Artículo de método

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

DOI:

10.3791/70934

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27 de marzo de 2026

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1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Recientemente se han identificado variantes genéticas en el miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) en pacientes con sobrecrecimiento óseo, un trastorno novedoso del desarrollo. Se presenta un protocolo y nuevos resultados que describen la identificación bioquímica de histonas modificadas en el contexto de nucleosomas como sustratos de unión a SPIN4.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) acaba de emerger como un regulador novedoso del crecimiento óseo. Se identificaron variantes de pérdida de función en SPIN4 en pacientes que presentaban un síndrome de sobrecrecimiento pre y postnatal, que se hereda de forma dominante ligada al cromosoma X. SPIN4 contiene tres repeticiones tándem de dominios Tudor, cada una formando una jaula aromática individual. Estos dominios Tudor se consideran dominios lectores epigenéticos para los residuos de arginina y lisina metilados de histonas, basándose en la homología de secuencias. Sin embargo, los sustratos exactos de unión de SPIN4 siguen sin estar claros. El SPIN4 humano, tanto en su forma de tipo salvaje como mutante causante de enfermedades, se generó con éxito mediante un sistema de expresión celular de insectos. Mediante un arreglo de péptidos de modificación de histonas, se determinaron las afinidades diferenciales de unión entre el SPIN4 tipo salvaje y el mutante. Las validaciones funcionales demostraron además que SPIN4 es un lector legítimo de la metilación de la histina H3 lisina 4 (H3K4me), como lo demuestra la reducción bioquímica de mononucleosomas nativos. Este enfoque integrado facilita la identificación rápida de proteínas lectoras epigenéticas en el objetivo de unión.

Introducción

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El Miembro de la Familia Spindlin 4 (SPIN4) es un lector epigenético y recientemente se ha implicado en el síndrome de sobrecrecimiento, presentándose con una constelación de crecimiento excesivo pre y postnatal y una estaturaalta 1,2. Los ratones knockout (KO) Spin4 recapitularon el fenotipo humano exacto, apoyando la causalidad. Hasta la fecha, SPIN4 es el único lector epigenético exclusivo identificado que regula negativamente el crecimiento óseo. Sin embargo, las propiedades bioquímicas de SPIN4, un lector epigenético crítico para el crecimiento, no han sido caracterizadas, dejando un vacío de conocimiento crítico para comprender los mecanismos fundamentales que causan enfermedades en este nuevo trastorno del desarrollo. SPIN4 contiene tres repeticiones tándem de dominios Tudor, que generalmente se consideran dominios lectores de proteínas de arginina metilada o lisinade histonas 3. Recientemente se ha identificado una variante missense SPIN4D82H en un paciente con síndrome de sobrecrecimiento óseo prenatal y postnatal. Esta mutación afecta al primer dominio Tudor de SPIN4; sin embargo, los sustratos de unión relevantes de estos dominios Tudor siguen siendo poco claros, limitando la disección funcional de la regulación dependiente de SPIN4 de la cromatina y la expresión génica durante el desarrollo óseo.

La identificación de nuevos sustratos de unión a histonas de dominios de proteínas lectoras no se basa en un único enfoque estandarizado. Las modificaciones postraduccionales (PTM) de las histonas ocurren principalmente en las colas de las histonas que sobresalen desde las partículas nucleosomicas centrales. El reconocimiento de las PTMs en las colas de histonas por los dominios de proteínas lectoras es muy variable y a menudo requiere interacciones electrostáticas multivalentes que involucran ADN nucleosómico, ADN enlazador y/u otros dominios histoniques para estabilizar colectivamente la interacción lector-objetivo4. Actualmente, los PTMs de péptidos de cola de histonas se han construido en forma de microarrays y comercializados por varios proveedores5. Aunque el cribado PTM basado en péptidos de la cola de histonas para los objetivos de unión de los dominios de proteínas lectoras es de alto rendimiento, a menudo produce resultados falsos positivos en ausencia de nucleosomas. Además, las condiciones experimentales para estos cribados son altamente empíricas y varían de una proteína a otra, lo que las hace técnicamente difíciles de abordar. El cribado o pulldown de PTM basado en nucleosomas sintéticos proporciona una lectura mucho más robusta, pero es mucho más costoso y de bajo rendimiento, ya que reconstituir nucleosomas que transportan combinaciones variables de PTMs es inherentemente complicado.

