Generación y diferenciación de organoides epiteliales olfativos humanos a partir de células madre adultas

Resumen

Este protocolo describe un enfoque establecido para aislar células progenitoras olfativas de tejido adulto superior de cornetes humanos para generar organoides epiteliales olfativos. También detalla una estrategia de inducción química para impulsar la diferenciación de estos organoides en neuronas sensoriales olfativas maduras, permitiendo así el modelado de la neurogénesis olfativa humana.

Resumen

El epitelio olfativo humano posee una notable capacidad neurogénica, sostenida por una población residente de células madre basales; Sin embargo, establecer un modelo dinámico in vitro que recapitule fielmente este proceso regenerativo ha resultado un desafío. Aquí presentamos un protocolo establecido para generar organoides olfativos a partir de células progenitoras aisladas de tejido de cornetes superiores humanos adultos. Estos organoides mantienen la talla, como lo demuestra la expresión de SOX2, y muestran un patrón de diferenciación espacialmente organizado, caracterizado por la expresión uniforme del marcador neuronal inmaduro GAP43 y la localización periférica del marcador sensorial olfativo maduro OMP. Una diferenciación dirigida posterior con el inhibidor de Notch LY411575, el activador de Wnt CHIR-99021 y ácido retinoico generó células sensoriales olfativas similares a neuronas que coexpresaban OMP y el marcador neuronal Tuj1 (clase III β-tubulina). Este modelo derivado del ser humano sortea las limitaciones de los sistemas murinos y proporciona una sólida plataforma in vitro para estudiar la neurogénesis olfativa, la anosmia asociada a la COVID-19 y otros trastornos neurodegenerativos relacionados con el olfacto.

Introducción

El sistema olfativo humano sostiene la neurogénesis ^continua,1 un proceso impulsado principalmente por células madre basales en el epitelio olfativo, concretamente, células basales horizontales (HBC) y células basales globosas (GBC). ^2,3 GBC se diferencian constitutivamente en neuronas sensoriales olfativas (OSN), mientras que los HBC permanecen en reposo hasta que se activan por una lesión. ^4,5 La percepción olfativa comienza cuando moléculas de odorante se unen a los receptores en los cilios de los OSN, desencadenando una cascada de transducción de señales que transmite información al bulbo olfativo y a la corteza. ⁶ El desarrollo y mantenimiento de esta función sensorial está gobernado por el epitelio olfativo.

La disfunción olfativa causada por insultos físicos, químicos o biológicos suele resolverse espontáneamente. ⁷ No obstante, afecta entre el 1,5% y el 25% de la población^{mundial 8} y puede deberse a diversas etiologías, incluyendo traumatismos,9 infecciones,10 y trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson¹¹; En estos casos, la recuperación espontánea suele ser incompleta o ausente. Los enfoques terapéuticos actuales, como el entrenamiento olfativo y la administración de corticoides, muestran una eficacia limitada. ^12,13 Esta brecha terapéutica se debe a una comprensión incompleta de los mecanismos que rigen la supervivencia y regeneración olfativa del neuroepitelio tras una lesión, una brecha de conocimiento agravada aún más por la insuficiencia de modelos in vitro existentes para estudiar la biología olfativa humana.

En los últimos años, el desarrollo de diversos modelos organoides humanos ha creado nuevas plataformas tecnológicas para el estudio de enfermedades humanas. Se han generado ^{con éxito 14} organoides derivados de células madre adultas (AdSC), también denominadas células madre residentes en tejidos, para una variedad de tejidos derivados de endodermos, incluyendo estómago, hígado, páncreas, pulmones y vejiga. 15,16,17,18,19 En contraste, establecer organoides epiteliales olfativos humanos a partir de la placa olfativa derivada de ectodermos sigue siendo un reto técnico. Un gran desafío práctico es la dificultad de obtener de forma constante tejido epitelial olfativo viable del cornete superior humano. La ubicación y extensión de la región olfativa varían considerablemente entre individuos y sufren una degeneración marcada relacionada con la edad. La acumulación inadvertida de epitelio respiratorio en lugar de olfativo compromete los resultados del cultivo. Para abordar esto, refinamos el protocolo de 2021 de Ren et al., quienes cultivaron con éxito clústeres celulares a partir de mucosa olfativa ^humana,20 para generar organoides epiteliales olfativos humanos de forma fiable. Nuestro enfoque genera organoides epiteliales olfativos humanos con una arquitectura tridimensional y organizada jerárquicamente y apoya su diferenciación en neuronas sensoriales olfativas. Este modelo proporciona una valiosa plataforma experimental para investigar los mecanismos que determinan el destino de las células madre epiteliales olfativas y para el cribado de posibles agentes terapéuticos para trastornos olfativos.

