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Artículo de método

Aislamiento y cultivo de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón

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DOI:

10.3791/70909

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17 de julio de 2026

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1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para el aislamiento y cultivo primario de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) a partir de tejido cerebral murino neonatal, con el fin de generar un modelo in vitro robusto para estudiar la función de la barrera hematoencefálica bajo condiciones fisiológicas y patológicas.

Resumen

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) son el principal componente celular de la barrera hematoencefálica (BBB) y desempeñan un papel clave en la regulación del transporte molecular y el mantenimiento de la homeostasis del sistema nervioso central. Modelos in vitro fiables del endotelio cerebral son esenciales para estudiar la fisiología y disfunción de la BBB en enfermedades neurológicas y sistémicas. Se describe un protocolo reproducible para el aislamiento y cultivo primario de BMECs de la corteza cerebral murina neonatal. El método incluye disección de tejido cortical, disociación mecánica y enzimática, eliminación de restos de mielina mediante un gradiente de densidad sérica de albúmina bovina (BSA) y enriquecimiento de células endoteliales mediante inmunoselección basada en CD31. Las células aisladas se cultivan posteriormente en placas recubiertas de colágeno y se caracterizan mediante evaluación morfológica, detección por inmunofluorescencia de marcadores endoteliales, ensayos de formación de tubos angiogénicos y mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) para evaluar las propiedades de la barrera. Este protocolo proporciona un enfoque fiable para obtener cultivos primarios de BMEC adecuados para investigar la biología de la BBB, la señalización endotelial y las interacciones neurovasculares bajo condiciones fisiológicas y patológicas.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BBB) es una estructura altamente especializada que regula estrictamente el intercambio de sustancias entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulaciónsistémica. La BBB se forma principalmente por células endoteliales microvasculares cerebrales conectadas por uniones estrechas. Estas células endoteliales funcionan dentro de un sistema multicelular conocido como unidad neurovascular (NVU), que también incluye astrocitos, perícitos, neuronas, células gliales y la membranabasal 2. Entre estos componentes, las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) desempeñan un papel central al formar una capa continua con uniones estrechas, miles de sistemas transportadores selectivos, tráfico vesicular limitado y restringir la infiltración de células inmunitarias mediante una baja expresión de moléculas de adhesión que limitan el paso de solutos y células hacia el parénquimacerebral 3,4.

Además de su papel como barrera física y selectiva, los BMEC participan activamente en procesos esenciales, incluyendo la señalización neurovascular, la regulación del flujo sanguíneo cerebral, las respuestas inmunitarias locales y, en particular, la angiogénesiscerebral 5. Este último proceso es clave durante el desarrollo embrionario, pero también se reactiva en condiciones patológicas como el ictus, la isquemia o la inflamación. Los BMEC responden a señales proangiogénicas como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario (PLGF), coordinando la formación y maduración de nuevosvasos 6,7. Así, una disfunción endotelial cerebral comprometería gravemente la integridad de la BBB y la homeostasis cerebral.

Estudiar los BMECs in vitro nos permite modelar tanto la fisiología del BBB como los mecanismos que regulan la angiogénesis cerebral. Sin embargo, aislar estas células del tejido cerebral plantea importantes desafíos técnicos debido a la complejidad del tejido neural, la abundancia de mielina y la necesidad de obtener cultivos con alta pureza endotelial. Aunque existen líneas celulares inmortalizadas disponibles, presentan limitaciones significativas en cuanto a su fenotípica y representatividadefuncional 8.

En este contexto, los protocolos para el cultivo primario de BMECs a partir de modelos murinos neonatales constituyen una poderosa herramienta experimental, ya que preservan muchas de las características morfológicas, moleculares y funcionales del endotelio cerebral in vivo. Sin embargo, varios protocolos establecidos para el aislamiento de BMEC murino se basan en la disociación mecánica combinada con gradientes de densidad (dextrán o Percoll), lo que a menudo produce enriquecimiento endotelial variable y contaminación residual por pericitos, astrocitos y restos demielina 9. La purificación basada en antibióticos usando puromicina mejora la pureza endotelial (hasta ~95%), pero puede introducir estrés celular debido a su inhibición de la síntesis de proteínas y a los posibles efectos sobre el fenotipoendotelial 10. Alternativamente, los enfoques basados en Filtración Celular Activada por Fluorescencia (FACS) proporcionan poblaciones altamente purificadas pero requieren equipos especializados y un procesamiento extenso, lo que puede reducir la viabilidad y escalabilidad11. Los protocolos neonatales más recientes evitan gradientes de densidad y reducen el número de pasos de centrifugación, mejorando el rendimiento y limitando la contaminación12.

