Aislamiento robusto e identificación multiplexada de células raras circulantes mediante microfluídica centrífuga continua e inmunocitoquímica de hidrogel

Resumen

Este estudio presenta un flujo de trabajo microfluídico centrífugo continuo para el aislamiento e identificación eficiente de células raras circulantes. El sistema permite un control preciso de líquidos y minimiza la pérdida celular, facilitando el análisis simultáneo de múltiples subtipos de CRC, incluidos CTCs y cCAF, para mejorar la precisión diagnóstica.

Resumen

Las células raras circulantes (CRC), incluidas las células tumorales circulantes (CTC) y los fibroblastos asociados al cáncer circulantes (cCAFs), son biomarcadores prometedores para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. Sin embargo, su abundancia extremadamente baja y heterogeneidad fenotípica hacen que el aislamiento eficiente y el análisis multiparamétrico sean técnicamente complicados. Aquí presentamos un flujo de trabajo microfluídico centrífugo continuo para el aislamiento secuencial e identificación de CRCs a partir de sangre entera. El cartucho consta de cinco cámaras interconectadas con válvulas controlables que permiten un manejo preciso del medio de gradiente de densidad y las capas de sangre durante la centrifugación. Basado en una plataforma de enriquecimiento previamente validada, el flujo de trabajo actual integra la inmovilización celular basada en hidrogel con inmunocitoquímica multiplexada para apoyar la identificación y caracterización posterior de múltiples subtipos de CRC, incluyendo CTCs y cCAFs. Tras el aislamiento, las células se inmovilizan dentro de una matriz hidrogel para apoyar la retención celular durante la inmunotinción repetida y el análisis basado en imagen. Utilizando este flujo de trabajo, se identificaron tanto CTC como cCAFs a partir de la misma muestra, demostrando la viabilidad de un análisis integrado de múltiples poblaciones de células raras circulantes dentro de un único flujo de trabajo de biopsia líquida. Esta plataforma ofrece un enfoque práctico y reproducible para la caracterización posterior de células raras en aplicaciones de biopsias líquidas.

Introducción

Las células raras circulantes (CRC) se definen como células que existen en el torrente sanguíneo a frecuencias extremadamente bajas en comparación con componentes sanguíneos normales como los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas. Los CRC provienen de diversas fuentes, como subproductos de procesos biológicos, remodelación de tejidos, cicatrización de heridas o lesiones vasculares. Ejemplos representativos incluyen células endoteliales circulantes, células fetales circulantes, megacariocitos, eritroblastos y diversas células progenitoras o madre ^1,2. Aunque la existencia de las CRC por sí sola no refleja necesariamente un estado patológico, los niveles elevados suelen indicar condiciones fisiológicas o patológicas^{anormales 3,4}. En consecuencia, la detección y caracterización sensible de los CRC proporcionan valiosas perspectivas sobre los procesos fisiológicos y patológicos dinámicos que ocurren dentro del cuerpo.

Entre los subtipos de CRC, las células tumorales circulantes (CTC) y los fibroblastos asociados al cáncer circulantes (cCAFs) son biomarcadores principales del cáncer. Las CTC proporcionan evidencia directa de la diseminación de células tumorales y son ampliamente^{estudiadas 5}. Los cambios en la enumeración de CTC suelen asociarse con la detección temprana, el pronóstico y el seguimiento de la respuesta^{terapéutica 6}. Paralelamente, los cCAFs representan componentes estromales liberados hacia el torrente sanguíneo, reflejando las interacciones entre el microambiente tumoral y la formación del nicho^{premetastásico 7}. Sin embargo, en comparación con los CTC, la investigación sobre los cCAFs sigue siendo limitada y su utilidad clínica apenas comienza^{a explorarse.}

Las CTC y las cCAFs pueden proporcionar información biológica complementaria en biopsias líquidas, ya que las CTC reflejan la diseminación de las células tumorales y los rasgos metastásicos, mientras que las cCAFs pueden representar señales de remodelación estromalizada y de progresión asociadas al microambiente tumoral. Por tanto, el análisis simultáneo de estas dos poblaciones de células raras circulantes podría apoyar una comprensión más integrada de la progresión del cáncer que el análisis de cualquiera de las dos poblaciones por sí sola. Sin embargo, su utilidad clínica y traslacional está sustancialmente limitada por su extrema rareza en la sangre periférica, la ausencia de marcadores universalmente aceptados de los cCAFs y la significativa heterogeneidad de expresión de marcadores entre subpoblaciones celulares, que en conjunto dificultan una identificación fiable. Por tanto, minimizar la pérdida celular durante el enriquecimiento e identificación es fundamental para garantizar un análisis sólido y fiable. Además, la caracterización exhaustiva de la diversidad funcional y de marcadores de CTC y cCAF es esencial para esclarecer su papel en la metástasis y para desarrollar biomarcadores clínicamente^{significativos 8,9}.