Para resumir explícitamente, el objetivo principal de este método es establecer un flujo de trabajo estandarizado para generar y diferenciar organoides epiteliales olfativos humanos a partir de células progenitoras adultas. La razón de este enfoque es abordar la brecha crítica creada por la ausencia de modelos in vitro fisiológicamente relevantes del sistema olfativo humano. En comparación con cultivos monocapa bidimensionales tradicionales (2D) o modelos murinos, este sistema tridimensional (3D) derivado del ser humano ofrece la clara ventaja de recapitular fielmente la compleja organización espacial y el contexto genético específico del ser humano de la mucosa olfativa. Para que los investigadores consideren este protocolo, es esencial reconocer que el aislamiento preciso del epitelio olfativo viable del cornete superior humano, evitando la contaminación con epitelio respiratorio, es excepcionalmente complicado y está muy influenciado por la edad del paciente y la variación anatómica individual. Por ello, este protocolo es especialmente adecuado para investigadores que tienen acceso constante a muestras clínicas humanas y buscan modelar la neurogénesis olfativa humana, la anosmia inducida por virus o los déficits olfativos asociados a trastornos neurodegenerativos.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo con la aprobación del Comité de Revisión Institucional (IRB) del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (Aprobación nº 2024 (31)). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes antes de la recogida de tejidos y la publicación de datos. Se obtuvieron muestras de tejido de cornetes superiores de pacientes sometidos a cirugía endoscópica de la base del cráneo o cirugía de seno etmoideo por rinorrea del líquido cefalorraquídeo.

1. Procesamiento y transporte de muestras de tejido

1. Inmediatamente después de la recogida, se colocan las muestras de tejido en un medio de transporte preenfriado y estéril, compuesto por medio basal DMEM/F12/HEPES suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina–estreptomicina, y transpórtalas al laboratorio a 4 °C.
   NOTA: El suero ayuda a mantener la viabilidad celular, mientras que la mezcla de antibióticos previene la posible contaminación microbiana durante el transporte. Mantén el tiempo de transporte por debajo de 2 horas para mantener la viabilidad celular.

2. Preprocesamiento de tejidos (realizado sobre hielo)

1. Transfiere la muestra a una placa de cultivo prefría y estéril, retira el medio de transporte y lava el tejido con un tampón PBS modificado que contiene una solución de penicilina y estreptomicina al 5%. Realiza el lavado de la siguiente manera: añade 5 mL de solución de lavado preenfriada al plato, golpea suavemente el pañuelo 5–7 veces y luego aspira completamente el líquido. Repite este ciclo de lavado 3 veces para eliminar células sanguíneas y restos de tejido.
2. Con microtijeras estériles, pica el tejido en fragmentos de aproximadamente 1–2^mm3.
   NOTA: Durante este paso, mantén la hidratación de los tejidos, fíjalo con pinzas de punta roma y minimiza el tiempo de recorte para preservar la viabilidad celular.

3. Digestión enzimática

1. Transfiere el tejido disociado mecánicamente a un tubo centrífuga de 15 mL y añada 3 mL de tampón compuesto de digestión precalentado (37 °C) (que contiene 0,125% de tripsina y 10 U/mL de DNasa I), manteniendo una relación enzima-volumen de tejido de 3:1. Incuba el tubo en un baño maria a 37 °C con una agitación suave durante 20 minutos. Inspecciona la muestra cada 5 minutos para monitorizar el progreso de la digestión y evitar la formación de aglomeraciones tisulares.
2. Detener la digestión añadiendo un volumen igual de solución de terminación, DMEM/F12/medio basal HEPES suplementado con suero bovino fetal al 10%. Pipetea suavemente la mezcla arriba y abajo 10 veces para asegurar una mezcla completa y un contacto efectivo entre las enzimas y los componentes inhibitorios.
   NOTA: La α1-antitripsina presente en el suero neutraliza eficazmente la actividad de la tripsina.