Este protocolo describe un enfoque rápido para identificar las PTM de histonas en nucleosomas como objetivos de unión de SPIN4. El SPIN4 recombinante fue reconstituido y evaluado contra una matriz comercial de péptidos PTM de histonas para identificar posibles objetivos de unión. Posteriormente se generaron mononucleosomas nativos que contenían diversos PTM de histonas endógenas a partir de células vivas. El pulldown de SPIN4 de mononucleosomas permitió la validación dirigida basada en anticuerpos de las PTM de histonas tras el cribado inicial. Esta estrategia bioquímica integrada demuestra un enfoque de prueba de principio para el descubrimiento de objetivos eficiente en tiempo y coste, y puede aplicarse fácilmente para identificar sustratos de unión de otras proteínas lectoras epigenéticas poco caracterizadas.

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales que involucraron células HEK293FT se realizaron en cumplimiento con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad Commonwealth de Virginia.

1. Purificación de SPIN4 humano recombinante

  1. Clonar SPIN4 oSPIN4 D82H de tipo salvaje de longitud completa con una etiqueta de epítopo N-terminal 1× FLAG en un vector baculoviral 6,7.
  2. Prepara el baculovirus transfectando células Sf9 con vectores baculovirales, cosecha virus cuando las células se rompen, alicuota y almacena el virus a −80 °C 6,7.
  3. En un matraz Erlenmeyer de 500 mL, añade 100 mL de medio de crecimiento, 1,5 × 108 células Sf9 y 1 mL de baculovirus P1.
  4. Incubar el cultivo a 27,5 °C en una incubadora agitadora orbital ajustada a 125 rpm durante 72 horas en la oscuridad.
  5. Purificar FLAG-SPIN4 usando gel de afinidad FLAG en un tampón de lisis BC150 que contiene inhibidores de proteasas y eluir la proteína usando péptido 1× FLAG a 0,1 mg/mL.
  6. Para eliminar completamente el péptido 1× FLAG, dialise FLAG-SPIN4 eluído contra el tampón de almacenamiento de proteínas BC150 a 4 °C en el siguiente orden:
    1. Primera diálisis: 1 L, 1 hora.
    2. Segunda diálisis: 2 L, durante la noche.
    3. Tercera diálisis: 1 L, 1 h.
  7. Concentra la proteína diálisis al volumen deseado (para SPIN4, de 600 μL a 150 μL).
  8. Determina la concentración de proteínas utilizando un ensayo de ácido bicinquinínico (BCA) y calcula la concentración molar en consecuencia.
  9. La cantidad de proteína cruda recuperada en cada paso de purificación y los rendimientos estimados correspondientes se resumen en la Tabla Suplementaria 1. La purificación se realizó a partir de 250 mL de cultivo Sf9 utilizando 400 μL de suspensión de gel de afinidad anti-FLAG.
  10. Diluir SPIN4 concentrado en un 10× en el tampón de almacenamiento de proteínas BC150 (Tabla suplementaria 2). Carga 1, 2, 5, 10 y 20 μL sobre un gel SDS–PAGE al 15% y visualiza mediante tinción azul Coomassie (Figura 1A).
  11. Cuantifica la intensidad de bandas utilizando un software de análisis de imágenes para determinar la intensidad relativa de la señal entre carriles cargados con volúmenes iguales.
  12. Divide la razón de intensidad por el peso molecular de cada proteína para obtener la razón molar.
  13. Utiliza esta proporción molar para corregir la concentración molar estimada en el Paso 1.8.
  14. La alcuocia purificaba proteínas, la congelaba rápidamente en nitrógeno líquido y la almacenaba a −80 °C. Para uso a corto plazo, guarda a 4 °C durante la noche antes de pasar al siguiente experimento.

