Artículo de investigación

Nanopartículas verdes de CuO/ZnO: Reducción de la translocación y acumulación de AFB1 en el maíz

DOI:

10.3791/70906

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5 de junio de 2026

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1Department of Agricultural Research and Specialist Services, Ministry of Agriculture, 2Faculty of Natural and Agricultural Science, Crop Science Department, North-West University, 3Food Security and Safety Niche Area, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 4Department of Animal Science, School of Agricultural Sciences, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 5Center for Animal Health Studies, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 6Material Science Innovation and Modeling (MaSIM) Research Focus Area, Faculty of Natural and Agricultural Science, North-West University, 7Department of Chemistry, School of Physical and Chemical Sciences, Faculty of Natural and Agricultural Science, North-West University

En este artículo

Resumen

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Este estudio investigó la eficacia de nanopartículas híbridas de CuO/ZnO sintetizadas en verde en la reducción de la acumulación y translocación de aflatoxina B1 (AFB 1) en el maíz, demostrando que un tratamiento de 125 mg/kg redujo significativamente los niveles deAFB 1 y minimizó los riesgos de exposición dietética tanto en humanos como animales.

Resumen

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La aflatoxina B1 (AFB 1) es un potente carcinógeno producido por especies de Aspergillus que contamina los cultivos de maíz, suponiendo graves riesgos para la salud de humanos y animales debido a la exposición dietética. La gestión tradicional posterior a la cosecha y las intervenciones químicas suelen ser costosas o ineficaces para evitar la translocación de toxinas del suelo al interior de la planta durante el crecimiento. El objetivo principal de este protocolo fue evaluar nanopartículas híbridas (NPs) de óxido de cobre y óxido de zinc (CuO/ZnO) sintetizadas en verde como una enmienda sostenible del suelo precosecha. El estudio tenía como objetivo determinar si estos NPs podían inhibir eficazmente la translocación y acumulación deAFB 1 en los tejidos del maíz, reduciendo así la acumulación de toxinas en los granos comestibles. Utilizando un diseño aleatorizado por bloques completos en dos yacimientos de campo distintos, el maíz se cultivó en suelo inoculado con esporasAFB 1 o Aspergillus flavus y tratado con diferentes concentraciones de NPs (0–125 mg/kg). El protocolo empleó síntesis verde con sustrato de Pleurotus ostreatus para garantizar la respetabilidad ecológica. Los tejidos vegetales se analizaron en diferentes etapas fisiológicas mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) para medir los niveles deAFB 1 y calcular evaluaciones de riesgo en humanos y ganado. El tratamiento con 125 mg/kg de NPs híbridos verdes disminuyó significativamente (p < 0,05) las concentraciones deAFB 1 en todas las etapas de crecimiento. En el recinto del campus, laAFB 1 se redujo en un 68% en la etapa vegetativa, un 82% en la floración y un 76% en la madurez en comparación con el control positivo. De forma crucial, los niveles de AFB 1 en grano bajaron a 6,91 ppb, reduciendo significativamente la ingesta diaria estimada en humanos. Sin embargo, se requiere más investigación para evaluar los posibles residuos de nanopartículas y la toxicidad a largo plazo. Este método demuestra que los NP híbridos verdes de CuO/ZnO actúan como un agente biorremediador eficaz, impidiendo el transporte de toxinas a las partes comestibles de la planta. Este enfoque ofrece una estrategia escalable y ecológicamente segura para mejorar la seguridad alimentaria y mitigar la exposición a laAFB 1 en regiones propensas a aflatoxinas.

Introducción

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Las aflatoxinas, especialmente la Aflatoxina B1 (AFB 1), están entre las micotoxinas más significativas debido a su prevalencia, toxicidad e impacto en los humanos. Son producidos por ciertos hongos, principalmente aquellos pertenecientes a la especie Aspergillus 1,2,3. AFB 1 está relacionada con cáncer hepatocelular y es la más peligrosa de todas lasaflatoxinas 4. Estos potentes carcinógenos infectan una variedad de cultivos agrícolas, incluido el maíz (Zea mays L.), lo que genera graves preocupaciones para la seguridadalimentaria 5,6. La presencia deAFB 1 en el maíz no solo afecta al rendimiento y la calidad de los cultivos, sino que también supone una amenaza seria para la salud humana y animal debido a la exposicióndietética 7,8.

