Un método optimizado para aislar el epitelio uretral femenino de ratón para análisis unicelular e inmunofluorescencia

Resumen

Este protocolo presenta un método optimizado para aislar el revestimiento epitelial de la uretra de ratón adulta para análisis posteriores, incluyendo citometría de flujo, inmunotinción y cultivo de organoides. Los métodos produjeron células epiteliales uretrales enriquecidas y viables, como lo demuestran el análisis de citometría de flujo, la imagen de montaje completo y la formación eficiente de organoides.

Resumen

La uretra, revestida por células epiteliales, actúa como conducto para la salida de orina desde el cuerpo. El revestimiento epitelial de la uretra está compuesto por distintos tipos celulares con firmas genéticas indicativas de un papel en la defensa antimicrobiana e inmune. Los macrófagos residentes incrustados en la capa epitelial uretral representan un subtipo transcripcionalmente distinto con supuestos roles en la vigilancia inmunitaria y la presentación de antígenos. Los patógenos urinarios ascienden por la uretra hasta llegar a la vejiga. Un estudio del revestimiento epitelial uretral y las células inmunitarias asociadas arrojará luz sobre los mecanismos de defensa del huésped en la parte baja del tracto urinario. Un objetivo central de este protocolo es proporcionar métodos optimizados para diseccionar la uretra de ratón hembra y aislar el revestimiento epitelial para análisis posteriores. El protocolo describe un método optimizado para aislar tejido epitelial de la uretra femenina del ratón mediante una separación enzimática y mecánica suave. Tras el aislamiento epitelial, se describen métodos para la digestión enzimática suave del epitelio uretral aislado y las células inmunitarias asociadas para obtener suspensiones unicelulares de alta viabilidad. El protocolo también detalla métodos para el análisis de citometría de flujo de las células epiteliales uretrales aisladas del ratón y de las células inmunitarias asociadas al epitelio. Además, aquí se presentan métodos para generar organoides epiteliales uretrales 3D estratificados a partir de células epiteliales aisladas. El protocolo también detalla un método optimizado para la inmunotinción completa de láminas epiteliales uretrales, que puede utilizarse para observar la morfología y las estructuras moleculares del epitelio uretral del ratón y las células inmunitarias asociadas. En general, los métodos descritos aquí para el aislamiento y la digestión unicelular de células epiteliales uretrales de ratón permiten análisis posteriores, incluyendo inmunotinción, citometría de flujo, generación de organoides y secuenciación de ARN unicelular.

Introducción

El tracto urinario inferior del ratón (LUT) consta de dos partes: la vejiga y la uretra. Durante las etapas embrionarias, las estructuras de la LUT se desarrollan a partir de la cloaca, una estructura transitoria derivada de un endodermo situada en la parte posterior caudal del intestino. La porción ventral de la cloaca, el seno urogenital, forma la vejiga por delante y la uretra por detrás¹. El revestimiento de la vejiga está bien estudiado. Forma una barrera férrea contra los componentes urinarios a través de placas cristalinas apicales compuestas por las proteínas^{uroplacinas 2,3,4}. Aunque el revestimiento de la vejiga es un epitelio transicional, la uretra muestra diferencias en la arquitectura epitelial desde el cuello hasta la abertura uretral distal. Además, la uretra muestra dimorfismo sexual en las estructuras epiteliales y en la arquitectura celular. La uretra del ratón macho está compuesta por epitelio transicional en el cuello de la vejiga, seguido de epitelio columnar y estratificado. La uretra de ratón hembra está revestida por epitelio transicional en el cuello de la vejiga y epitelio estratificado no escamoso de varias capas, salpicado por pequeños conductos que terminan en glándulas secretorias hacia el extremo^{distal 5}.