2. Matriz de péptidos histonas

  1. Prepara un tampón bloqueador de matriz peptídica disolviendo 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en el tampón de almacenamiento de proteínas BC150 hasta un volumen final de 100 mL.
  2. Opcionalmente, delimita el área de reacción en la matriz peptídica usando un marcador hidrofóbico para minimizar el consumo de reactivos.
  3. Coloca varias hojas de papel filtro en una placa de Petri de 15 cm y humédelas con agua.
  4. Coloca las matrices de péptidos sobre los papeles filtro humedecidos.
  5. Añade cuidadosamente un buffer bloqueador de 300 μL para cubrir completamente cada área del array.
  6. Cubre la placa de Petri e incuba a temperatura ambiente durante 1–3 horas.
  7. Preparar FLAG-SPIN4 en el tampón de bloqueo hasta una concentración final de 1 μM.
  8. Preparar 1× péptido FLAG en un tampón bloqueador hasta una concentración final de 1 μM.
  9. Para mejorar la relación señal-ruido y reducir el fondo no deseado, realiza los siguientes pasos en una habitación fría. Mueve las matrices bloqueadas (con la placa de Petri) a la cámara fría antes de añadir proteínas.
  10. Elimina el exceso de búfer de bloqueo de los arrays.
  11. Añade cuidadosamente la proteína FLAG-SPIN4 o el péptido FLAG deseado como control en cada bloque.
  12. Cubre la placa de Petri y incuba durante la noche en la cámara fría.
  13. Añade aproximadamente 50 mL de tampón de lavado con matriz peptídica a una caja de lavado Western blot y llévalo a la cámara fría.
  14. Descarta la solución de proteínas y transfiere inmediatamente los arreglos al buffer de lavado, con el lado de reacción hacia arriba.
  15. Lava los arreglos cinco veces de la siguiente manera: los dos primeros lavados durante 1 minuto cada uno y los otros tres lavados durante 5 minutos cada uno.
  16. Enjuaga los arreglos con un tampón bloqueador de matriz peptídica para eliminar el detergente residual y luego devuélvelos a la placa de Petri.
  17. Preparar una solución de anticuerpos anti-FLAG en una dilución 1:2000 y añadir 300 μL por bloque.
  18. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
  19. Repite los pasos 2.14 a 2.16 para lavar los arrays.
  20. Preparar una solución anti-anti-anticuerpo de ratón conjugada con HRP en una dilución 1:6000 y añadir 300 μL por bloque.
  21. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
  22. Repite los pasos 2.14 a 2.16 para lavar los arrays.
  23. Coloca las matrices dentro de una lámina protectora transparente.
  24. Añadir aproximadamente 1 mL de sustrato de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL), asegurando una cobertura uniforme de la superficie de reacción.
  25. Eliminar burbujas de aire y capturar imágenes quimioluminiscentes y de campo brillante utilizando un sistema de imagen adecuado (por ejemplo, imágenes digitales o películas autoradiográficas) (Figura 1B).
  26. Analizar la intensidad de la señal según el software de matriz de péptidos y las herramientas online asociadas (Figura 2A–C).

3. Expresión a gran escala de FLAG-SPIN4 para ensayo de pulldown

  1. En un matraz Erlenmeyer de 500 mL, añade 125 mL de medio ESF921, 1,8 × 108 células Sf9 y 1,2 mL de baculovirus P1 que exprese FLAG-SPIN4o FLAG-SPIN4 D82H.
  2. Incubar a 27,5 °C en una incubadora agitadora orbital (125 rpm) durante 72 horas.
  3. Alicuota la cultura de la siguiente manera:
    1. 4 mL de cultivo en un tubo de 15 mL para la titulación.
    2. 30 mL de cultivo en cuatro tubos de 50 mL.
  4. Centrifuga los tubos a 600 × g durante 15 minutos y descarta el sobrenadante.
  5. Congela los pellets en nitrógeno líquido y guárdalos a −80 °C hasta su uso.