Actualmente, el manejo de la aflatoxina se basa principalmente en estrategias postcosecha, como el secado adecuado, la clasificación de granos dañados, tratamientos químicos (por ejemplo, amoníaco u ozono), irradiación y almacenamiento hermético para prevenir el crecimiento de hongos duranteel almacenamiento 9. Las estrategias incluyen una buena gestión de los cultivos, agentes de biocontrol (como la cal) y mejoras en las instalaciones de almacenamiento. También se han probado tratamientos físicos y químicos, como microondas, ultravioleta (UV), luz pulsada, agua electrolizada, plasma frío, ozono, haz de electrones e irradiación gamma. Sin embargo, estos métodos postcosecha suelen ser costosos, intensivos en energía o poco prácticos para su uso generalizado, y no evitan la translocación de aflatoxina dentro de la planta durante el crecimiento.

Los enfoques pre-cosecha que se utilizan incluyen prácticas agronómicas como cultivares resistentes, siembra oportuna, riego para reducir el estrés por sequía y biocontrol con cepas aflatoxigénicas de A. flavus (por ejemplo, Aflasafe), que excluyen competitivamente cepas toxigénicas pero requieren aplicaciones repetidas y pueden no abordar completamente la translocación en el suelo 11,12,13. Estos métodos a menudo enfrentan limitaciones: las intervenciones postcosecha no pueden revertir la contaminación preexistente, incurren en altos costes para la infraestructura de clasificación/almacenamiento en entornos con recursos limitados, corren el riesgo de pérdida de nutrientes o residuos derivados de productos químicos, y la eficacia del biocontrol varía según las condicionesambientales 14.

En cambio, las nanopartículas híbridas CuO-ZnO sintetizadas en verde ofrecen una novedosa estrategia de enmienda del suelo antes de la cosecha. A diferencia de los NP químicos convencionales, la síntesis verde utilizando extractos vegetales (por ejemplo, sustrato de setas) evita disolventes tóxicos, reduce costes y mejora la biocompatibilidad, haciéndolos sostenibles con el medioambiente 15,16. La hibridación CuO-ZnO mejora sinérgicamente la actividad antifúngica al generar especies reactivas de oxígeno (ROS), alterando las membranas fúngicas y proporcionando una gran superficie para la adsorción deAFB 1, evitando así la absorción y translocación en partes comestibles de plantas como los granos. Esto difiere de las estrategias existentes al permitir una intervención temprana en la interfaz suelo-planta, logrando una reducción de hasta un 80-99% deAFB 1 en dosis bajas (por ejemplo, 125 mg/kg), sin comprometer el rendimiento del cultivo ni dejar residuosdañinos 17. Las principales ventajas incluyen la compatibilidad ecológica en comparación con fungicidas químicos, una eficacia superior en comparación con los NP de un solo metal o el biocontrol bajo condiciones variables de campo, y el potencial de integración escalable en prácticas agrícolas en regiones propensas a aflatoxinas como el África subsahariana.

Los NPs de óxido metálico, específicamente el óxido de zinc (ZnO) y el óxido de cobre (CuO), han atraído la atención entre estos materiales debido a sus características antifúngicas y su capacidad para absorbertoxinas 18,19. Por ejemplo, se informó que los NP de Cu tienen la capacidad de crear ROS, que pueden dañar macromoléculas biológicas bacterianas yfúngicas 20. Además, en otro experimento, se demostró que las cepas fúngicas presentan un cambio notable con una clara tendencia al aumento del orden cuando F. solani fue tratado con NPs de CuO basados en quitosano, resultando en el mayor efecto deordenación 21. La síntesis ecológica de NPs ha ganado atención como una alternativa más segura y sostenible a los métodos químicos convencionales, minimizando así subproductos tóxicos y el impacto ambiental15,22.