Aquí presentamos un método para el aislamiento simultáneo de cCAFs y^{CTCs 10,11}, combinado con la identificación multimarcador mediante encapsulación hidrogel de inmunocitoquímica (ICC)¹² por hidrogel. Los métodos actuales de aislamiento de CRC suelen enfrentarse a limitaciones técnicas, como la pérdida celular durante el procesamiento en varios pasos, la captura restringida de células fenotípicamente heterogéneas y el sesgo de selección asociado a estrategias de enriquecimiento dependientes de marcadores. En cambio, la plataforma microfluídica centrífuga continua utilizada en este estudio se basa en un marco integral de enriquecimiento, reduciendo así la dependencia de marcadores convencionales de selección positiva. El rendimiento analítico y de flujo de trabajo de la plataforma de enriquecimiento subyacente ha sido descrito en nuestros estudios^{previos 9}.

Basándose en esa plataforma validada, el presente estudio se centra en la integración de la inmovilización celular basada en hidrogel e inmunocitoquímica multiplexada para permitir el aislamiento e identificación exhaustiva de múltiples poblaciones de células raras circulantes, incluyendo CTCs y cCAFs, dentro de un flujo de trabajo unificado. Al combinar enriquecimiento, retención celular estable y análisis repetidos compatibles con tinciones, este protocolo proporciona un marco práctico para el análisis integrado de células raras a partir de muestras de biopsia líquida.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron muestras de sangre humana de pacientes y donantes sanos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Severance. El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de Separación (IRB nº 4-2013-0059). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del dispositivo

1. Pulsa el interruptor de encendido para encender el instrumento.
2. Activa el interruptor de bloqueo láser y luego enciende el interruptor de alimentación láser .
3. Inicia el software operativo y confirma que el sistema se inicializa con normalidad.
4. Desde la interfaz principal del software, seleccione Operación del Dispositivo y seleccione el protocolo preestablecido para las muestras estándar de sangre total EDTA.

2. Funcionamiento del dispositivo -^{primer paso}

NOTA: Los detalles de las posiciones de entrada y la estructura del cartucho se muestran en la Figura 1A.

1. Desde la entrada 6, añade 2 mL de reactivo A (medio de gradiente de densidad) a la cámara inicial.
2. Desde la entrada 8, añadir 875 μL de reactivo A a la cámara de agotamiento.
3. Monta el cartucho en el soporte de discos, asegurando un equilibrio adecuado para la centrifugación.
4. Pulsa el botón de puerta del CTCeptor para abrir el soporte, luego monta el rack de discos en el CTCeptor y fijalo usando los tornillos de fijación.
5. Pulsa el botón de la Puerta para cerrar el soporte y ejecuta el paso de Spin Down usando el software CTCeptor (aproximadamente 30 s).
6. Tras confirmar que el Reactivo A ha sido transferido a la parte inferior de la recámara inicial, suelta los tornillos de fijación y retira el soporte de discos del instrumento manteniendo el cartucho montado.

3. Funcionamiento del dispositivo -^2º paso

1. Antes de manipular muestras de sangre, realiza todos los procedimientos en un armario certificado de seguridad biológica y lleva el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y protección ocular, de acuerdo con las directrices de bioseguridad institucional.
2. Con el cartucho retirado del instrumento, inyecta 3 mL de sangre en la cámara inicial a través de la entrada 6.
3. Monta el rack de discos en el CTCeptor y fijalo usando los tornillos de fijación.
4. Ejecuta el paso de Eliminación de los RBCs usando el software CTCeptor (aproximadamente 40 minutos). Durante este paso, la centrifugación separa plasma, glóbulos rojos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) dentro del cartucho, y la fracción que contiene PBMC se transfiere a la siguiente cámara para la posterior disminución de leucocitos.
5. Tras completar el paso de retirada de los RBC, retira el rack de discos del instrumento.

4. Funcionamiento del dispositivo -^{tercer paso}

1. Desinfecta cuidadosamente la zona de trabajo para mantener la esterilidad.
2. Manipula el reactivo B (perlas de aislamiento de leucocitos) para asegurar una suspensión homogénea.
3. Prepara el tampón de lavado mezclando Ca²⁺/^{Mg 2}⁺-free DPBS con 0,1% de BSA y 2 mM de EDTA (pH 7,4).
4. Transfiere el volumen deseado del Reactivo B a un tubo de 1,5 mL (por ejemplo, 50 μL por cartucho).
5. Añade el buffer de lavado a cinco veces el volumen del Reactivo B y mezcla suavemente pipeteando.
6. Coloca el tubo sobre un soporte magnético durante 1 minuto para que las cuentas del Reactivo B se acumulen, y luego descarta cuidadosamente el sobrenadante.
7. Vuelve a suspender las cuentas en el buffer de lavado a un volumen igual al volumen inicial de la cuenta.
8. Guarda las cuentas a 4 °C hasta que se usen.
9. Inmediatamente antes de su uso, mezclar 50 μL de las perlas preparadas con 50 μL de DPBS y cargar 100 μL de la mezcla en la entrada 7.
10. Monta el rack de discos en el CTCeptor y fijalo usando los tornillos de fijación.
11. Ejecuta el paso de eliminación de glóbulos blancos usando el software CTCeptor (aproximadamente 50 minutos). En este paso programado, las perlas de aislamiento de leucocitos cargadas se mezclan con la fracción que contiene PBMC agitando para promover la unión perla–WBC, seguida de la eliminación mediante centrifugación de la fracción de WBC unida a la perla.
12. Tras completar el paso de Eliminación de los WBCs, retira el rack de discos del instrumento.