Las mujeres son más susceptibles a las infecciones urinarias (ITU), causadas principalmente por bacterias uropatógenas que ascienden desde el intestino a través de la uretra para infectar la^{vejiga 6}. La uretra es la primera superficie de la LUT que entra en contacto con patógenos urinarios ascendentes. La función de las células epiteliales uretrales, especialmente su papel como barrera inmunológica activa, ha sido poco estudiada. Trabajos recientes del mismo grupo proporcionaron un mapa espacial de resolución de célula única de la uretra⁵ de la hembra adulta del ratón. Identificó un revestimiento uretral de triple capa con células basales, intermedias y apicales. Intercaladas en el revestimiento epitelial hay células neuroendocrinas^{raras 5,7}. Hacia la mitad de la uretra, pequeños conductos se ramifican desde el tronco principal de la uretra, terminando en grupos de glándulas secretoras, incrustados en el compartimento estromal de la uretra. Los datos transcriptómicos revelaron que las células epiteliales de la uretra expresan genes inmunomoduladores y antimicrobianos que pueden influir en la defensa del huésped⁵. Estudiar las propiedades y atributos de las células epiteliales uretrales relacionados con su potencial de defensa y funciones inmunomoduladoras puede proporcionar estrategias novedosas para combatir las ITU.

Utilizar el ratón para estudiar el epitelio uretral permite estudios temporales e investigaciones del dimorfismo sexual. Dadas las similitudes del ratón con el humano en cuanto a la arquitectura celular de la vejiga y^{la uretra 1}, el ratón se ha utilizado extensamente para estudiar el desarrollo embrionario del tracto urinario^{inferior 1,8,9}. Los ratones también se han utilizado en modelos de instillación transuretral para estudiar las ITU causadas por patógenos^urinarios 10,11,12. El tejido del tracto urinario inferior es difícil de acceder en los pacientes, salvo que se sometan a una resección por cáncer u otros trastornos. Es difícil acceder a una fuente de tejido humano consistente y sano, y el ratón proporciona un modelo útil para investigar tejidos en el tracto urinario inferior para estudios sobre homeostasis tisular, reparación y respuesta a insultos inflamatorios. El revestimiento uretral de la hembra del ratón y humano está compuesto por epitelio transicional en el cuello de la vejiga y epitelio estratificado no escamoso y no queratinizado hacia el extremo distal. Se observa epitelio escamoso en el extremo distal de la uretra femenina humana, aunque se observa variabilidad en el revestimiento uretral femenino humano a partir de^{los 5,13} años. Aunque no se han realizado comparaciones del revestimiento uretral a nivel de transcriptoma entre la uretra humana y la del ratón, el ratón representa un modelo útil para captar el patrón epitelial, las interacciones epitelial-inmune y la respuesta a infecciones en la uretra.

En este estudio, los autores describen métodos para la disección de la uretra de ratón adulta de longitud completa, el aislamiento del epitelio uretral y la digestión enzimática suave para preparar suspensiones unicelulares. Este es el primer protocolo detallado para el aislamiento y digestión del tejido epitelial uretral femenino de ratón. El protocolo optimizado produce una población enriquecida de células epiteliales unicelulares que pueden utilizarse para diversos análisis posteriores. Tal y como se presenta en el estudio, los autores han realizado citometría de flujo en una suspensión unicelular de aislados epiteliales uretrales, lo que demuestra la presencia de células individuales viables, predominantemente de naturaleza epitelial. Además, estas células epiteliales son capaces de generar organoides en cultivo 3D, que se asemejan al revestimiento uretral estratificado del ratón. Los autores también demuestran la tinción completa de láminas epiteliales uretrales para estudiar la asociación de células inmunitarias asociadas al epitelio, específicamente macrófagos, con células epiteliales uretrales. Los métodos descritos en este artículo ayudarán en la investigación sobre el revestimiento uretral y su papel en la defensa inmunitaria.

Protocolo

Todos los estudios en ratones se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Institucional Animal (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) y del Comité de Bioseguridad Institucional (inStem/G-141(3)-22/DBJ) en el BRIC Instituto de Ciencia de Células Madre y Medicina Regenerativa, Bengaluru. Para este estudio se utilizaron ratones hembras CD-1 o C57BL6/J de entre 6 y 12 semanas de edad alojadas en el Centro de Cuidado y Recursos Animales (ACRC) del Centro Nacional de Ciencias Biológicas (NCBS), Clúster de Ciencias de la Vida de Bangalore (BLiSC). Los ratones fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos bajo un ciclo de 12 horas luz-oscuridad con alimento y agua ad libitum.