4. Titulación de la relación perla-lisado para FLAG-SPIN4 y FLAG-SPIN4D82H

  1. Añadir 1 mL de tampón de lisis BC150 a cada uno de los pellets de Sf9 a partir de 5 mL de cultivo de Sf9 descrito en la Sección 3, Paso 3.1.
  2. Sonica los lisados para asegurar una interrupción completa: 30% de amplitud, 5 s encendidos/5 s apagados, para un tiempo total de sonicación de 15 s.
  3. Centrifugar a 20.000 × g, 4 °C, durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a tubos frescos de 1,5 mL.
  4. Preparar una suspensión de gel de afinidad anti-FLAG de 20 μL para cada reacción de pulldown (60 μL para 3 titulaciones)
  5. Lava las perlas con el tampón de lisis BC150:
    1. Añadir brevemente 1 mL de buffer de lisis BC150 y vórtice.
    2. Centrifugar a 3.000 × g durante 1 minuto.
    3. Aspira y desecha el sobrenadante.
  6. Resuspende las perlas en un tampón de lisis de 40 μL de BC150 por cada reacción de pulldown (120 μL para 3 titulaciones).
  7. Combinar el lisato en tubos de 1,5 mL que contengan el tampón de lisis BC150 y la suspensión de perlas (Tabla suplementaria 3)
  8. Incuba los tubos en un rotador de tubos ajustado a 15 rpm a 4 °C durante 1,5 horas.
  9. Centrifugar a 3.000 × g durante 1 minuto y aspirar el sobrenadante.
  10. Lava las cuentas tres veces de la siguiente manera:
    1. Resuspende las perlas brevemente en un tampón de lisis y vórtice de 500 μL de BC150.
    2. Centrifuga a 3.000 × g durante 1 minuto.
    3. Aspira el sobrenadante.
  11. Resuspende las perlas en un buffer de Laemmli de 20 μL 1× e incuba a 95 °C durante 5 minutos.
  12. Centrifugar a 3.000 × g durante 1 minuto.
  13. Aplicar el sobrenadante en un gel SDS–PAGE al 15% y tiñir con azul de Coomassie para estimar el rendimiento proteico.
  14. Según los datos, selecciona una proporción lisato-perlas que sature los sitios de unión de anticuerpos en las perlas. En los experimentos, ≥300 μL de lisato por cada 20 μL de perlas fueron suficientes para alcanzar la capacidad de unión completa.
    NOTA: "Saturación de los sitios de unión de anticuerpos" se define como el punto en el que aumentar el volumen de lisado ya no resulta en una mayor recuperación de la proteína objetivo.
    NOTA: Con la misma molaridad, SPIN4D82H muestra una afinidad de unión menor al gel de afinidad FLAG que su contraparte de tipo salvaje.
    NOTA: En este entorno experimental, se derivó 1 mL de lisato de 6 millones de celdas Sf9 (calculado como 1,5 × 106 células/mL × 4 mL), lo que indica que SPIN4 expresado por ~6 millones de células Sf9 es suficiente para saturar 20 μL de suspensión de gel de afinidad anti-FLAG.

5. Preparación a gran escala del gel de afinidad anti-FLAG unido a FLAG-SPIN4 como cebo

  1. Para cada proteína a analizar, se recogen dos pellets de cultivos de 30 mL. Resuspende cada pellet en un buffer de lisis de 6 mL de BC150, transfiere a un tubo centrífugo de 15 mL y ajusta el volumen total a 13 mL con buffer de lisis BC150.
  2. Sonica cada muestra sobre hielo con amplitud del 100%, 15 s encendido y 30 segundos de apagado, para un tiempo total de sonicación de 2 minutos.
  3. Transfiere los lisados a tubos centrifugadores de alta velocidad prerefrigerados y centrifuga a 20.000 × g, 4 °C, durante 15 minutos.
  4. Añadir 200 × (número de muestras + 1) × 1,1 μL de suspensión de gel de afinidad anti-FLAG a un tubo centrífugo de 1,5 mL.
  5. Lava las perlas con >5 volúmenes de columna (CV) de buffer de lisis BC150 una vez.
  6. Resuspende las perlas en 400 × (número de muestras + 1) × 1,1 μL de buffer de lisis BC150.
  7. Transfiere los sobrenadantes obtenidos en el Paso 4 a tubos centrífugos de 15 mL.
  8. Añade 500 μL de la suspensión de talones Step 5.7 a cada tubo.
  9. En un tubo, añadir 3 mL de tampón de lisis BC150 y 60 μL de 1× péptido FLAG (100 mM) como control negativo.
  10. Incubar las muestras en un tubo rotador ajustado a 120 rpm a 4 °C durante 1,5 horas.
  11. Centrifuga a 2.000 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
  12. Resuspende las perlas en una cantidad adecuada de sobrenadante y transfiere a tubos de 1,5 mL.
  13. Centrifuga a 3.000 × g durante 1 minuto y aspira el sobrenadante.
  14. Lava las perlas cinco veces con el tampón de lisis BC150 de la siguiente manera:
    1. Resuspende las perlas en un tampón de lisis de 1 mL de BC150.
    2. Para el 4º y 5º lavado, coloca las muestras en un rotador de tubo ajustado a 20 rpm a 4 °C durante 10 minutos.
    3. Centrifugar a 3.000 × g durante 1 minuto y aspirar el sobrenadante.
  15. Resuspende las perlas en un tampón de lisis de 200 μL de BC150.
  16. Toma 9 μL de la suspensión de perlas/tampón y analiza el contenido proteico mediante un 15% de SDS–PAGE seguido de la tinción azul de Coomassie.
  17. Debido a que la proteína aportada supera la capacidad de unión de las perlas, la cantidad de proteína unida por volumen de perlas debería ser similar entre muestras. Cuantifique semi-cuantifique la intensidad de la banda mediante análisis digital de imágenes y ajuste la cantidad de las perlas para reacciones posteriores.