Partiendo de este contexto, este trabajo describe un protocolo optimizado para aislar y cultivar células endoteliales a partir de la microvasculatura cerebral neonatal de ratón. Este método combina disección anatómica precisa, digestión enzimática eficiente, eliminación de mielina mediante un gradiente de albúmina sérica bovina (BSA) y enriquecimiento por inmunoselección con microesferas magnéticas conjugadas al marcador CD31. El protocolo permite obtener cultivos primarios viables, reproducibles y enriquecidos, adecuados para estudios de angiogénesis cerebral, interacción neurovascular, señalización endotelial y disfunción de la BBB bajo condiciones tanto fisiológicas como patológicas.

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Protocolo

El Comité de Bioética y Bioseguridad de la Universidad de Bío-Bío aprobó este proyecto (beca Fondecyt 1240925). El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con los principios fundamentales de las tres R en el uso de animales deexperimentación 13 y conforme a las recomendaciones de las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicadas por los Institutos Nacionales de Salud de losEstados Unidos 14. Los animales se mantenían en ambientes adecuados en el Bioterium de la Universidad de Bío-Bío bajo condiciones de alojamiento estándar (ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperatura controlada de 22 ± 2 °C, con acceso ad libitum a alimento y agua).

Para obtener las células, se utilizaron ratones preñados tipo salvaje (C57BL/6), de entre 4 y 6 meses. Tras el parto, las crías permanecieron con la madre hasta el día 5 (P5) postnatal. En ese momento, la descendencia fue profundamente anestesiada con isoflurano hasta la pérdida de reflejos antes de la eutanasia. La hipotermia se usaba únicamente como complemento para minimizar el movimiento y era seguida inmediatamente por la decapitación. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Eutanasia de Animales (2020)15 de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) y las normativas internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH)14. La corteza cerebral fue aislada y utilizada para desarrollar este protocolo experimental (véase el Paso 3 del Protocolo). La Tabla de Materiales enumera los materiales y anticuerpos utilizados en este protocolo.

1. Preparación del medio de cultivo endotelial

  1. Para preparar 500 mL de medio de cultivo para células endoteliales del cerebro murino, en un recipiente estéril, mezclar 250 mL de DMEM suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 250 mL de medio de cultivo celular endotelial complementado con un 10% de FBS.
    NOTA: El medio de cultivo proporciona factores esenciales de crecimiento endotelial y favorece la proliferación celular. Si el producto referenciado (véase la Tabla de Materiales) no está disponible, se pueden añadir suplementos equivalentes de células endoteliales (por ejemplo, ECGS, hidrocortisona y L-glutamina) a DMEM + FBS para lograr condiciones de crecimiento similares16.
  2. Filtra todo el medio (10% FBS) mediante un filtro de 0,22 μm para asegurar la esterilidad.
  3. Guarda el medio preparado a 4 °C hasta su uso. Prepara el medio fresco cada 2–4 semanas para mantener la actividad del factor de crecimiento.

2. Recubriendo las placas de cultivo

NOTA: Para promover la adherencia celular y mantener el fenotipo endotelial, las placas de cultivo deben estar pre-recubiertas con colágeno tipo I. Los pasos de este proceso son los siguientes:

  1. Prepara la solución de prerecubrimiento mezclando colágeno tipo I (0,1 mg/mL), M de ácido acético para solubilizar el colágeno y medio basal estéril para alcanzar un volumen total de 15 mL. Mezcla suavemente hasta que el colágeno esté completamente disuelto y ajusta la solución a pH 4,0 si es necesario. Filtra la solución con un filtro de 0,22 μm y déjala en hielo hasta el uso para preservar la estabilidad del colágeno.
    NOTA: El colágeno tipo I imita la membrana basal, apoya la unión de las células endoteliales y ayuda a mantener el fenotipo celular.
  2. Homogeneizar la solución en condiciones estériles. Aplica la solución de forma uniforme para cubrir toda la superficie de las placas de cultivo.
    NOTA: Solo se utiliza el volumen necesario para cubrir la superficie.
  3. Incuba las placas a 37 °C durante la noche (12–16 h) para permitir que el colágeno se adsorba correctamente. Antes de sembrar las células, retira el exceso de solución de recubrimiento y lava las placas dos veces con solución fisiológica estéril 1x tamponada con fosfato (1x PBS, pH 7,4) para eliminar el ácido residual y el colágeno no unido.