Todos los materiales utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Disección y recogida de la uretra de ratón hembra adulta

1. Eutanasia al ratón usando CO₂ hasta que deje de respirar. Realizar una luxación cervical como modo de eutanasia secundaria.
2. Coloca al ratón en posición supina y rocía etanol al 70% para humedecer el vello del abdomen (Figura 1A).
3. Levanta la piel del abdomen con un par de pinzas y haz una incisión vertical hacia la parte inferior del cuerpo, terminando en la abertura uretral externa (Figuras 1B y 1C).
4. Identifica la vejiga y levántala suavemente con fórceps. En algunos casos, puede estar lleno de orina. Comprime suavemente la vejiga entre las pinzas para vaciarla.
   NOTA: La vejiga aparecerá como una estructura bulbosa.
5. Recorta la grasa y el tejido conectivo alrededor de la vejiga usando pequeñas tijeras de resorte para exponer la estructura en forma de mariposa donde se unen los dos huesos púbicos en la sínfisis púbica (Figura 1D). La uretra pasa por debajo de la sínfisis púbica.
6. Corta la sínfisis púbica levantándola con pinzas y abriéndola con unas tijeras pequeñas de resorte (Figura 1E). Retira los fragmentos del hueso púbico para que la uretra pueda verse descendiendo desde la vejiga (Figura 1F).
   NOTA: La uretra aparecerá como un tubo rojo delgado que se encuentra en la superficie ventral de la pared vaginal (Figura 1G).
7. Tira suavemente de la vejiga hacia arriba desde la cavidad corporal usando pinzas finas y pasa unas tijeras pequeñas de muelle entre la uretra y la pared vaginal para separar los tractos urinario y reproductor.
8. Mantener una ligera tensión en la vejiga mientras cortas a lo largo de la parte posterior de la uretra para separarla de la pared vaginal (Figura 1H–J). Corta hasta la abertura distal de la uretra para obtener la uretra de ratón de longitud completa (1,2–1,5 cm de longitud) (Figuras 1K y 1L).
9. Separa la uretra de la vejiga haciendo un solo corte en el cuello de la vejiga.

2. Aislamiento del tejido epitelial uretral

NOTA: El protocolo para aislar láminas epiteliales de la uretra fue modificado y optimizado a partir de un protocolo para aislar el epitelio^{endometrial 14}. La Figura 2 muestra los pasos para el aislamiento de láminas epiteliales uretrales del compartimento estromalical circundante (Figura 2A).

1. Transfiere la uretra diseccionada a una placa de Petri estéril que contenga la Solución Equilibrada de Sal de Hanks fresca 1x (HBSS, libre de Ca y Mg, detalles en la Tabla Suplementaria 1).
   NOTA: Se recomienda agrupar 4–5 uretras en esta etapa para la separación epitelial y la digestión unicelular.
2. Bajo un microscopio disecador, recortar la grasa y el tejido conectivo que rodea la uretra usando pinzas de punta fina y tijeras pequeñas de resorte (Figura 2B).
3. Corta cada uretra en dos piezas de tamaño igual transversalmente y colócalas sobre la parte superior de un colador de malla de nylon de 100 micras (Figura 2C–G).
4. Lava los pajidos pasando 1 mL de 1x HBSS (sin Ca ni Mg) sobre los tejidos.
5. Transfiere fragmentos de tejido a un tubo microcentrífuga (MCT) de 1,5 mL (Figura 2H) que contiene 1 mL de tripsina al 1% (1% de tripsina, w/v a 1x sHBSSa, detalles dados en la Tabla Suplementaria 2).
6. Digiera el tejido incubándolo durante 15–30 minutos en un rotador de muestra (30 rpm) a 4 °C.
7. Después de la incubación, retirar los tubos de 4 °C. Añadir MgCl₂ (1 M MgCl₂, caldo preparado en 1x HBSS) a una concentración final de 10 mM y DNasa I (10 mg/mL DNasa I, caldo preparado en 1x PBS) a una concentración final de 10 μg/mL en el mismo tubo que las piezas de tejido.
8. Transfiere el tubo a un horno de hibridación a 37 °C en un rotador de muestra para incubar durante 15–30 minutos.
   NOTA: Los tiempos de incubación de la tripsina a 4 °C y 37 °C pueden ajustarse según la aplicación posterior. Es preferible utilizar tiempos de incubación de 15 minutos para la tinción de montaje completo y incubación de 30 minutos para la digestión de células individuales.
9. Transfiere los tejidos a un MCT de 1,5 mL que contenga un 10% de suero de oveja en 1x HBSS (sin Ca ni Mg) para calmar la actividad de tripsina.
10. Transfiere los tejidos uretrales a un tubo nuevo que contenga HBSS helado 1x (libre de Ca y Mg). Luego transfiere a una placa de Petri estéril que contenga HBSS 1x bien frío.
11. Usando dos pinzas de punta fina, exprime el epitelio de la uretra. Sujeta un extremo de la pieza uretral usando un par de pinzas.
12. Con la otra mano, aprieta la pieza uretral entre las puntas de la pinza, pasando a lo largo de toda la longitud para exprimir el epitelio. Repita esto para los fragmentos uretrales restantes en el plato para aislar el epitelio (Figuras 2I–J).
    NOTA: Tras la separación mecánica, se extruye una fina capa de tejido epitelial transparente desde el lumen de la uretra. El epitelio uretral puede identificarse como fragmentos finos de tejido en forma de lámina que parecen más claros (transparentes) que el tejido estromal. Los aislados epiteliales deben ser piezas de tejido transparentes y etéreos que puedan transferirse a una placa de Petri para picar. Los aislados de tejido no deben descomponerse completamente. Si los fragmentos de tejido se descomponen completamente, el tiempo de incubación de la tripsina puede reducirse.