La hibridación de NPs de CuO y ZnO combina las propiedades beneficiosas de ambos metales, potencialmente mejorando su eficacia para degradar o adsorbirAFB 123,24. Actualmente, estos NPs sintetizados en verde se utilizan principalmente para controlar la producción de FA en cepas fúngicas en experimentos in vitro; por ejemplo, Sheik y Awad estudiaron el impacto de los AgNPs, AuNPs y su mezcla en el crecimiento y la acumulación de aflatoxinaB1 de la cepa aflatoxigénica A. flavus 25. Sin embargo, se desconoce la concentración necesaria para controlar el crecimiento de A. flavus. Por tanto, existe una necesidad crítica de evaluar híbridos verdes CuO-ZnO bajo condiciones relevantes para el campo debido a su impacto en la translocación deAFB 1 desde fuentes modificadas en suelo a tejidos de maíz, en comparación con los NP convencionales. Por tanto, los objetivos de este estudio fueron determinar el efecto de diferentes concentraciones de NPs híbridos verdes de CuO/ZnO sobre la concentración de AFB1/A. flavus en los tejidos de la planta de maíz y evaluar el riesgo deAFB 1 en el maíz tras tratar el maíz con NPs híbridos verdes CuO/ZnO. Las hipótesis de investigación debían proporcionar una base mecanicista para la eficacia observada de NPs híbridos CuO-ZnO sintetizados en verde. Este estudio pone a prueba las siguientes hipótesis medibles: 1) La hipótesis de inhibición antifúngica, según la cual los NP híbridos reducirían significativamente la esporulación de A. flavus y la posterior producción de novo de AFB1 en suelo en comparación con NPs de un solo metal, identificados por menores niveles de carga fúngica y toxinas en el sitio de Molelwane. 2) La hipótesis de adsorción-translocación: en la que la presencia de toxinas preexistentes (sitio del campus), los NPs demostraron una alta afinidad de unión conAFB 1, disminuyendo significativamente la tasa de translocación de toxinas del suelo al sistema radicular del maíz. 3) La hipótesis de biocompatibilidad (fitotoxicidad): según la cual los NP híbridos sintetizados en verde resultarían en una menor acumulación residual de metales y reduciría los marcadores de estrés oxidativo en los tejidos del maíz en comparación con los referentes químicos convencionales, mejorando así la bioseguridad de los cultivos.

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Protocolo

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Sitios experimentales
Las pruebas se realizaron en dos lugares situados a 7 km de distancia; Los lugares fueron inoculados con diferentes tratamientos. En el primer ensayo, se instaló una instalación de red con un 40% de sombra en la Granja de Investigación Molelwane, Universidad del Noroeste (NWU) (25,810°S, 25,630°E, 1276 m) en la provincia noroeste de Sudáfrica. El suelo franco arenoso rojo se clasificó como forma Hutton y contenía un 75% de arena, un 4% de sedimento y un 21% dearcilla 25. El segundo experimento se llevó a cabo en la instalación de red del campus NWU Mafikeng (25.8278 °S, 25.6079 °E, 1276 m). Los suelos del segundo sitio tenían tierra arenosa con 82% arena, 3% limo, 15% arcilla, y anteriormente se clasificaban como Arcadia forma25. Los NP híbridos verdes híbridos CuO/ZnO se sintetizaron en el laboratorio del Departamento de Química, Escuela de Ciencias Físicas y Químicas, Facultad de Ciencias Naturales y Agrícolas, NWU, en Sudáfrica.

Síntesis de NPs híbridos verdes CuO/ZnO
Se añadieron diez (10) g de sustrato seco de hongo usado Pleurotus ostreatus (SMS) a 100 mL de agua desionizada, se calentaron a 70 °C y se removieron durante 2 h26. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se añadieron 30 mL del filtrado a una solución que contenía 2,5 g de acetato de cobre y 2 g de acetato de zinc en 30 mL de agua destilada. El pH de esta solución se ajustaba a 8 usando hidróxido de sodio (NaOH), se calentaba a 80 °C durante 2 horas, se centrifugaba tras la reacción, se secaba durante la noche en horno y se calcinaba a 650 °C durante 2 horas26. Los NP sintetizados se caracterizaron y confirmaron como NPs híbridos verdes CuO/ZnO.

Muestreo y análisis de suelos
Se recogieron muestras de suelo de la University Farm en Molelwane y del sitio de pruebas del campus a profundidades de 0–15 cm y 15–30 cm. Posteriormente fueron categorizados y examinados por sus propiedades físicas y químicas, como describióel 27.