3. Aislamiento de cultivos celulares mixtos cerebrales

NOTA: Este protocolo se basa en informesprevios 9,17 que pretendían aislar los BMECs de la corteza cerebral de ratones P5.

  1. Sacrificar cinco crías de P5 usando anestesia profunda con isoflurano; Utiliza la hipotermia solo como complemento, seguida de la decapitación cervical.
    NOTA: A partir de este paso, todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica de flujo laminar.
  2. Recoge los cerebros (Figura 1A) y colócalos en PBS frío estéril (1x) en un tubo cónico de 50 mL hasta que todos los cerebros estén procesados.
  3. Separa las meninges enrollando cuidadosamente cada cerebro sobre una membrana de nitrocelulosa esterilizada. Transfiere los cerebros a una placa de 100 mm que contenga PBS frío (1x). Utilizando un bisturí estéril, retirar el tronco encefálico, el cerebelo, el tálamo y el bulbo olfativo (Figura 1B, C).
  4. Recoge las cortezas cerebrales libres de meninges resultantes y guárdalas en PBS frío (1x). Transfiere inmediatamente toda la corteza cerebral a un tubo cónico de 50 mL que contiene 5 mL de PBS 1x sobre hielo (Figura 1D).
  5. Disociar mecánicamente el tejido con tijeras estériles, seguidas de una pipeta de 1 mL hasta que no se observen piezas y la suspensión sea homogénea (Figura 1E).
    NOTA: La punta de la pipeta puede cortarse para reducir el estrés mecánico durante la trituración. La disociación tisular se logra mediante succión controlada y pipeteo suave, mientras que una abertura más ancha en la punta minimiza las fuerzas de corte y la lisis celular mecánica, preservando así la viabilidad celular.
  6. Recoge todos los tejidos y colócalos en tubos de 15 mL.
  7. Para digerir el tejido, transfiere la muestra a un tubo cónico estéril de 15 mL que contiene 2 mL de solución de colagnosa (2 mg/mL en DMEM) e incubar durante 2 horas a 37 °C sobre un agitador orbitario a 180 rpm.
  8. Tras la digestión, añadir 5 mL de DMEM suplementado con un 10% de FBS a la suspensión y centrifugar a 3.000 × g . durante 10 minutos (véase la Figura 1F). Descarta el sobrenadante.
  9. Para eliminar mielina, resuspende el pellet en 4 mL de 20% de BSA en PBS (p/v) y centrifuga a 3.000 × g durante 20 minutos (Figura 1G). Tras la centrifugación, retira cuidadosamente la capa superior lechosa que contiene mielina usando una pipeta Pasteur y descarta cualquier sobrenadante restante (Figura 1H).
  10. Suspende el pellet en 2 mL de DMEM que contenga un 10% de FBS, luego centrifuga de nuevo a 3.000 × g . durante 10 minutos. Descarta el sobrenadante y luego vuelve a suspender suavemente el último pellet en 1 mL de DMEM que contenga un 10% de FBS.
    NOTA: En esta etapa, la resuspensión final contiene una población heterogénea de células derivadas del cerebro como resultado de la disociación tisular. Esta mezcla puede incluir células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos, pericitos y otras células neuronales. Se requieren pasos posteriores de purificación y cultivo para enriquecer selectivamente los BMEC.
  11. Antes de emplacar las células aisladas, retira la solución de recubrimiento de las placas de cultivo preparadas (véase el Paso 2.3) y enjuaga cada pozo dos veces con PBS estéril (1x).
  12. Siembra las células resuspendidas (paso 3.10) sobre las placas recubiertas (recomendado: platos de 60 mm).
    NOTA: Normalmente, toda la suspensión celular obtenida de un aislamiento se distribuye en uno o dos recipientes recubiertos, cada uno con 5 mL de medio endotelial de crecimiento.
  13. Mantener los cultivos en un medio celular endotelial a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂. Cambia el medio cada 2–3 días. Cuando los cultivos alcanzan una confluencia del 90–100%, se procede a la inmunoselección utilizando perlas recubiertas de CD31 para enriquecer las células endoteliales.
    NOTA: Tras el aislamiento y el establecimiento inicial del cultivo, el procedimiento suele arrojar aproximadamente 5 × 106 células por preparación, que se adhieren a placas recubiertas de colágeno y desarrollan la morfología característica de adoquines de las monocapas endoteliales.