6. Preparación de mononucleosomas a partir de HEK293FT células

  1. Cultivar HEK293FT células en placas de cultivo tisular de 15 cm hasta aproximadamente un 90% de confluencia utilizando suero bovino fetal (FBS) al 10% en medio DMEM a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
  2. Las células HEK293FT paso temprano se obtienen comercialmente y se autentican mediante perfilado STR.
    NOTA: Un plato de 15 cm produce ~27 millones de células, lo que es suficiente para 1–2 reacciones de pulldown. Para seis reacciones (incluyendo controles negativos), prepara al menos tres platos de 15 cm. Si la modificación posttraduccional (PTM) de la histona objetivo es rara o inestable, aumenta el número de células de 2 a 10× en consecuencia.
  3. (Opcional) Dependiendo de la modificación de histonas de interés, añadir inhibidores PTM apropiados (Tabla suplementaria 2) al medio de cultivo e incubar durante 24 horas.
    NOTA: Este paso puede omitirse si hay abundantes PTM de histonas.
  4. Cuando las células alcancen una confluencia cercana al 100%, recóllelas de la siguiente manera:
    1. Aspira el medio de cultivo.
    2. Enjuaga las células suavemente con 10 mL de PBS bien frío y luego aspira.
    3. Añade 5 ml de PBS bien frío.
    4. Raspa las células sobre hielo y transfírlas a un tubo de 50 mL (todos los platos se pueden combinar).
    5. Centrifugar a 13.000 × g, 4 °C, durante 10 minutos.
    6. Descarta el sobrenadante.
  5. (Opcional) Procede inmediatamente o congela la cápsula celular para usarla más adelante:
    1. Estima el volumen de los pellets.
    2. Resuspende en 9× volumen de pellets de Buffer G para alcanzar una concentración final de glicerol del 20%.
    3. Congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarla a −80 °C.
  6. Si procedes con pellet congelado, descongela el pellet sobre hielo, centrifuga a 1.300 × g, 4 °C, durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
  7. Resuspende el pellet (fresco o descongelado) en un volumen de 10× de un tampón TMSD (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mMMgCl 2, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT) que contiene inhibidores de proteasas utilizando una pipeta serológica.
  8. Preparar un 10% de NP-40 en el tampón TMSD de forma fresca y añadir un 0,11× volumen total de reacción para lograr una concentración final de NP-40 de ~1%.
  9. Incuba la suspensión en un rotador tubular ajustado a 120 rpm a 4 °C durante 5 minutos.
  10. Mezclar 10 μL de la suspensión con 10 μL de azul de tripán, y observar al microscopio para monitorizar la tinción nuclear. Asegúrese de que los núcleos estén completamente aislados del citosol (Figura 3A).
  11. Cuando aproximadamente el 95% de los núcleos son tripán-azul-positivos, se procede al siguiente paso. Para HEK293FT células, una incubación del 1% de NP-40 durante 5 minutos suele ser suficiente. Para otros tipos de células, verifica y ajusta el tiempo de incubación.
  12. Centrifugar a 1.300 × g, 4 °C, durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
  13. Resuspende el pellet en un volumen del 10× del tampón TMSD.
  14. Repita los pasos 6.12 a 6.13 cinco veces para eliminar completamente el NP-40 residual.
  15. Resuspende el pellet en un volumen de 5× del Buffer B.
  16. Añadir 1 unidad de nucleasa microcócica (MNasa) por cada 10.000 núcleos e incubar en un baño maría a 37 °C. Ocasionalmente, agita el tubo durante la incubación para mantener los núcleos resuspendidos de forma uniforme