4. Preparación de la suspensión de celda única

1. Coloca un colador de celda de 40 μm sobre un tubo centrífuga de 50 mL. Usando una punta de pipeta de 1 mL recortada, transfiere el tejido y el líquido digeridos del tubo de 15 mL al colador. Haz girar suavemente el material del filtro con la punta de la pipeta para facilitar el paso, luego enjuaga el colador con 1–2 mL adicionales de solución de terminación. Una vez que todo el líquido ha pasado por el colador, transfiere el filtrado del tubo de 50 mL a un nuevo tubo centrífugo de 15 mL.
2. Centrifuga la suspensión a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Observa la célula distintiva en la parte inferior del tubo y aspira cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL para evitar molestar o perder la pelota.

5. Establecimiento de un sistema de cultura tridimensional

1. Sin volver a suspender el pellet celular en un medio de cultivo, combínalo directamente con Matrigel usando una punta de pipeta preenfriada y de baja unión para lograr una densidad precisa de 10.000 células/μL. Dispensar 40 μL de esta mezcla celda–Matrigel en cada pozo de una placa de 24 pozos y 20 μL en cada plato confocal con fondo de vidrio. Incubar las placas a 37 °C durante 30 minutos para permitir que el Matrigel se polimerice y forme un andamiaje tridimensional.
2. Tras la solidificación de Matrigel, añade suavemente 500 μL de medio de cultivo de células madre neurales olfativas sin suero a lo largo de la pared del pozo para evitar alterar el gel. Mantener los cultivos en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂, sustituyendo el medio cada 3 días por medio fresco precalentado.
   NOTA: El medio de cultivo de células madre neurales olfativas consiste en DMEM/F12/HEPES suplementados con los siguientes componentes: R-spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), un agente antimicrobiano principal (100 μg/mL), suplemento de N2 (1%), suplemento de B27 (2%) y L-glutamina (1%).

6. Paso y diferenciación

1. Preenfriar la solución de recuperación de organoides sobre hielo durante 10 minutos antes de su uso; aspira el medio de cultivo de los pozos y luego añade 1 mL de solución de recuperación helada a cada pozo. Inclina la placa a un ángulo de 45° y aspira suavemente y dispensa la solución 5–7 veces para desalojar los organoides de la matriz de membrana basal y transferir la suspensión resultante a un tubo centrífuga de 15 mL. Incubar el tubo sobre hielo durante 3–5 minutos, luego centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C, y retirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL de líquido para evitar la pérdida del pellet.
2. Añade 1 mL de reactivo de disociación organoide directamente al pellet celular e incuba el tubo a 37 °C con suaves agitaciones a 220 rpm durante 5 minutos. Termina inmediatamente la digestión añadiendo un volumen igual de Solución de Stop y pipeta suavemente la mezcla 5 veces para asegurar la homogeneidad. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C para recoger las células disociadas.
3. Resuspender la pelota celular en Matrigel a un volumen de 40 μL por pozo para placas de 24 pozos o 20 μL por pozo para placas de cultivo confocal con fondo de vidrio; Mezcla bien usando una punta de pipeta prefría y de bajo fijamiento para asegurar una suspensión uniforme. Después de sembrar en las placas o recipientes adecuados, incubar los constructos a 37 °C durante 30 minutos para permitir la polimerización con Matrigel y la formación tridimensional del andamio. Luego, añade suavemente 500 μL de medio de cultivo esferoide especializado sin suero para células madre neurales olfativas a lo largo de las paredes del pozo para evitar alterar el gel. Mantener los cultivos en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂ y un 95% de humedad relativa.
4. Aproximadamente 7 días después del paso, una vez que la nueva generación de organoides epiteliales olfativos se ha reformado en esferoides, aspira el medio de expansión de los platos confocales de fondo de vidrio y lo sustituye por un medio de diferenciación. Sustituye el medio de diferenciación por medio fresco y precalentado cada 3 días. Las neuronas olfativas morfológicamente distintas suelen hacerse evidentes bajo microscopía tras aproximadamente 7 días de diferenciación.
   NOTA: El medio de diferenciación consiste en DMEM/F12/HEPES suplementados con R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), ácido retinoico (AR, 1 μM), un agente antimicrobiano principal (100 μg/mL), suplemento de N2 (1%), suplemento de B27 (2%) y L-glutamina (1%).