4. Aislamiento de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) utilizando perlas magnéticas CD31

  1. Preparación y desprendimiento de células
    1. Una vez que los cultivos alcanzan una confluencia del 90–100%, lava las células 3 veces con PBS (1 vez) para eliminar el medio residual.
    2. Añade 1 mL de tripsina (0,5% 1x) a la placa e incuba durante 3–5 minutos a 37 °C para desprender las células.
    3. Neutraliza la tripsina añadiendo 1 mL de medio de cultivo endotelial con un 10% de FBS. Transfiere la suspensión de la celda (~2 mL) a un tubo de microcentrífuga estéril y centrifuga a 220 × g. durante 10 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
  2. Preparación de perlas magnéticas CD31
    1. Coloque 8 μL de perlas magnéticas CD31 en un nuevo tubo de 15 mL. Lava las perlas con 1 mL de solución de Hank al 1%, resuspendiéndolas suavemente moviendo el tubo.
    2. Coloca el tubo sobre un imán durante 2 minutos para precipitar las cuentas. Retira cuidadosamente el sobrenadante sin mover las cuentas. Repite el paso de lavado 3 veces.
      NOTA: Siempre trabaja cerca del imán para evitar perder las perlas y realiza este paso en condiciones estériles para evitar la contaminación del cultivo celular primario.
  3. Incubación de células con perlas
    1. Resuspende el pellet celular en 1 mL de solución de Hank al 1% que contiene FBS (para reducir la unión inespecífica).
    2. Transfiere las celdas al tubo que contiene las perlas prelavadas usando una pipeta de 1.000 μL. Incuba la mezcla sobre hielo agitando suavemente durante 20 minutos.
  4. Separación magnética de células endoteliales
    1. Coloca el tubo sobre un imán durante 3 minutos para precipitar células endoteliales ligadas a perlas.
    2. Quita el sobrenadante con cuidado.
      NOTA: En esta etapa, se pueden purificar dos tipos celulares aislados: una célula endotelial (véase el paso 4.5) y una mezcla de diferentes tipos de células cerebrales. En este punto, hay dos opciones disponibles.
      1. Retira y descarta el sobrenadante (es decir, la mezcla de células cerebrales) manteniendo el tubo sobre el imán. Lava las células unidas a la perla (es decir, celdas CD31+ ) con 2 mL de solución de Hank y repite 3 veces.
      2. Utiliza el sobrenadante que contiene residuos celulares para generar un nuevo cultivo que contiene células no seleccionadas (por ejemplo, fibroblastos, astrocitos, microglías, neuronas, perícitos, entre otros).
  5. Cultivo de BMECs purificados
    1. Resuspender las células endoteliales unidas a las perlas en 7 mL de medio endotelial completo (10% FBS).
    2. Siembra las células sobre una placa de 60 mm previamente recubierta con colágeno durante la noche (véase la sección 2). Incubar en condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: El fenotipo endotelial se conserva hasta el pasaje (p) 3 bajo las condiciones descritas en el cultivo. Para mantener las propiedades relacionadas con la barrera hematoencefálica, se recomienda realizar ensayos experimentales utilizando pasajes tempranos (p0–p3).

