Este método estudia cómo los fibroblastos cutáneos senescentes afectan a los sanos. La senescencia se induce mediante la exposición a UVB, y el medio condicionado se aplica a fibroblastos normales. Ayuda a evaluar compuestos bioactivos que actúan en la comunicación alterada célula a célula en el envejecimiento cutáneo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Novedosa combinación de antioxidantes para restaurar una comunicación intercelular saludable en un modelo in vitro utilizando un medio condicionado de células senescentes
En este artículo
Resumen
Resumen
El envejecimiento cutáneo es un proceso multifactorial impulsado por alteraciones a nivel molecular y celular, también conocidas como características del envejecimiento. Una de estas alteraciones consiste en una alteración de la comunicación intercelular, que contribuye a la disfunción del tejido cutáneo y al daño estructural. Aquí se presenta un modelo in vitro para imitar estas características del envejecimiento cutáneo incubando fibroblastos sanos con un medio condicionado a partir de fibroblastos senescentes. Primero, los fibroblastos irradiados con UVB pueden analizarse para detectar cambios en la expresión génica asociados al fotoenvejecimiento. Segundo, un medio condicionado de fibroblastos senescentes inducidos por UVB puede ser recolectado y transferido a fibroblastos sanos, lo que conduce a la regulación a la baja de las proteínas de la matriz extracelular y a la alza de la expresión génica de citocinas proinflamatorias. Estos cambios se contrarrestan mediante el uso de una nueva combinación de antioxidantes (vitamina C + idebenona). Estos resultados demuestran que el modelo in vitro puede utilizarse para evaluar la eficacia de compuestos novedosos en las características del envejecimiento de las células dérmicas de la piel y, por tanto, seleccionar compuestos que puedan modular los procesos celulares de regeneración y rejuvenecimiento de la piel.
Introducción
El envejecimiento cutáneo es el proceso natural de disminución de las funciones y propiedades cutáneas, incluyendo la pérdida de firmeza y elasticidad y el aumento de la flacidez. Esto se acelera por factores externos, como la exposición a los ultravioleta (UV) y la contaminación, que dañan las células y causan cambios a nivelmolecular 1. Estos cambios han sido bien caracterizados por investigaciones recientes e identificados como características del envejecimiento, incluyendo inestabilidad genómica, desgaste de telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis, macroautofagia defectuosa, detección desregulada de nutrientes, disfunción mitocondrial, senescencia celular, agotamiento de células madre, alteración de la comunicación intercelular, inflamación crónica y disbiosis2. Estas características explican cómo el daño subcelular se traduce en disfunción tisular, favoreciendo así el proceso de envejecimiento. Curiosamente, estas alteraciones no actúan de forma independiente sino que forman una firma interdependiente de la red. El daño primario, como el daño genómico o las alteraciones epigenéticas, se acumula y finalmente causa senescencia celular. En el caso de la piel, esto se debe principalmente al daño por rayos UV, siendo el fotoenvejecimiento el principal factor que contribuye a los rasgos de envejecimientocutáneo 3. Las células senescentes muestran una mayor producción de citocinas proinflamatorias, metaloproteinasas de la matriz y factores de crecimiento, también conocido como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) e incluye IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA o IL1A, entreotros 4,5,6. Estos factores secretados no solo afectan a las propiedades estructurales de la piel, como la matriz extracelular dérmica, sino que también alteran la función de las células circundantes. Esto incluye la liberación de citocinas que estimulan la activación de melanocitos para provocar hiperpigmentación cutánea asociada a la edad (como el Factor de Células Madre o IL18) u otras proteínas dañinas que alteran la función de los fibroblastos sanos circundantes, comprometiendo su función y contribuyendo a la amplificación aumentada del fenotiposenescente 7,8,9,10,11. Como resultado, la inflamación crónica y la alteración de la comunicación intercelular son factores clave del estado dañino que traduce estas alteraciones moleculares en signos visuales del envejecimiento cutáneo, como arrugas, flacidez, manchas de la edad o pérdida de firmeza.