3. Digestión a suspensión de célula única

1. Transfiere fragmentos aislados de epitelio a una placa de Petri estéril usando una pequeña pipeta de transferencia de plástico o una punta de pipeta de 200 μL. Picar el epitelio en pequeños fragmentos usando tijeras de resorte pequeñas en una gota de 1x HBSS añadida directamente a los fragmentos (Figura 2K).
   NOTA: Los fragmentos de tejido estromales que quedan tras la separación epitelial pueden digerirse usando el mismo método que el epitelio aislado.
2. Transfiere piezas picadas usando una pipeta a un MCT de 2 mL que contiene 1,5 mL de solución digestiva de Accutasa precalentada (37 °C). La solución digestiva de Accutasa contiene lo siguiente: Accutasa, 10 μM Rocki Y-27632 y 100 μg/mL DNasa I.
3. Transfiere el tubo que contiene el tejido y la solución digestiva a un rotador de muestra en un horno de hibridación a 37 °C. Incuba durante 1 hora.
   NOTA: Se puede comprobar el contenido del tubo para comprobar que la digestión es exitosa antes de proceder. Digestión exitosa: El tejido picado está bien disperso en la solución de Accutasa, con solo unas pocas piezas visibles tras la incubación. Digestión fallida: Grandes fragmentos de tejido siguen presentes tras la incubación en solución de Accutasa. Los tejidos deben ser picados lo más finamente posible para una digestión exitosa.
4. Después de 1 hora, transfiere todo el contenido de los 2 mL de MCT a un tubo centrífuga de 5 mL y añade 2 mL de tampón de lavado (1 PBS sin Ca ni Mg, con albúmina sérica bovina al 1%).
5. Reduce la suspensión a 600 x g durante 5 minutos en una centrífuga de 4 °C con un rotor de cubeta giratorio.
6. Aspira el sobrenadante usando un vacío suave y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de tampón de lavado usando una pipeta de 1 mL con punta de filtro.
7. Usando la punta de la pipeta, rompe el pellet pipeteando arriba y abajo hasta que los grumos se hagan más pequeños. Pasa la suspensión con 4 tiempos por una aguja de calibre 23 1/2 unida a una jeringuilla de 1 mL, seguido de 4 a 6 pasadas por una aguja calibre 26 1/2 unida a una jeringuilla de 1 mL.
   NOTA: Se requiere pasar por una aguja de calibre pequeño para obtener una suspensión uniforme de célula única y evitar la formación de células. Aunque este paso puede causar estrés cortante y muerte celular, los autores han optimizado el número de golpes con la aguja y la jeringuilla para proporcionar una sola suspensión sin una muerte celular excesiva. Saltarse este paso resulta en una gran proporción de células agrupadas, lo que complicará el análisis posterior como la secuenciación de ARN unicelular y la citometría de flujo.
8. Añade 1 mL de tampón de lavado para humedecer la superficie de un filtro de preseparación de 30 micras colocado sobre un tubo de 5 mL. Utiliza la jeringuilla conectada a la aguja calibre 26 1/2 para transferir 1 mL de la solución celular a través del colador.
9. Añade 1 mL de tampón de lavado adicional al tubo que contiene las celdas, y luego toma esta solución con la jeringuilla y pasa por el filtro. Pilas de pellets por centrifugación a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo giratorio.
10. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 100 μL de tampón de lavado, y añade 100 μL de 1 tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Incuba la suspensión a temperatura ambiente durante exactamente 3 minutos, luego añade 4 mL de tampón de lavado y vuelve a suspender el pellet.
    NOTA: Se recomienda la lisis de los glóbulos rojos para eliminar las células sanguíneas de la suspensión epitelial uretral. Aunque este paso puede tener un efecto menor en la viabilidad de las células epiteliales, el protocolo utilizó un tampón de lisis de glóbulos rojos diluido 0,5 veces y una incubación de 3 minutos para minimizar la pérdida celular y preservar la viabilidad celular.
11. Cosechar las celdas por centrifugación a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo giratorio.
12. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 50–200 μL de buffer de lavado según el tamaño del pellet.
    NOTA: El tamaño de los pellets obtenidos de 4–5 muestras epiteliales uretrales de ratón agrupadas será pequeño pero aún visible a simple vista. Es esencial centrifugar las celdas utilizando un rotor de cubo giratorio para que el pellet se acumule en la parte inferior del tubo en lugar de quedar esparcido por el lateral. Los investigadores han registrado un rendimiento celular de 28.000–34.000 células vivas por epitelio uretral de ratón.
13. Transfiere 5 μL de alitera de celdas a un MCT de 0,5 mL y añade 5 μL de azul de tripán. Mezcla y carga en el hemocitómetro para comprobar el rendimiento y la viabilidad celular.