5. Caracterización celular

  1. Observación microscópica de células capturadas por perlas
    NOTA: Bajo las condiciones de cultivo descritas en este protocolo, los BMECs primarios pueden mantenerse típicamente durante hasta tres vías (p3) preservando su morfología y fenotipo endoteliales característicos. Dependiendo de la densidad de siembra y la tasa de crecimiento, los cultivos generalmente pueden mantenerse hasta aproximadamente 2–3 semanas in vitro antes de que puedan producirse cambios fenotípicos significativos.
    1. Tras la inmunoselección con perlas magnéticas CD31, observa las células unidas bajo un microscopio de contraste de fase (Figura 2A).
      1. Busca células endoteliales CD31-positivas que presenten una morfología típica de adoquines y que formen monocapas homogéneas en un plazo de 5–7 días.
        NOTA: Durante la inmunoselección, las perlas magnéticas recubiertas de CD31 se unen específicamente a las células endoteliales, enriqueciendo así la población endotelial. Tras el proceso de selección, las perlas (aproximadamente 4,5 μm de diámetro) pueden seguir observándose asociadas o internalizadas por las células endoteliales durante los primeros pasajes. Estos suelen disminuir con lavados posteriores y el mantenimiento del cultivo, y no interfieren con la viabilidad de la BMEC ni con el crecimiento celular (Figura 2B).
      2. Utilizar la morfología uniforme y la ausencia de células alargadas o similares a los de astrocitos para estimar la pureza de la población endotelial.
  2. Inmunofluorescencia para CD31 y GLUT1
    1. Semilla 2 × 103 BMECs sobre mantas cubiertas de colágeno y cultivo hasta alcanzar una confluencia del 80–90%.
    2. Fija las células con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente (22–25 °C) y lava con PBS.
    3. Permeabiliza con 0,1% de Triton X-100 durante 5 minutos y bloquea la unión no específica con un 5% de BSA durante 30 minutos.
    4. Incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CD31 y GLUT1 (transportador de glucosa específico para endotelio cerebral).
    5. Lavar con PBS e incubar durante 1 hora con los anticuerpos secundarios fluorescentes adecuados.
    6. Contratiner los núcleos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y montar los cobertores con un medio de montaje antifade.
    7. Visualiza bajo un microscopio de fluorescencia o confocal. Busca CD31 localizado en los bordes celulares (Figura 3A), mientras que GLUT1 muestra la distribución citoplasmática y de membranas, confirmando la identidad endotelial y el fenotipo del endotelio cerebral (Figura 3B).
      NOTA: Imágenes representativas de aislamientos independientes de BMEC demuestran la morfología típica y la expresión de marcadores de los BMEC cultivados. La presencia de proteínas de unión estrecha, como la claudina-5, también puede utilizarse para caracterizar el endotelio cerebral. Para evaluar mejor la pureza de los cultivos endoteliales, se puede realizar una tinción adicional por inmunofluorescencia utilizando marcadores negativos para otros tipos de células neuronales. Por ejemplo, la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) puede usarse para detectar astrocitos, y la molécula adaptadora ionizada de unión al calcio 1 (Iba1) para identificar células microgliales. La ausencia de tinción para estos marcadores confirma la ausencia de contaminación por parte de estas poblaciones celulares no endoteliales (Figura 3C,D).
  3. Ensayo de formación de tubos
    NOTA: Las células endoteliales exhiben capacidad proangiogénica en los ensayosMatrigel 18, y la identidad endotelial puede confirmarse mediante este ensayo.
    1. Pre-recubre una placa de 96 pozos con Matrigel y deja que polimerice durante 30 minutos a 37 °C.
    2. Semilla 1 × 104 BMECs por pozo en 100 μL de medio endotelial completo (FBS al 10%). Incubar a 37 °C y monitorizar la formación del tubo durante 4–8 horas usando un microscopio de contraste de fase (Figura 4A).
    3. Cuantifica la longitud total del tubo, número de uniones y mallas usando ImageJ (plugin Angiogenesis Analyzer)19. (Figura 4B).
      NOTA: La capacidad de los BMEC para formar estructuras tubulares interconectadas confirma su potencial angiogénico y su funcionalidad endotelial.
  4. Medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER)
    NOTA: Las células endoteliales cerebrales deben formar una barrera estricta, ya que son un componente crítico de laBBB 20. Es necesario confirmar la capacidad endotelial para generar una barrera eléctrica.
    1. Siembra 20.000 BMECs en insertos Transwell recubiertos de colágeno (tamaño de poro 0,4 μm) en el compartimento superior y cultiva hasta que alcancen la confluencia.
    2. Mide el TEER usando un voltohmiómetro epitelial para evaluar la integridad de la monocapa. Registrar los valores TEER diariamente hasta la estabilización; un aumento de la resistencia indica la formación de uniones intercelulares estrechas, características de las barreras endoteliales funcionales (Figura 4C).
      NOTA: Los restos de la mezcla celular no seleccionada, incluidos los astrocitos, pueden usarse para generar un sistema de cocultivo. Esta configuración requiere una optimización cuidadosa de la proporción celular entre los compartimentos superior (BMEC) e inferior (mezcla celular no seleccionada), lo cual debe estandarizarse en cada laboratorio. Esta configuración de cocultura fue adaptada de los modelosBBB 21 descritos anteriormente.
    3. Siembra la mezcla celular no seleccionada (paso 4.4.2.2) en el pozo inferior de la placa de cultivo y los BMECs en el lado superior de la membrana de inserción Transwell.
      NOTA: Se incluyó un experimento representativo que comparaba las condiciones de monocultivo y cocultivo para evaluar la estanqueidad de la barrera mediante mediciones TEER (Figura 4C).

