterior en la columna SEC. Para mayor consistencia entre muestras, normalizar el volumen de carga a 500 μL por columna (véase el Paso 2.2.1), independientemente del volumen total recuperado.
  2. Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)
    1. Columna SEC equilibrada
      NOTA: Realiza este paso durante la centrifugación si es posible.
      1. Enjuague la columna SEC con 17 mL de 1× PBS (filtrado a 0,22 μm).
      2. Permitir que todo el volumen pase a través de la columna por gravedad a un caudal esperado de 0,75 mL/min (20–25 min en total para el volumen de lavado de 17 mL). Caudales más rápidos o más lentos pueden indicar un mal equilibrio de la columna o obstrucción.
      3. Mantener la columna y el PBS a temperatura ambiente (RT, 21°C ± 2°C) durante el equilibrio para asegurar un caudal constante y un rendimiento óptimo de la columna.
      4. Preparar tubos microcentrífugas de baja unión a proteínas de 1,5 mL para la recogida de todas las fracciones.
      5. Prepara un tubo adicional para la recogida del volumen vacío si es necesario.
    2. Carga de muestras y elución
      1. Carga 500 μL de sobrenadante filtrado sobre la columna SEC.
      2. Deja que la muestra entre completamente en la resina. El punto final se alcanza cuando el menisco líquido alcanza la superficie del lecho de resina, sin que quede líquido visible sobre la resina mientras la resina permanece visiblemente húmeda.
      3. No permitas que el menisco caiga por debajo de la superficie de resina ni que la columna se seque, ya que esto introduce aire en la cama de resina y dificulta la elución. Cuando el menisco líquido llega a la superficie de resina (según se define en el Paso 2.2.2), procede inmediatamente al Paso 2.2.4 sin demora.
      4. Añade inmediatamente 2 mL de PBS para iniciar la elución.
      5. Recoge el volumen de vacío (~2,5 mL).
      6. Descarta el volumen vacío o retíralo como una fracción no EV.
      7. Comienza a recoger la fracción enriquecida con EV inmediatamente después de que el volumen vacío de 2,5 mL haya elucidado.
      8. Recoge un total de 1,6 mL de eluato enriquecido con EV tras el volumen vacío, ya sea como una fracción continua en un solo tubo o como fracciones secuenciales que se agrupan posteriormente.
      9. Alternativamente, recoge fracciones secuenciales de 0,4 mL para optimizar la pureza frente al rendimiento. Se recomiendan volúmenes de fracciones más pequeños cuando se requiere mayor pureza (por ejemplo, para análisis proteómicos o aplicaciones sensibles aguas abajo), mientras que fracciones mayores pueden emplearse para maximizar el rendimiento global del EV.
      10. Evalúa fracciones para el enriquecimiento de EV utilizando métodos de caracterización (por ejemplo, Western blot para marcadores y contaminantes de EV, y NTA), y agrupar fracciones enriquecidas con EV según se defina en la sección de caracterización.
        NOTA: Mantén la columna fluyendo de forma continua. A medida que una fracción está terminando, añade PBS para mantener un líquido constante sobre la cama de resina y evitar que la columna se seque. Utiliza tubos de baja unión a proteínas y sin nucleasas para la recogida.
    3. Concentración
      1. Concentra muestras de EV usando filtros centrífugos (corte de peso molecular de 100 kDa [MWCO]) para aplicaciones posteriores (por ejemplo, secuenciación de ARN, proteómica o Western blot).
      2. Enjuaga los filtros con PBS antes de usarlos.
      3. Centrifugar las muestras a 4.000 × g a 4°C, comprobando cada 2–3 minutos hasta alcanzar el volumen final deseado (normalmente 50–100 μL). Utiliza volúmenes finales más bajos (por ejemplo, ~50 μL) para aplicaciones que requieren mayores concentraciones y volúmenes mayores (por ejemplo, ~100 μL) cuando se prefiere maximizar la recuperación.
        PRECAUCIÓN: Evita la sobreconcentración deteniendo la centrifugación una vez alcanzado el volumen objetivo.
      4. Recupera la retención con pipeteo suave.
      5. Registrar los volúmenes de muestras antes y después de la concentración para estimar la recuperación, si es necesario. La NTA puede utilizarse para evaluar la concentración de partículas antes y después de la concentración, si está disponible.
    4. Almacenamiento
      1. Mantén fracciones enriquecidas con EV sobre hielo o a 4°C para ensayos inmediatos (por ejemplo, NTA y microscopía electrónica de transmisión [TEM]) y procesa en 24 horas para TEM y en 48 horas para NTA.
      2. Muestreos de EV en tubos de baja unión a proteínas para su almacenamiento.
      3. Almacena las muestras a −80°C para uso prolongado.
      4. Evita ciclos repetidos de congelación y deshielo.