Diseño experimental
El estudio empleó un experimento factorial organizado en un diseño aleatorizado de bloques completos (RCBD) con tres réplicas. Para evaluar la eficacia de los NPs híbridos CuO-ZnO sintetizados en verde bajo diversos escenarios de contaminación, se establecieron dos modos de exposición independientes en sitios distintos: el Sitio 1 (Campus Universitario Noroeste) representó un modelo de contaminación exógena donde el suelo se añadió con AFB1 extraído a una tasa de 160 ppb/kg para evaluar las capacidades directas de adsorción y protección de translocación de los NPs. Sitio 2 (Granja de Investigación Molelwane): Representó un modelo de infección biológica donde el suelo fue inoculado con esporas de A. flavus a 160 esporas/kg para investigar el impacto antifúngico de las NP en la producción de micotoxinas de novo y la posterior absorción de plantas. Las plantas polvorientas se pesaron y mezclaron uniformemente con 1 kg de tierra en una bolsa de plástico para plantar tras la inoculación (esporasAFB 1 o A. flavus ). Cada tratamiento se realizaba por separado y las manos se desinfectaban entre sesiones y tratamientos. Luego, inicialmente se plantaron cuatro semillas de maíz en cada maceta (9 cm de diámetro superior y 6,5 cm de diámetro inferior). Para mantener tres plántulas sanas por maceta, las plántulas se podaron una semana después de nacer. De acuerdo con las recomendaciones para una producción óptima de maíz derivadas del análisis del suelo, el suelo fue fertilizado. Las macetas se colocaron a espaciamientos entre y dentro de filas de 0,75 m × 0,3 m, para un total de 216 macetas. La tierra en macetas se regaba hasta el 60% de la capacidad del campo después de sembrar las semillas. Se recogieron muestras de suelo y planta en tres etapas de desarrollo: V10 (desarrollo), R1 (floración) y R6 (madurez). Las muestras se llevaban al laboratorio en una caja refrigeradora llena de hielo y se mantenían a -20 °C para sus exámenes adicionales. Se utilizaron bolsas de papel marrón para almacenar y congelar las muestras restantes de plantas para las concentraciones deAFB 1 y otros ensayos. Las muestras restantes de plantas para las concentraciones deAFB 1 y otros análisis se guardaban en bolsas de papel marrón y se congelaban hasta el análisis.

Análisis de aflatoxinas de maíz
Los componentes de desarrollo del maíz (raíz, tallo, hoja y grano) en diversas etapas de crecimiento se recogían en bolsas de plástico estériles, se etiquetaban con cuidado y se transportaban al laboratorio. Para mantener la integridad de los datos de crecimiento y asegurar observaciones independientes para cada etapa del desarrollo, se implementó un protocolo de muestreo destructivo. Para eliminar la contaminación cruzada entre concentraciones de nanopartículas y tipos de inoculación, se limpiaron herramientas de cosecha y guantes con etanol al 70% y se enjuagaron con agua desionizada entre cada grupo de tratamiento. Utilizando un mortero, se pulverizaron durante 10 minutos con un mortero y 10 g de material vegetal y 1 g de cloruro de sodio (NaCl) en 25 mL de metanol al 80% y agua destilada al 20%. Para grano de maíz y núcleo de maíz, se mezclaron 25 g de muestra molida y 2,5 g de NaCl con 100 mL de agua destilada al 80% de metanol:20 a alta velocidad durante 10 minutos. Después, el extracto homogeneizado se filtró a través de un filtro de microfibra de vidrio, seguido de un lavado con 20 mL de Tween-2 al 20% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las aflatoxinas se extrajeron de la columna de afinidad inmunitaria tras la elución a un caudal de una gota por segundo, y el sobrenadante (citoplasma) se recogió en un frasco de ámbar. Después, se midieronAFB 1 y otras aflatoxinas siguiendo el método de cromatografíalíquida 28 , que consistía en derivatizar aflatoxinas con solución de O-ftaldialdehído e inyectar los compuestos derivados en un sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). El sistema HPLC estaba equipado con un detector de fluorescencia Jasco FP-920 ajustado a 362 nm de excitación y 425 nm de emisión. LaAFB 1 estaba inherentemente estructurada fisiológicamente para ser detectada en una longitud de onda de excitación de 362 nm. Se utilizó una columna Hichrom (4,6 mm × 150 mm) con partículas de 5 μm, y el reactor de derivatización fue un programa de celda KOBRA a 100 μA. Las separaciones de picos cromatográficos se realizaron en una columna Hichrom a la que se había instalado una precolumna de fase estacionaria similar. El Inertsil ODS-3 y ODS-3 V se usaban como cartuchos de guardia y analítico, respectivamente, mientras que el inyector consistía en un automuestreador con una válvula reodyne. La fase móvil estaba compuesta por agua: metanol (65:35, v/v), bromuro de potasio (119 mg) y 4 M de ácido nítrico (350 μL) por litro, y se bombeaba a un caudal de 1,0 mL/min en un programa isocrático. La detección de aflatoxinas se consideró positiva para cada pico a un tiempo de retención similar al de cada estándar y a una altura cinco veces superior al ruidobasal 29.