Los contribuyentes específicos de proteínas a los efectos perjudiciales del SASP pueden estudiarse mediante técnicas conocidas como el ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA), Luminex, la reacción en cadena cuantitativa en tiempo real de la polimerasa (qRT-PCR) o Western Blot, entreotros 5,12. Sin embargo, este enfoque es útil para identificar proteínas específicas desde una perspectiva individual y caracterizar un mecanismo de acción específico, pero no considera los efectos del SASP completo sobre las células vecinas. Aquí se propone un protocolo in vitro para estudiar el efecto del SASP producido por fibroblastos dérmicos senescentes inducidos por UVB sobre fibroblastos vecinos sanos, imitando la alteración de la comunicación intercelular del envejecimiento. Como se ha mencionado antes, la UV es el principal motor de la senescencia celular en la piel. Por ello, el daño UV se selecciona como fuente de daño frente a la senescencia replicativa o inducida por oncogenes para construir el modelo3 actual. Para ello, se utiliza el medio que contiene los factores secretados por fibroblastos senescentes (medio condicionado), y se cuantifican marcadores de función celular en fibroblastos sanos incubados con este medio. Bajo este protocolo, una vez que el medio condicionado ha sido transferido de células senescentes a células sanas, se extraen fibroblastos senescentes inducidos por UVB para cuantificar características moleculares, como genes implicados en la señalización proinflamatoria y paracrina. En segundo lugar, se extraen fibroblastos sanos tratados con medio condicionado de fibroblastos senescentes para caracterizar el efecto del SASP sobre células vecinas, cuantificando genes implicados en la matriz extracelular, factores de crecimiento y activación de fibroblastos. Así, el efecto de compuestos de interés (COI) se analiza tanto inicialmente en fibroblastos senescentes como posteriormente en fibroblastos sanos tratados con el medio condicionado. Respecto a estos compuestos, investigaciones previas han demostrado que los antioxidantes son eficaces para proteger contra y corregir los signos del envejecimiento cutáneo inducido por el fotoenvejecimiento. En consecuencia, la combinación de dos antioxidantes (vitamina C e idebenona) se utiliza para revertir algunas de las alteraciones inducidas por la UVB, tanto en células seniscentes como en células sanas incubadas con un medio acondicionado de célulassenescentes 13,14,15
En conjunto, este protocolo está diseñado para estudiar los efectos del SASP en las células de la piel e identificar moléculas o intervenciones novedosas que restauren la comunicación intercelular alterada, siendo así apropiados para productos regenerativos y bioestimulantes en medicina estética y dermatología regenerativa.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los fibroblastos dérmicos humanos utilizados en este estudio se obtuvieron de un proveedor comercial de líneas celulares. Como no se involucraron muestras humanas primarias, datos de pacientes ni experimentos in vivo , no se requirió la aprobación ni el consentimiento informado del Comité de Revisión Institucional (IRB) para este estudio.
1. Inducción de senescencia en fibroblastos dérmicos usando UVB
- Placar fibroblastos dérmicos humanos a una densidad de 6 × 104 células por pozo en una placa de 6 pozos utilizando el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%.
- Tras 24 horas, retirar el medio de cultivo celular y reemplazarlo por 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pozo.
- Irradia las células con luz UVB a 25 mJ/cm2.
NOTA: Esta energía ha sido optimizada para el dispositivo de irradiación UVB utilizado en este protocolo (véase Tabla de Materiales) para inducir daños suficientes que desencadenan la senescencia, evitando daños excesivos que puedan provocar apoptosis. Al utilizar otros dispositivos, ajustar la energía de irradiación en consecuencia.
PRECAUCIÓN: La radiación UVB es peligrosa. Utilice el equipo de protección y la protección adecuadas para evitar la exposición. - Retira PBS y añade 2 mL de medio de cultivo celular fresco por pozo.
- Tras 72 horas, retira el medio de cultivo celular, añade 1 mL de PBS por pozo y repite la irradiación UVB como se describe en el paso 1.3.
- Tras 72 horas, retirar el medio de cultivo celular y añadir 0,5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% por pozo. Incubar durante 1–2 minutos a 37 °C, y luego extraer las células utilizando 1,5 mL de medio de cultivo celular fresco.
- Placar las células a una densidad de 8 × 104 células por pozo en una placa de 6 pozos utilizando un medio de cultivo celular (DMEM suplementado con FBS al 10%). La senescencia celular se induce tras este paso.
2. Tratamiento de células senescentes con compuestos de interés
- Tras 24 horas, retira el medio de cultivo celular y añade 2 mL de medio de cultivo celular que contenga compuestos de interés.
- Tras 24 horas adicionales, placar un lote separado de fibroblastos dérmicos humanos (como se describe en el paso 1.1) en placas de 6 pozos. Estas células servirán como fibroblastos dérmicos sanos para la transferencia del medio acondicionado.
3. Transferencia condicionada de medio de células seniscentes a células sanas
- A las 48 horas del tratamiento compuesto de células senescentes y 24 horas tras la colocación de fibroblastos sanos, se recogen 2 mL de medio condicionado por pozo de las células senescentes y transfieran a los fibroblastos sanos.