2. Protocolo de aislamiento sEV derivado de BM (BM-sEV)

  1. Recogida de muestras y disociación tisular
    1. Extracción y preservación de tejidos
      1. No congeles los huesos inmediatamente después de la extirpación, ya que esto endurece la médula y complica la extracción mediante el método del tubo pinchado. En su lugar, mantenga los huesos sobre hielo o a 4°C durante periodos cortos de manipulación antes de procesarlos o congelarlos como se describe en el Paso 3.1.1.4 (colocación sobre hielo seco antes de almacenamiento a −80°C).
      2. Retira los músculos y tejidos conectivos circundantes de los huesos diseccionados.
      3. Transfiere los huesos a los crioviales.
      4. Coloca las muestras sobre hielo seco.
        NOTA: Almacenar las muestras a −80°C hasta el procesamiento adicional.
    2. Procesamiento BM
      NOTA: Realiza todos los pasos en un armario de bioseguridad utilizando instrumentos y guantes estériles para evitar contaminaciones, que de otro modo podrían comprometer la pureza de los vehículos eléctricos.
      1. Prepesa y etiqueta tubos de centrífuga de 1,5 mL antes de añadir cualquier material. Calcula la masa de la evacuación comparando los pesos de los tubos antes y después de la extracción.
      2. Prepara el montaje de tubo pinchado insertando un tubo PCR de 0,2 mL (tapa intacta) en un tubo centrífugo de 1,5 mL con un ajuste ajustado. Perfora la parte inferior del tubo de 0,2 mL una vez con una aguja estéril de 16 G sostenida perpendicular a la base, produciendo una única perforación uniforme de ~1,6 mm de diámetro. Prepara una configuración por pata y ratón.
      3. Coloca la pierna, limpia de todos los músculos y tejido circundante, en una placa de Petri estéril.
      4. Separa el fémur y la tibia cortando el espacio articular.
      5. Corta ambos extremos del fémur y la tibia para exponer la médula roja. Coloca los huesos en el tubo de PCR perforado situado dentro del tubo de 1,5 mL y sella el conjunto con parafilm para asegurar una instalación segura durante la centrifugación.
      6. Centrifugar las muestras durante 10 s en una microcentrífuga de sobremesa a aproximadamente 8.000 × g, o en la configuración más cercana posible del instrumento utilizado, a temperatura ambiente.
      7. Verificar la extracción exitosa de médula mediante tres criterios: (i) los huesos aparecen visiblemente blancos sin residuos de médula roja, (ii) el pellet del tubo inferior aparece rojo oscuro y compacto, normalmente llenando la punta cónica del tubo de 1,5 mL, y (iii) la masa medrosa de médula (Paso 3.1.2.9) se encuentra dentro del rango esperado de ~15–30 mg por ratón.
      8. Reposiciona o vuelve a cortar los huesos y repite el breve giro si queda la médula roja visible dentro del hueso.
      9. Pesa de nuevo los tubos para determinar la masa de médula extraída (normalmente ~15–30 mg por muestra, dependiendo de la edad del ratón, sexo y eficiencia de extracción).
        NOTA: El protocolo está validado para rendimientos de médula de ~15–30 mg por muestra. Debido a que el volumen de resuspensión del RPMI-1640 se mantiene constante en 250 μL independientemente de la masa de médula (Paso 3.1.2.10), el rendimiento EV se normaliza a la masa inicial medida durante el análisis posterior (partículas μl−1·mg−1 tejido de partículas). Para muestras sustancialmente inferiores a 15 mg, médula de piscina de ratones emparejados (misma edad, sexo y hueso) antes de la resuspensión para mantener suficiente estímulo para la caracterización posterior. Para muestras sustancialmente superiores a 30 mg, se divide la médula en dos resuspensiones separadas de 250 μL cada una o se escala el volumen del RPMI-1640 proporcionalmente (~12,5 μL por mg de médula) para evitar una resuspensión incompleta; en cualquier caso, aplica la misma normalización por masa durante el análisis.
      10. Añade 250 μL de RPMI-1640 a cada tubo. Mantener un volumen constante entre muestras, independientemente de la masa de médula, para permitir la normalización del rendimiento EV a la masa inicial de médula. Guarda las muestras en hielo.
      11. Resuspende la médula pipeteando suavemente arriba y abajo 10–15 veces con una pipeta P1000 hasta que la suspensión parezca visualmente homogénea, sin grumos visibles ni fragmentos de tejido intactos. Evita el pipeteo forzado o la formación de burbujas, que pueden alterar la integridad de las vesículas.
  2. Eliminación de escombros
    1. Primera centrifugación
      1. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 10 minutos a 4°C para pelletar los restos no digeridos, las células intactas y los fragmentos de tejido restantes.
      2. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos estériles nuevos de microcentrífuga de 1,5 mL sin alterar el perdigón.
    2. Segunda centrifugación
      1. Centrifugar las muestras a 2.000 × g durante 15 minutos a 4°C para eliminar los restos grandes.
      2. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos estériles nuevos de microcentrífuga de 1,5 mL sin alterar el perdigón.
    3. Tercera centrifugación
      1. Centrifuga las muestras a 10.000 × g durante 30 minutos a 4°C para eliminar cuerpos apoptóticos y vesículas grandes.
      2. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos estériles nuevos de microcentrífuga de 1,5 mL sin alterar el perdigón.
      3. Asegúrese de obtener un volumen final de 200 μL de sobrenadante.
  3. Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)
    1. Preparación de columnas
      1. Equilibrar la columna SEC enjuagando con 6 mL de 1× PBS (0,22 μm-filtrado).
        NOTA: El volumen de equilibrio es específico de columna y debe coincidir con el tipo de columna indicado en la Tabla de Materiales. Esta columna requiere un volumen de equilibrio de 6 mL, que difiere de la columna utilizada para muestras SkM.
      2. Deja que todo el volumen pase por gravedad.
      3. Mantén la columna y el PBS en RT durante el equilibrio para asegurar un caudal y un rendimiento óptimos de la columna.
    2. Carga de muestras y elución
      1. Carga 150 μL de sobrenadante filtrado sobre la columna SEC.
      2. Deja que la muestra entre completamente en la resina. El punto final se alcanza cuando el menisco líquido alcanza la superficie del lecho de resina sin que quede líquido visible sobre la resina mientras la resina permanece húmeda (como se describe en el Paso 2.2.2).
      3. No permitas que el menisco desplome por debajo de la superficie de resina ni que la columna se seque (véase el punto final definido en el Paso 3.3.2.2), ya que esto introduce aire en la cama de resina y dificulta la elución. Cuando el menisco líquido alcance la superficie de resina, proceda inmediatamente al Paso 3.3.2.4 sin demora.
      4. Añadir inmediatamente 550 μL de PBS para iniciar la elución.
      5. Recoge el volumen vacío (700 μL).
      6. Descarta el volumen vacío o retíralo como una fracción no EV.
      7. Comienza a recoger la fracción enriquecida con EV inmediatamente después de que haya elucidado el volumen vacío de 700 μL.
      8. Recoge 850 μL de eluato enriquecido con EV siguiendo el volumen vacío de 700 μL.
      9. Alternativamente, recoge fracciones secuenciales de aproximadamente 170 μL para optimizar la pureza frente al rendimiento.
        NOTA: Se recomiendan volúmenes de fracciones más pequeños cuando se requiere mayor pureza (por ejemplo, para análisis proteómicos o aplicaciones sensibles aguas abajo), mientras que fracciones mayores pueden usarse para maximizar el rendimiento total de los EV.
      10. Evalúa fracciones para marcadores de EV y agrupa fracciones enriquecidas con EV según sea necesario.
        NOTA: Mantén la columna fluyendo de forma continua. A medida que una fracción está terminando, añade PBS para mantener un líquido constante sobre la cama de resina y evitar que la columna se seque.