  17. En los puntos de tiempo indicados (0,5, 1 y 2,5 h), extraer 50 μL de la reacción en tubos de 1,5 mL, añadir inmediatamente 1 μL de 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) y vórtice.
  18. Extrae ADN de cada punto temporal siguiendo el procedimiento a continuación:
    1. Añadir 80 μL de H₂O, 30 μL de SDS al 10% y 20 μL de 5 M NaCl; Vórtice.
    2. Añadir 200 μL de fenol/cloroformo; Vórtice a fondo.
    3. Centrifugar a 20.000 × g, RT, 3 min.
    4. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.
    5. Añadir 1 mL de etanol al 100% y 20 μL de acetato sódico 3 M (pH 5,2); Vórtice.
    6. Centrifugar a 20.000 × g, RT, 5 min.
    7. Quita el sobrenadante, añade 1 mL de etanol al 70%.
    8. Centrifugadora a 20.000 × g, RT, 1 min.
    9. Retira el sobrenadante y seca el pellet a 55 °C con la tapa abierta durante 10 minutos.
    10. Resuspende el pellet en un buffer TE de 50 μL.
  19. Analizar muestras en un gel de agarosa TBE al 1% para confirmar el tamaño del ADN mononucleosoma (147 pb) (Figura 3B).
  20. (Opcional) La eficiencia digestiva de la micronucleasa (MNasa) varía según el tipo celular; se puede añadir MNasa adicional a mitad de la reacción si es necesario para eliminar completamente los polinucleosomas. Por ejemplo, si muestras de 1 h y 2 h parecen similares, añade más MNasa a las 3 h.
  21. Cuando se observa una banda predominante de ~147 pb, o cuando una incubación adicional de MNasa/prolongada ya no altera el tamaño del fragmento, detiene la reacción añadiendo 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) a una concentración final de 2 mM.
  22. Centrifugar a 1.300 × g, 4 °C, durante 5 minutos. Recoge el sobrenadante (S1).
  23. Resuspende el pellet en un volumen de 10× de tampón TE + inhibidores de proteasa e incuba la muestra en un rotador de tubo ajustado a 20 rpm a 4 °C durante al menos 30 minutos.
    NOTA: Las eficiencias en la extracción de mononucleosomas varían según el tipo celular. El NaCl de 0 a 300 mM puede utilizarse para extraer nucleosomas de forma eficiente.
  24. Centrifugar a 1.300 × g, 4 °C, durante 5 minutos. Recoge el sobrenadante (S2).
  25. Transfiere 50 μL de cada uno de S1 y S2 a tubos separados de 1,5 mL.
  26. Analizar todas las fracciones mediante electroforesis en gel de agarosa (pasos 6.17 a 6.18) para evaluar la distribución del tamaño del ADN y la eficiencia de la extracción. La mayoría de los mononucleosomas se encuentran en la fracción S2 (Figura 3C).
  27. Transfiere S2 a tubos de centrifugación de alta velocidad y centrifuga a 20.000 × g, 4 °C, durante 10 minutos para eliminar material insoluble.
  28. Recoger el sobrenadante y diálisis contra el tampón de lisis BC150 (sin inhibidores):
    1. Primera diálisis: 1 L, 1 hora.
    2. Segunda diálisis: 2 L, durante la noche.
  29. Tras la diálisis, centrifugar de nuevo a 20.000 × g, 4 °C, durante 10 minutos para eliminar cualquier residuo insoluble restante.
  30. Recoge el último sobrenadante.
  31. Mezclar 5 μL del sobrenadante con 35 μL de tampón de lisis BC150 y 10 μL de tampón de Laemmli 5× calentar a 95 °C durante 5 minutos y cargar 1, 2, 5, 10 y 20 μL en un gel SDS–PAGE al 15%.
  32. Carga 1, 2 y 5 μL de 0,1 mg/mL de BSA en el tampón de Laemmli como referencia para la estimación del rendimiento.
  33. Teñir con azul Coomassie y estimar el rendimiento de nucleosomas de forma semicuantitativa usando un software de análisis de imágenes (Figura 3D).