NOTA: Retira el medio de cultivo de fibroblastos sanos inmediatamente antes de añadir el medio acondicionado para asegurar una transferencia eficiente. - Añade 1 mL de PBS a las células senescentes y extrayérselas utilizando tripsina como se describe en el paso 1.6. Utiliza estas células para el análisis de marcadores de senescencia o inflamación utilizando un kit ELISA o qPCR.
NOTA: Los pellets de celda pueden almacenarse a −80 °C si los ensayos aguas abajo no se realizan inmediatamente. - Incubar fibroblastos sanos que reciban un medio condicionado a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 horas.
4. Extracción de células sanas para el análisis de activación de fibroblastos mediante análisis de expresión génica
- Tras una incubación de 24 horas con medio condicionado, extraer fibroblastos sanos utilizando tripsina como se describe en el paso 1.6. Analizar la expresión génica de la matriz extracelular mediante qPCR.
- Realiza un análisis qPCR.
- Extrae ARN de los pellets celulares según las instrucciones del fabricante (kit de extracción de ARN).
- Realizar la transcripción inversa de 200 ng de ARN según las instrucciones del fabricante (kit de transcripción inversa).
- Amplificar cDNA según las instrucciones del fabricante (mezcla maestra qPCR). Realizar qPCR bajo las siguientes condiciones: 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1.
| Gen | Secuencia hacia adelante | Secuencia inversa |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTCTCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCGCCTGTGTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tabla 1: Lista de cebadores utilizados para ensayos qPCR. Se proporcionan secuencias directas y inversas correspondientes a los genes estudiados y cuantificados en este modelo.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El protocolo actual describe un método para simular la alteración de la comunicación intercelular característica del envejecimiento in vitro. La Figura 1 presenta un esquema gráfico que ilustra los principales pasos del protocolo, incluyendo la inducción de senescencia, la cuantificación de marcadores y el análisis de la comunicación intercelular alterada en células de la piel in vitro.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Comprender el proceso de envejecimiento a nivel molecular es clave para diseñar nuevos enfoques e intervenciones que retrasen las características relacionadas con el envejecimiento y prolonguen la longevidad y funcionalidad de células y tejidos. La definición e identificación de las características del envejecimiento ha sido esencial para establecer un marco científico para el desarrollo de estasintervenciones 2,16. Entre las car...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Todos los autores trabajaron para Mesoaesthetic Pharma Group, S.L.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los colaboradores su ayuda y asesoramiento en este proyecto.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Placas de cultivo celular multipocillo para usar durante el ensayo (inducción de senescencia y tratamiento con compuestos) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (dispositivo de irradiación UVB) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Dispositivo utilizado para producir daño mediante irradiación UVB y, en consecuencia, inducir senescencia |
| Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Medio de cultivo celular estándar para fibroblastos dérmicos |
| Suero bovino fetal (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Suplemento nutritivo utilizado como fuente de factores de crecimiento, hormonas, proteínas y micronutrientes esenciales para el crecimiento celular |
| Kit ELISA H3K27me3 | Epigentek | P-3014T-096 | Un inmunoensayo específico para detectar la modificación epigenética de H3K27me3 en muestras biológicas |
| Fibroblastos dérmicos humanos | Promocell | C-12302 | Célula principal de la piel en la dermis y regulador del fotoenvejecimiento de la piel |
| Solución tamponada de fosfato (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Solución tampón que imita el entorno fisiológico. Se utiliza para lavar las células sin inducir estrés o reducir la viabilidad celular |
| Kit PrimeScript RT reagent (kit de transcripción inversa) | Takara Bio | RR037A | El kit para obtener cDNA del ARN aislado de las células. 2º paso para el ensayo qPCR después de la purificación del ARN. |
| TB Green Premix Ex Taq (mezcla maestra qPCR) | Takara Bio | RR420A | El kit para producir la reacción en cadena de la polimerasa a partir del cDNA para cuantificar los niveles de expresión génica. 3º paso para el ensayo qPCR después de la transcripción inversa. |
| Kit de purificación de ARN total (kit de extracción de ARN) | Norgen | 17200 | El kit para obtener ARN de las células cosechadas. 1º paso para el ensayo qPCR después de la cosecha celular. |
| Tripsina/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Solución enzimática utilizada en los pasos de cosecha/pasaje para la desadherencia de las células de las placas de cultivo celular |
Referencias
- Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: Pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
- López-Otín, C., et al. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
- Razzaghi, Z., Ahmadzadeh, A. Examination of the biological effects of sunlight on the skin: a review. J Lasers Med Sci. 16, e52 (2025).