5. Recuperación de muestras

1. Inserta una punta de pipeta en la salida 9 de la cámara final y vuelve a suspender el contenido, luego transfiere la muestra recogida a un tubo de 15 mL.
2. Inyecta 2 mL de DPBS en la salida 9, enjuaga bien la cámara pipeteando y transfiere el lavado al mismo tubo de 15 mL.
3. Repite el paso de lavado dos veces.
4. Ajusta el volumen del líquido recogido en el tubo de 15 mL a 14 mL con DPBS, tapa el tubo y mezcla suavemente por inversión.
5. Centrifuga el tubo a 380 × g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
6. Retirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL, y utilizar la suspensión restante para el análisis aguas abajo.

6. Identificación de CRC

1. Para preparar el polímero prehidrogel, mezclar DPBS libre de Ca^2⁺/Mg^2⁺, solución A de inmunocitoquímica de película hidrogel (HypICC) y el fotoiniciador en una proporción de 80:20:1.
2. Mezcla 870 μL de suspensión CRC con polímero prehidrogel de 270 μL.
3. Transfiere la mezcla a la cámara HypICC y centrifuga a 500 × g durante 5 minutos para permitir que las células se asienten en la plataforma.
4. Inserta el controlador de grosor en la cámara HypICC para ajustar el espesor del hidrogel.
5. Irradia la muestra con luz UV (365 nm) durante 20–30 segundos desde la parte inferior para entrecruzar la capa de hidrogel.
6. Quita el controlador de grosor y lava las células encapsuladas en hidrogel tres veces con DPBS.
7. Fija las células con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego lava las muestras tres veces con DPBS, 10 minutos cada una.
8. Permeabiliza las células con 0,05% de Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego lava las muestras tres veces con DPBS, 10 minutos cada una.
9. Bloquea las muestras con 2% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente.
10. Incubar las muestras con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
11. Lava las muestras cinco veces con DPBS, 20 minutos por lavado.
12. Teñe los núcleos con Hoechst durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego lava las muestras tres veces con DPBS, 10 minutos cada una.
13. Si es necesario, la incubación secundaria de anticuerpos puede realizarse bajo las mismas condiciones nocturnas que la incubación primaria de anticuerpos.
14. Realizar imágenes microscopías de fluorescencia e identificar los CRC.

7. Inmunotinción multiplexada de CRCs

1. Tras la inmunotinción y la imagen, las CRC pueden someterse a una ronda adicional de tinción por anticuerpos tras el apagamiento.
2. Prepara una solución de temple que consiste en 4,5% de_H2O2 y 24 mM de NaOH en PBS.
3. Retira el DPBS de la cámara HypICC y añade la solución de temple.
4. Incuba durante 1 hora a temperatura ambiente bajo luz blanca con agitación.
5. Sustituye la solución de temple y incuba durante 1 hora adicional bajo las mismas condiciones.
6. Lava las muestras cuatro veces con DPBS durante 10 minutos por lavado.
7. Reinicia el procedimiento de inmunotinción desde la fase de bloqueo usando un BSA al 2%.

Resultados

La Figura 1A muestra una imagen de un único cartucho utilizado para aislamiento de células raras. El cartucho consta de cinco cámaras individuales conectadas por microcanales y válvulas controlables que regulan el flujo de líquidos. La estructura del cartucho es la siguiente: (1) una cámara de plasma que recoge plasma separado de la sangre entera; (2) una cámara inicial en la que la sangre entera se separa en capas de plasma, glóbulos rojos y PBMC; (3) una c...

Discusión

Los CRC son biomarcadores importantes con potencial de valor tanto para el diagnóstico como para el pronóstico del cáncer. Sin embargo, para mejorar la utilidad clínica del análisis de CRC, es importante captar un rango más amplio de poblaciones fenotípicamente diversas de CRC y apoyar la caracterización multiparamétrica^{paralela 13}. Además, la creciente evidencia en oncoinmunología indica que los componentes inmunitarios y el microambiente tumoral desempeñan papel...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226