7. Pulldown de nucleosomas modificados

  1. Preparar 2× tampón bloqueador de perlas disolviendo 1 g de BSA en el tampón de lisis BC150 a un volumen final de 10 mL, luego vórtice hasta que se disuelva completamente.
  2. Transfiere las perlas FLAG-SPIN4-WT y FLAG-SPIN4D82H que contengan cantidades molares equivalentes de proteína (de la Sección 5, Pasos 5.16 a 5.17) en tubos separados de 1,5 mL.
  3. Añadir un volumen igual de perlas de control negativas (de la Sección 5, Paso 10) a la muestra FLAG-SPIN4-WT.
  4. Ajusta el volumen total de todas las muestras de perlas para que sea idéntico usando el buffer de lisis BC150.
  5. Añade un volumen igual de 2× buffer bloqueador de perlas a cada tubo que contenga las perlas y al buffer de lisis BC150.
  6. Incubar las muestras en un rotador de tubo ajustado a 20 rpm a 4 °C durante la noche (O/N).
  7. Descongelar una cantidad adecuada de 1× nucleosoma extraído de HEK293FT células sobre hielo. El volumen requerido depende de la relación molar de nucleosomas a SPIN4 deseada. Para la optimización inicial, utiliza una proporción molar 1:1 entre nucleosomas y SPIN4.
  8. Mezcla 1× nucleosoma con un volumen igual de 2× buffer bloqueador de perlas.
  9. Combina la mezcla del Paso 7.8 con las perlas prebloqueadas en un tubo de 15 mL.
  10. Incuba la mezcla en un tubo rotador ajustado a 20 rpm a 4 °C durante 4 horas o durante toda la noche.
  11. Centrifugar a 3.000 × g, 4 °C, durante 3 minutos.
  12. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  13. Resuspende las perlas en un buffer de lisis de 1 mL de BC150 y transfiere a tubos de 1,5 mL.
  14. Lava las cuentas tres veces de la siguiente manera:
    1. Centrifugar a 3.000 × g, 1 min, y aspirar el sobrenadante.
    2. Resuspende las perlas en un tampón de lisis de 1 mL de BC150.
    3. De vez en cuando agita el tubo para mantener las cuentas suspendidas de forma uniforme durante el lavado.
  15. Lava las cuentas dos veces más de la siguiente manera:
    1. Centrifugar a 3.000 × g, 1 min, y aspirar el sobrenadante.
    2. Resuspende las perlas en un buffer de lisis de 1 mL de BC150.
    3. Gira a 20 rpm, 4 °C, durante 10 minutos.
  16. Tras el lavado, resuspende las esferas en volúmenes de 9 columnas (CV) de tampón lisis BC150.
  17. Toma 160 μL de cada muestra, mezcla con 40 μL de 5× tampón de Laemmli y calienta a 95 °C durante 5 minutos.
    NOTA: Se recomienda una elución peptídica flag del complejo proteína-nucleosoma, que produce resultados más limpios y con menos antecedentes.
  18. Centrifuga a 3.000 × g, a temperatura ambiente, durante 5 minutos.
  19. Carga 5 μL del sobrenadante sobre un gel SDS–PAGE al 15% y realiza tinción de plata (Figura 4A).
  20. Carga otros 5 μL del sobrenadante sobre un gel SDS–PAGE al 15%, transfiere a una membrana PVDF y sonda con los anticuerpos primarios y secundarios adecuados específicos para las PTM de histonas objetivo (Figura 4B).

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Resultados

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Para investigar los sustratos de unión del SPIN4 humano, se reconstituyeron el SPIN4 tipo salvaje y un mutante derivado del paciente asociado al síndrome de sobrecrecimiento utilizando un sistema de expresión celular de insecto Sf9. Específicamente, se trata de una mutación missense de ácido de aspártico (D) a histidina (H) en el residuo 82 (D82H), que reside dentro del primer dominio Tudor de SPIN4, lo que implica su papel en la regulación de la unión al sustrato de SPIN4. Se utilizó un...