7. Inmunofluorescencia

1. Aspira el medio de cultivo y lava suavemente las muestras una vez con 500 μL de PBS. Retira el PBS, luego añade 500 μL de paraformaldehído al 4% y fija las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspira y descarta el fijador; luego lava las muestras fijas con PBS (3 x 500 μL) y las almacena a 4 °C durante hasta 48 horas.
2. Aspira el PBS y añade 500 μL de solución de permeabilización (0,2% Triton X-100 en PBS), incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego aspira y descarta la solución. Lava las muestras con PBST al 0,02% (0,02% Triton X-100 en PBS; 3 x 500 μL).
3. Añade 500 μL de solución bloqueante (3% de BSA en PBS) e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Aspirar la solución bloqueante y sustituirla por 500 μL de solución primaria de anticuerpos, preparada diluyendo el anticuerpo primario adecuado (por ejemplo, anti-GAP43 a 1:160, anti-OMP a 1:50 o anti-SOX2 a 1:50) en solución bloqueante, e incubar durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, aspira la solución primaria de anticuerpos y lava las muestras con PBST al 0,02% (3 x 500 μL).
5. Añadir 500 μL de solución secundaria de anticuerpos, que contenga un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555 diluido 1:500 en solución bloqueadora, e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora. Aspirar la solución secundaria de anticuerpos y realizar lavados adicionales con PBST al 0,02% (3 x 500 μL).
6. Añade 500 μL de solución de trabajo DAPI (DAPI diluido en PBS) e incuba en la oscuridad durante 10 minutos para teñir los núcleos. Aspira la solución DAPI y lava las muestras con PBST al 0,02% (3 x 500 μL). Guarda las muestras teñidas a 4 °C durante hasta 48 horas antes de la imagen.

8. Imagen por microscopía confocal

1. Realizar microscopía confocal utilizando un tamaño en el eje Z de 1 μm para organoides con un diámetro de ≤100 μm, y 0,5 μm para organoides mayores a 100 μm. Adquirir imágenes en modo secuencial multicanal, escaneando en el siguiente orden: DAPI, FITC, TRITC y Cy5. Importa los archivos de secuencia de imágenes de la pila Z adquiridos al software de renderizado 3D (por ejemplo, Imaris). Utiliza la función de renderizado de volumen 3D para generar un modelo tridimensional completo del organoide. Observa este modelo reconstruido para visualizar la distribución espacial de marcadores celulares específicos (por ejemplo, SOX2, GAP43 y OMP) y para confirmar cualitativamente la arquitectura jerárquica y el estado de diferenciación neuronal de los organoides epiteliales olfativos como punto final final.

Resultados

Aislamiento del tejido epitelial olfativo y cultivo de organoides epiteliales olfativos primarios
Para establecer un sistema de cultivo de organoides epiteliales olfativos, aislamos epitelio olfatorio de tejido superior de cornetes humanos e incrustados en una matriz tridimensional de Matrigel (Figura 1). Basándonos en las condiciones de cultivo definidas reportadas por Ren et al., validamos y ajustamos las concentraciones de factores cla...

Discusión

Los organoides representan un modelo in vitro único porque su arquitectura tridimensional autoorganizada recapitula de cerca la de los tejidos humanos nativos y, en algunos casos, puede ser histológicamente indistinguible de los órganos reales. ¹⁴ Por tanto, establecer modelos organoides humanos es fundamental para estudiar enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo para generar un sistema de cultivo de organoides a partir de células epiteliales ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM