Recientemente se han identificado variantes genéticas en el miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) en pacientes con sobrecrecimiento óseo, un trastorno novedoso del desarrollo. Se presenta un protocolo y nuevos resultados que describen la identificación bioquímica de histonas modificadas en el contexto de nucleosomas como sustratos de unión a SPIN4.
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Artículo de método
Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas
En este artículo
Resumen
Resumen
El miembro humano de la familia Spindlin 4 (SPIN4) acaba de emerger como un regulador novedoso del crecimiento óseo. Se identificaron variantes de pérdida de función en SPIN4 en pacientes que presentaban un síndrome de sobrecrecimiento pre y postnatal, que se hereda de forma dominante ligada al cromosoma X. SPIN4 contiene tres repeticiones tándem de dominios Tudor, cada una formando una jaula aromática individual. Estos dominios Tudor se consideran dominios lectores epigenéticos para los residuos de arginina y lisina metilados de histonas, basándose en la homología de secuencias. Sin embargo, los sustratos exactos de unión de SPIN4 siguen sin estar claros. El SPIN4 humano, tanto en su forma de tipo salvaje como mutante causante de enfermedades, se generó con éxito mediante un sistema de expresión celular de insectos. Mediante un arreglo de péptidos de modificación de histonas, se determinaron las afinidades diferenciales de unión entre el SPIN4 tipo salvaje y el mutante. Las validaciones funcionales demostraron además que SPIN4 es un lector legítimo de la metilación de la histina H3 lisina 4 (H3K4me), como lo demuestra la reducción bioquímica de mononucleosomas nativos. Este enfoque integrado facilita la identificación rápida de proteínas lectoras epigenéticas en el objetivo de unión.
Introducción
El Miembro de la Familia Spindlin 4 (SPIN4) es un lector epigenético y recientemente se ha implicado en el síndrome de sobrecrecimiento, presentándose con una constelación de crecimiento excesivo pre y postnatal y una estaturaalta 1,2. Los ratones knockout (KO) Spin4 recapitularon el fenotipo humano exacto, apoyando la causalidad. Hasta la fecha, SPIN4 es el único lector epigenético exclusivo identificado que regula negativamente el crecimiento óseo. Sin embargo, las propiedades bioquímicas de SPIN4, un lector epigenético crítico para el crecimiento, no han sido carac....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales que involucraron células HEK293FT se realizaron en cumplimiento con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad Commonwealth de Virginia.
1. Purificación de SPIN4 humano recombinante
- Clonar SPIN4 oSPIN4 D82H de tipo salvaje de longitud completa con una etiqueta de epítopo N-terminal 1× FLAG en un vector baculoviral 6,7.
- Prepara el baculovirus transfectando células Sf9 con vectores baculovirales, cosecha virus cuando las célu....
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Resultados
Para investigar los sustratos de unión del SPIN4 humano, se reconstituyeron el SPIN4 tipo salvaje y un mutante derivado del paciente asociado al síndrome de sobrecrecimiento utilizando un sistema de expresión celular de insecto Sf9. Específicamente, se trata de una mutación missense de ácido de aspártico (D) a histidina (H) en el residuo 82 (D82H), que reside dentro del primer dominio Tudor de SPIN4, lo que implica su papel en la regulación de la unión al sustrato de SPIN4. Se utilizó un.......
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Discusión
Se presentó un método eficiente en tiempo y coste para identificar bioquímicamente PTMs específicos de histonas como objetivos de una proteína mal caracterizada, y para evaluar cómo su mutación asociada a la enfermedad afecta la afinidad de unión del objetivo. La ventaja de este método es que no requiere una reconstitución costosa ni lenta de nucleosomas sintéticos. Este enfoque aprovechó la comodidad de los arreglos comerciales de péptidos PTM de histonas, asegurando al mismo tiempo que.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Los autores agradecen a todos los miembros actuales y pasados del laboratorio Yu y Jee por su apoyo técnico. J.-R.Y. contó con el apoyo del NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. SÍ. J contó con el apoyo del Hospital Nacional de Niños y del Instituto de Investigación Infantil.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos microcentrífugas de 1,5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | Experimentos generales |
| Plato de cultivo tisular de 15 cm | Sarstedt | 83.3903.300 | Experimentos generales |
| Tubos centrífugos cónicos de 15 mL | Sarstedt | 62.554.101 | Experimentos generales |
| Tubos centrífugos cónicos de 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 | Experimentos generales |
| Matraz Erlenmeyer de 500 mL | Stellar Scientific | CT229809 | Cultivo celular Sf9 |
| Amersham ImageQuant 800 CCD Imager | Cytiva | IMQ800 | Sistema de imagen CCD |
| Gel de afinidad anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | A2220 | Pulldown bioquímico |
| Anticuerpo anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | Western blot |
| Aprotinina | MedChemExpress | HY-P0017 | Inhibidor de proteasa |
| Array Analyze Sofrware | Motivo activo | https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip | Análisis de datos de matriz de péptidos MODificados |
| ASI Agarose LE | Alkali Scientific | A7700 | Gel de ADN |
| Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac | Termo Científica | 10359016 | Expresión baculoviral |
| Clorhidrato de benzamidina | MedChemExpress | HY-W018781 | Inhibidor de proteasa |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Estándar de cuantificación de proteínas |
| Bromofenol Azul | Termo Científica | A18469.08 | Amortiguador de Lammeli |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Termo Científica | 20278 | Tinción en gel Protien |
| Ditiotreitol (TDT) | Sigma-Aldrich & nbsp; | D5545 | Búfer de lisis |
| EDTA | Productos de investigación RPI | E58100 | Búfer de lisis |
| Sustrato de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) | Cytiva | RPN2232 | Western blot |
| Medio de cultivo celular de insectos ESF 921 | Sistemas de expresión | 96-001 | Cultivo celular Sf9 |
| Etanol (200 grados) | Química del espectro | ET107 | Precipitación del ADN |
| Sistema de imagen EVOS M5000 | Invitrogen | M5000 | Imagen general |
| Péptido FLAG | MedChemExpress | HY-P7006 | Elución de pulldown |
| Glicerol | Sigma-Aldrich & nbsp; | G77893 | Búfer de almacenamiento |
| Anticuerpo H3K4me1 y nbsp; | Motivo activo | 39300 | Western blot |
| Anticuerpo H3K4me2 y nbsp; | Señalización celular | 9725T | Western blot |
| Anticuerpo H3K4me3 | Señalización celular | 9751T | Western blot |
| HEK293FT celdas | Termo Científica | R70007 | Línea de fibroblasts renales embrionarios humanos |
| HEPES | Sigma-Aldrich & nbsp; | H3375 | Búfer de lisis |
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud | https://imagej.net/ij/download.html | Programa de procesamiento de imágenes basado en Java |
| Hemisulfato de leupeptina | MedChemExpress | HY-18234A | Inhibidor de proteasa |
| Nucleasa microcócica (MNasa) | NEB | M0247S | Endonucleasa para la digestión de la cromatina |
| Modelo 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | Sonicación |
| Matriz de Péptidos de Histonas MODIFICADAS | Motivo activo | 13005 | Ensayo de unión a proteínas |
| Pepstatina A | MedChemExpress | HY-P0018 | Inhibidor de proteasa |
| Fracción de IgG de peroxidasa IgG anti-ratón monoclonal de cabra, específica de cadena ligera | Jackson ImmunoResearch | 115-035-174 | Western blot |
| pFastBac1-Flag-SPIN4 | Termo Científica | 10360014 | Vector de expresión baculoviral |
| pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H | Termo Científica | 10360014 | Vector de expresión baculoviral |
| Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | Purificación del ADN |
| Kit de ensayo de proteínas Pierce Rapid Gold BCA | Termo Científica | PIA53226 | Cuanticaitón de proteínas |
| Kit de tinte de plata Pierce | Termo Científica | 24612 | Detección de proteínas |
| Inhibidor de la Proteasa PMSF | Termo Científica | 36978 | Inhibidor de proteasa |
| Gel de poliacrilamida | Fabricado internamente | N/A | Gel proteico |
| Células de insectos Sf9 | ATCC | CRL-1711 | Línea celular de insectos para la expresión de baculovirus |
| Dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO | Termo Científica | 69572 | Diálisis de proteínas |
| Acetato de sodio | Sigma-Aldrich | S8750 | Precipitación del ADN |
| Cloruro de sodio y nbsp; | Fischer | BP358-1 | Amortiguadores generales |
| Dodecilo sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich & nbsp; | L3771 | Amortiguadores generales |
| Solución azul de tripán (0,4%) | Termo Científica | 15250061 | Tinción de núcleos |
Referencias
- Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
- Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with....
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Reimpresiones y permisos