- He, R., et al. Hallmarks of the aging skin microenvironment: components and mechanisms. J Cell Physiol. 240 (11), e70111 (2025).
- Karras, A., et al. Measuring the senescence-associated secretory phenotype. Biomedicines. 13 (9), 2451 (2025).
- Chin, T., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
- Yuan, X. H., Jin, Z. H. Paracrine regulation of melanogenesis. Br J Dermatol. 178 (3), 632-639 (2018).
- Fullard, N., et al. Cell senescence-independent changes of human skin fibroblasts with age. Cells. 13 (8), 662 (2024).
- Hachiya, A., et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J Invest Dermatol. 116 (4), 578-586 (2001).
- Kovacs, D., et al. Role of fibroblast-derived growth factors in regulating hyperpigmentation of solar lentigo. Br J Dermatol. 163 (5), 1020-1027 (2010).
- Kim, M., et al. Ultraviolet-irradiated endothelial cells secrete stem cell factor and induce epidermal pigmentation. Sci Rep. 8 (1), 4235 (2018).
- Lee, Y. H., et al. Identification of senescence rejuvenation mechanism of Magnolia officinalis extract including honokiol as a core ingredient. Aging. 17 (2), 497-523 (2025).
- Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., Dahmane, R. Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention. ISRN Dermatol. 2013, 1-11 (2013).
- McDaniel, D. H., et al. Clinical efficacy assessment in photodamaged skin of 0.5% and 1.0% idebenone. J Cosmet Dermatol. 4 (3), 167-173 (2005).
- Farris, P. K. Topical vitamin C: a useful agent for treating photoaging and other dermatologic conditions. Dermatol Surg. 31 (7 Pt 2), 814-817 (2005).
- López-Otín, C., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Sjerobabski-Masnec, I., Situm, M. Skin aging. Acta Clin Croat. 49 (4), 515-518 (2010).
- Ganguly, B., Hota, M., Pradhan, J. Skin aging: implications of UV radiation, reactive oxygen species and natural antioxidants. Skin Aging. , (2022).
- Ito, T., et al. Regulation of cellular senescence by polycomb chromatin modifiers through distinct DNA damage- and histone methylation-dependent pathways. Cell Rep. 22 (13), 3480-3492 (2018).
- Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., Berger, S. L. Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell. 166 (4), 822-839 (2016).
- Cencioni, C., et al. Aging Triggers H3K27 Trimethylation Hoarding in the Chromatin of Nothobranchius furzeri Skeletal Muscle. Cells. 8 (10), 1269 (2019).
- Ma, Z., et al. Epigenetic drift of H3K27me3 in aging links glycolysis to healthy longevity in Drosophila. eLife. 7, e35368 (2018).
- Martinez-Gutierrez, A., et al. Hyaluronic and Succinic Acid: new biostimulating combination to counteract dermal and subcutaneous aging. Int J Mol Sci. 26 (15), 7548 (2025).
- Park, S., et al. Senotherapeutic potential of araliadiol in senescent human dermal fibroblasts: an in vitro study using three senescence models. Pharmaceutics. 17 (12), 1560 (2025).
- Waldera Lupa, D. M., et al. Characterization of skin aging–associated secreted proteins (SAASP) produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin. J Invest Dermatol. 135 (8), 1954-1968 (2015).
- Boismal, F., et al. Proteomic and secretomic comparison of young and aged dermal fibroblasts highlights cytoskeleton as a key component during aging. Aging. 16 (16), 11776-11795 (2024).
- Abdul Ghani, N. I., et al. Effect of different collection times of dermal fibroblast conditioned medium (DFCM) on in vitro re-epithelialisation process. Biomedicines. 10 (12), 3203 (2022).
- Chowdhury, S. R., Aminuddin, B. S., Ruszymah, B. H. I. Effect of supplementation of dermal fibroblasts conditioned medium on expansion of keratinocytes through enhancing attachment. Indian J Exp Biol. 50 (5), 332-339 (2012).
- Ohgo, S., et al. Senescent dermal fibroblasts enhance stem cell migration through CCL2/CCR2 axis. Exp Dermatol. 24 (7), 552-554 (2015).
- Malaquin, N., et al. Senescent fibroblasts enhance early skin carcinogenic events via a paracrine MMP-PAR-1 axis. PLoS One. 8 (5), e63607 (2013).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