6. Expansión y mantenimiento de BMECs purificados

  1. Condiciones culturales
    1. Mantener los BMECs purificados en un medio de cultivo endotelial completo (10% FBS) a 37 °C en una incubadora humidificada (95% de humedad) con 5% de CO₂. Cambia el medio de cultivo cada 2–3 días para proporcionar nutrientes frescos y mantener la viabilidad celular.
  2. Monitorización del crecimiento y morfología celular
    1. Observa los cultivos diariamente bajo un microscopio de contraste de fase para monitorizar la inserción, el crecimiento y la morfología celular. Busca la morfología característica de adoquines de los BMECs, que forman una monocapa confluente en 5–7 días.
  3. Subcultura y paso
    1. Cuando los cultivos alcanzan una confluencia del 80–90%, se desprende las células usando tripsina del 0,05–0,1% durante 3–5 minutos a 37 °C.
    2. Neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio completo, centrifugar a 220 × g. durante 10 minutos a 4 °C y volver a suspender el pellet en un medio endotelial fresco.
    3. Siembra las células en placas recubiertas de colágeno a la densidad deseada para una expansión continua.
      NOTA: Limitar los conductos de BMEC a 3–5 para mantener el fenotipo endotelial y la integridad funcional.
  4. Criopreservación opcional
    1. Para almacenamiento a largo plazo, resuspende los BMECs en medio congelante (10% de DMSO en medio endotelial completo). Congela gradualmente hasta –80 °C en un congelador de tasa controlada, luego transfiere a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

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Resultados

El protocolo descrito aquí permite el aislamiento y cultivo de BMECs primarios de ratones neonatales (P5). Estas células son el principal componente celular de la BBB y, por tanto, constituyen una valiosa herramienta experimental para estudiar la fisiología cerebrovascular y la fisiopatología. Se demostró el aislamiento y cultivo exitosos de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) mediante evaluaciones morfológicas, fenotípicas y funcionales.

E...

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Discusión

El aislamiento de los BMEC es una herramienta fundamental para estudiar los mecanismos que regulan la fisiología de la BBB y su disfunción en diversas patologías del sistema nervioso central (SNC) 4,9, incluido el ictus. A diferencia de las líneas celulares inmortalizadas, los cultivos primarios de BMEC preservan características fenotípicas y funcionales clave del endotelio cerebral, incluyendo la expresión de proteínas fuertemen...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Partes de este manuscrito fueron escritas con ChatGPT de OpenAI (GPT-4, versión de julio de 2025) para mejorar la claridad, el lenguaje y la coherencia. Los autores revisaron críticamente, editaron y aprobaron todo el contenido asistido por IA. No se utilizaron herramientas de IA para el análisis de datos, la interpretación de resultados ni la generación de conclusiones científicas.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los investigadores de GRIVAS Health y NEUROVAS por sus valiosas aportaciones. Este estudio fue financiado por Fondecyt Regular 1240295.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
60 mm culture platesCorning430166
96 Well culture platesCorning41122107
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283
Antibiótico-antimicótico (opcional)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (488 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Pipetas automáticas y serológicas Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Medio basal (para solución de colágeno)Gibco (DMEM)11965092
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenasa tipo IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (alta glucosa)Thermo Fisher Scientific11965092
Medio Completo EndoGRO-MVMerck MilliporeSCME004Medio de crecimiento de células endoteliales
Tubos Falcon (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Suero Fetal Bovino (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Microscopio de fluorescenciaMoticBA410
Guantes, mascarillas, consumibles de laboratorioVarios proveedores—
Heparina (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Microscopio invertidoOlympus CKX41
Imán de separación magnéticaEasySep  NC9284020
Agitador orbital (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Centrífuga refrigeradaHITACHICT5RE
EscálpelFine Science ToolsVarios
Tijeras y pinzas finasFine Science ToolsVarios
Membrana de nitrocelulosa estérilBIO-RAD1620094
Colágeno tipo ICorning 30394

Referencias

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