Se calcularon los límites de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) y porcentaje (%) de recuperación para confirmar el enfoque analítico del HPLC, utilizando las ecuaciones 1, 2 y 3, respectivamente. La LOD es la concentración más baja de aflatoxina que puede distinguirse de forma fiable del ruido de fondo, mientras que la LOQ es la concentración más baja de aflatoxina que puede medirse cuantitativamente con una precisión y exactitudaceptables, 30. AFB 1 y sus metabolitos se recuperaron añadiendo 10 μL de estándares totales de aflatoxina (AFB 1,AFB 2, AFG1 y AFG2) a las muestras de control de maíz negativas en triplicado. Las muestras se extrajeron después utilizando HPLC utilizando los procedimientos mencionados anteriormente.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

figure-protocol-13

Por lo que: "X" es la concentración media de los valores en blanco de la muestra fortificada, y "s" es la desviación estándar de la muestra.

Estimación de exposición AFB1
Se utilizaron los niveles medios de aflatoxina en la dieta de maíz, la ingesta diaria de maíz y el peso corporal medio (niños, adultos, ganado de carne, vacas lecheras y pollitos) para calcular la ingesta diaria estimada (EDI). La EDI media de aflatoxinas se calculó según la ecuación 2 y se expresó en (ng/kg peso corporal/día); para el cálculo del índice de peligro (HI), los valores de EDI se convirtieron a ng/kg peso corporal/día (1 ppb/kg/día = 1.000 ng/kg peso corporal/día) para coincidir con las unidades de TD503231.

figure-protocol-24

Evaluación y caracterización de riesgos
El índice de peligro (HI) se calculó dividiendo el EDI por el TD50 y multiplicándolo por un factor de seguridad de 50.000. La dosis tóxica mediana (TD) 50 es la dosis necesaria (ng/kg/peso corporal/día) para causar tumores en el 50% de los animales de prueba que no habrían desarrollado tumores a la dosiscero 31,32.

Análisis de datos
Se realizó un análisis de varianza sobre los datos recopilados de crecimiento y rendimiento utilizando el procedimiento RCBD en SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). Se realizaron múltiples comparaciones de medias de mínimos cuadrados utilizando la prueba33 de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.

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Resultados

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Concentración de aflatoxina en los componentes del crecimiento
Los resultados mostraron que se detectaron concentraciones de aflatoxina en los componentes de crecimiento y en granos de maíz tratados con NPs de CuO/ZnO sintetizados en verde, lo que indica la presencia de todos los principales tipos de aflatoxinas (AFG2, AFG1, AFB2 yAFB 1). Las curvas de calibración utilizadas para calcular la...

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Discusión

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El éxito de este protocolo para reducir la translocación y acumulación deAFB 1 en el maíz depende de varios pasos críticos que aseguren tanto la eficacia biológica como la fiabilidadanalítica 16,27. Los resultados demuestran que 125 mg/kg de NPs híbridos de CuO-ZnO sintetizados en verde redujeron significativamente las concentraciones deAFB 1 en ambos modelos experimentales, aunque mediante mecanismos potenc...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por una beca doctoral de la Universidad del Noroeste y una beca para la facultad de Ciencias Naturales y Agricultura.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetato de cobre(II) [Cu(CO2CH3)2]Sigma-Aldrich Pty, St. Louis, MO, EE. UU.10,53,753Sólido cristalino azul oscuro-verde (98% de pureza)
Filtro de microfibra de vidrio  Sigma-Aldrich Pty, St. Louis, MO, EE. UU.1703965Vidrio borosilicato  
Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)Shimadzu20H2Para separación y cuantificación de analitos  
Etanol de grado HPLCSigma-Aldrich Pty, St. Louis, MO, EE. UU.34923disolvente incoloro de alta pureza ( ≥ 99 %)
Metanol de grado HPLCMerck KGaA, Darmstadt, Alemania322415disolvente incoloro de alta pureza ( ≥ 99 %)
Columna de afinidad inmunitariaShimadzuKJ524Para la purificación selectiva de analitos objetivo
Semillas de maíz de PAN 5R-590RNWKN/AGranos pequeños y duros con coluor blanco
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Merck KGaA, Darmstadt, Alemania3526580Una solución tampón isotónica  
Bolsas de plásticoEco-Agro Enterprise (Pty) LtdN/APerforado
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 y AFs purificados en total in situLaboratorio Analítico Trilogy, Inc (Vossbrink Drive, WA, EE. UU.)TAS-M12DA1-10Sólido cristalino blanco a blanco roto
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-Aldrich Pty, St. Louis, MO, EE. UU.N/ASólido cristalino blanco
Acetato de zinc [Zn(CH3COO2)2H2O]Productos químicos VWR2331 210 2Sólido cristalino blanco (99 % de pureza)

Referencias

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