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Discusión

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Se presentó un método eficiente en tiempo y coste para identificar bioquímicamente PTMs específicos de histonas como objetivos de una proteína mal caracterizada, y para evaluar cómo su mutación asociada a la enfermedad afecta la afinidad de unión del objetivo. La ventaja de este método es que no requiere una reconstitución costosa ni lenta de nucleosomas sintéticos. Este enfoque aprovechó la comodidad de los arreglos comerciales de péptidos PTM de histonas, asegurando al mismo tiempo que...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a todos los miembros actuales y pasados del laboratorio Yu y Jee por su apoyo técnico. J.-R.Y. contó con el apoyo del NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. SÍ. J contó con el apoyo del Hospital Nacional de Niños y del Instituto de Investigación Infantil.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos microcentrífugas de 1,5 mLSarstedt72.690.001Experimentos generales
Plato de cultivo tisular de 15 cmSarstedt83.3903.300Experimentos generales
Tubos centrífugos cónicos de 15 mLSarstedt62.554.101Experimentos generales
Tubos centrífugos cónicos de 50 mLSarstedt62.548.004Experimentos generales
Matraz Erlenmeyer de 500 mLStellar ScientificCT229809Cultivo celular Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerCytivaIMQ800Sistema de imagen CCD
Gel de afinidad anti-FLAG M2Sigma-AldrichA2220Pulldown bioquímico
Anticuerpo anti-FLAG M2Sigma-AldrichF1804Western blot
AprotininaMedChemExpressHY-P0017Inhibidor de proteasa
Array Analyze SofrwareMotivo activohttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipAnálisis de datos de matriz de péptidos MODificados
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700Gel de ADN
Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BacTermo Científica10359016Expresión baculoviral
Clorhidrato de benzamidinaMedChemExpressHY-W018781Inhibidor de proteasa
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647Estándar de cuantificación de proteínas
Bromofenol AzulTermo CientíficaA18469.08Amortiguador de Lammeli
Coomassie Brilliant Blue R-250Termo Científica20278Tinción en gel Protien
Ditiotreitol (TDT)Sigma-Aldrich & nbsp;D5545Búfer de lisis
EDTAProductos de investigación RPIE58100Búfer de lisis
Sustrato de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL)CytivaRPN2232Western blot
Medio de cultivo celular de insectos ESF 921Sistemas de expresión96-001Cultivo celular Sf9
Etanol (200 grados)Química del espectroET107Precipitación del ADN
Sistema de imagen EVOS M5000InvitrogenM5000Imagen general
Péptido FLAGMedChemExpressHY-P7006Elución de pulldown
GlicerolSigma-Aldrich & nbsp;G77893Búfer de almacenamiento
Anticuerpo H3K4me1 y nbsp;Motivo activo39300Western blot
Anticuerpo H3K4me2 y nbsp;Señalización celular9725TWestern blot
Anticuerpo H3K4me3 Señalización celular9751TWestern blot
HEK293FT celdasTermo CientíficaR70007Línea de fibroblasts renales embrionarios humanos
HEPESSigma-Aldrich & nbsp;H3375Búfer de lisis
ImageJInstitutos Nacionales de Saludhttps://imagej.net/ij/download.html  Programa de procesamiento de imágenes basado en Java
Hemisulfato de leupeptinaMedChemExpressHY-18234AInhibidor de proteasa
Nucleasa microcócica (MNasa)NEB M0247SEndonucleasa para la digestión de la cromatina
Modelo 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonicación
Matriz de Péptidos de Histonas MODIFICADASMotivo activo13005Ensayo de unión a proteínas
Pepstatina AMedChemExpressHY-P0018Inhibidor de proteasa
Fracción de IgG de peroxidasa IgG anti-ratón monoclonal de cabra, específica de cadena ligeraJackson ImmunoResearch115-035-174Western blot
pFastBac1-Flag-SPIN4Termo Científica10360014Vector de expresión baculoviral
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HTermo Científica10360014Vector de expresión baculoviral
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1)Sigma-AldrichP2069Purificación del ADN
Kit de ensayo de proteínas Pierce Rapid Gold BCATermo CientíficaPIA53226Cuanticaitón de proteínas
Kit de tinte de plata PierceTermo Científica24612Detección de proteínas
Inhibidor de la Proteasa PMSFTermo Científica36978Inhibidor de proteasa
Gel de poliacrilamidaFabricado internamenteN/AGel proteico
Células de insectos Sf9ATCCCRL-1711Línea celular de insectos para la expresión de baculovirus
Dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCOTermo Científica69572Diálisis de proteínas
Acetato de sodioSigma-AldrichS8750Precipitación del ADN
Cloruro de sodio y nbsp;Fischer BP358-1Amortiguadores generales
Dodecilo sulfato de sodio (SDS)Sigma-Aldrich & nbsp;L3771Amortiguadores generales
Solución azul de tripán (0,4%)Termo Científica15250061Tinción de núcleos

Referencias

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  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
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  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
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Etiquetas

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

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