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Resultados

Para evaluar la eficacia de este protocolo para aislar los sEVs derivados del tejido, se presentan resultados representativos de muestras de SkM y BM. El aislamiento exitoso se definió por (i) el enriquecimiento de marcadores canónicos de EV (TSG101, CD63, CD81 y CD9) en fracciones tempranas de SEC, (ii) la detección mínima de contaminantes intracelulares (por ejemplo, Calnexin y BiP), (iii) una distribución unimodal del tamaño de las partículas con la mayoría de las partículas <200 nm, ...

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Discusión

Este protocolo describe un enfoque robusto y reproducible para aislar preparaciones enriquecidas con sEV directamente de SkM y BM, dos tejidos de bajo rendimiento y altamente heterogéneos. Aunque el aislamiento de EV está bien establecido para biofluidos y sistemas de cultivo celular, los métodos estandarizados para EVs derivados de tejidos siguen siendo limitados debido a los desafíos asociados a la disociación tisular, la contaminación por material intracelular y la variabilidad en el ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Agradecemos a Jennie Yang, Dariusz Żurawek y Volodymyr Yerko por su asistencia técnica y sus valiosas discusiones. Estamos agradecidos a la plataforma del Center for Applied Nanomedicine, especialmente a Nadim Tawil y Laura Montermini, por su apoyo en la caracterización de vesículas extracelulares y la adquisición de datos. También agradecemos al personal de la instalación animal, Guylaine Gadoury y Tara Thomson, por su ayuda con el manejo de ratones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300Tubo de microcentrifugación general utilizado en todo el protocolo
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Utilizado para el manejo de EV, recolección de fracciones SEC y almacenamiento
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Utilizado para el montaje de extracción de médula ósea con tubo perforado
16 G needleBD305197Utilizado para perforar el tubo PCR de 0.2 mL
30 µm cell strainerMiltenyi Biotec 130-098-458Utilizado para la filtración de muestras de músculo esquelético
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Utilizado para esterilizar pinzas
Biosafety cabinetNANAUtilizado para el manejo estéril de tejidos
Bone cutting instrumentFisher Scientific10-001-976Utilizado para separar el fémur y la tibia y exponer la médula
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001Utilizado para el bloqueo de Western blot y dilución de anticuerpos
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Utilizado para la preparación del tampón HEPES
Carbon-coated copper grid, 200-meshSigma-Aldrich930342Utilizado para la preparación de muestras TEM
Centrifugal filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Utilizado para la concentración de EV
Collagenase DRoche11088858001Utilizado para la digestión enzimática del músculo esquelético
CryovialSarstedt72.690.300Utilizado para el almacenamiento de tejidos y huesos
Deionized water (ultrapure)NANAUtilizado para la preparación de tampones y pasos de lavado TEM
DNase IRoche11284932001Utilizado para la digestión enzimática del músculo esquelético
Dry iceNANAUtilizado para el enfriamiento y transporte de muestras
Enhanced chemiluminescence substrateBiorad1705061Utilizado para la detección de Western blot
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Utilizado para filtrar el PBS cuando sea aplicable
Forceps / tweezersMilliporeSigmaF3892Utilizado para el manejo de tejidos
GlutaraldehydeNANAUtilizado para la fijación TEM
GlycineNANAUtilizado en los pasos de lavado de la rejilla TEM
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Utilizado para la preparación del stock de DNase I
HEPESBioShopHEP001.500Utilizado para la preparación del tampón HEPES-NaOH
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinThermo FisherS911Utilizado para la detección de Western blot
Imaging system for chemiluminescenceBiorad12003153Utilizado para obtener imágenes de las membranas de Western blot
KClBioShopPOC308Utilizado para la preparación del tampón HEPES
Magnesium chloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Utilizado para la preparación del tampón HEPES
2-MethylbutaneThermo Fisher78-78-4Utilizado para la congelación instantánea del músculo esquelético
Milligram balanceMilliporeSigmaZ741359Utilizado para el pesaje de tejidos y médula
NaClBioShopSOD004.1Utilizado para la preparación del tampón HEPES
Nano-particle tracking analysis instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 utilizado para el dimensionamiento y conteo de partículas
NaOHBioShopSHY500.500Utilizado para el ajuste del pH
Nitrocellulose membraneBioRad1704271Utilizado para la transferencia de Western blot
Nutating mixerLabnet S0500Utilizado durante la digestión enzimática
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAUtilizado para la transferencia de tejidos
Pipette tip, 1 mLSarstedt70.3050.275La punta está recortada para ampliar la abertura para la transferencia de fragmentos de tejido
Phosphate-buffered saline (PBS)WisentINC 811.012-FLUtilizado en todo el protocolo; también utilizado para la equilibración y elución de SEC
Phosphatase inhibitorMilliporeSigma4906845001Utilizado para la preparación del lisado de Western blot
Petri dishMilliporeSigmaCLS351146Utilizado para la preparación de médula ósea
Polyacrylamide gel, 4–20% gradient stain-freeBioRad4561094Utilizado para la separación de Western blot
Protease inhibitorMilliporeSigma11697498001Utilizado para la preparación del lisado de Western blot
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLNo suplementado; sin FBS o antibióticos
RIPA buffer, 10×Merck20-188Utilizado para la extracción de proteínas para Western blotting
Scalpel, sterile disposableUltident Paragon02-90000-10Utilizado para picar el tejido muscular esquelético
SEC column, original 70 nmIZONICO70PUtilizado para SEC de músculo esquelético
SEC column, single 70 nmIZONICS70PUtilizado para SEC de médula ósea
Sodium azideSigma-AldrichS2002Agregado al PBS para el lavado de la columna
Sodium cacodylate bufferNANAUtilizado para el tampón de fijación TEM
Luer Slip Single Use Syringe without Needle MedlineSYR101020Utilizado durante la adquisición de NTA si es aplicable
Transmission electron microscopeFEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEM utilizado para imágenes TEM
Tween-20BioShopTWN508.1Utilizado en PBS-T para Western blotting
Uranyl acetateNANAUtilizado para el tinción negativa TEM
Whatman filter paper

Referencias

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