4. Análisis de citometría de flujo de aislados epiteliales uretrales unicelulares

1. Una cuota de 100.000 células en un tubo centrífugo de 5 mL para realizar la inmunotinción fluorescente de células individuales desde el compartimento epitelial uretral, epitelial o estromal, para citometría de flujo. Compensa el volumen en el tubo a 4 mL con 1x PBS.
   NOTA: Para obtener resultados fiables con citometría de flujo, se recomienda un mínimo de 50.000 células por muestra.
2. Haz girar la suspensión de la celda a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo oscilante.
3. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 50 μL de 1x PBS.
4. Añade 50 μL de 2x Ghost dye Violet 450 (1 μL de Ghost tinte en 500 μL de 1x PBS) a la suspensión de la celda para obtener 100 μL de solución de 1x Ghost dye.
   NOTA: El Ghost Dye V450 es un colorante de viabilidad reactivo a la amina que puede usarse para discriminar entre células viables y no viables en aplicaciones de citometría de flujo.
5. Añadir 5 μL de solución bloqueadora de los receptores Fc (anti-ratón CD16/32) por cada 100 μL de suspensión celular e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Este paso es necesario para bloquear la unión de la inmunoglobulina a los receptores Fc.
6. Incuba la suspensión celular sobre hielo durante 25 minutos adicionales.
7. Diluir la suspensión celular a 5 mL usando tampón de tinción celular (1x PBS, 0,02% (p/v) azida de sodio y 1% (p/v) BSA, véase la Tabla Suplementaria 3). Centrifuga a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo oscilante. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el perdigón celular en 100 μL de tampón de tinción celular.
   NOTA: La azida de sodio es altamente tóxica. Evita el contacto con la piel, los ojos y la ropa. Utiliza el equipo de protección individual (EPP) adecuado al manipularlo.
8. En 100 μL de suspensión celular, añadir 5 μL de anticuerpos primarios conjugados: anti-CD326/EPCAM (marca células epiteliales), anti-F4/80 (marca macrófagos murinos) y anti-CD45 (marcador paninmune) con una dilución de 1:20. Incuba la suspensión celular sobre hielo durante 30 minutos.
9. Diluye la suspensión de la celda a 5 mL usando un tampón de tinción de celdas, y luego centrifuga a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo oscilante. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 500 μL de tampón de tinción celular.
10. Transfiere la suspensión de la celda a través de un colador de malla de nylon de 35 micras en tubos de clasificación de tapas de filtro. Coloca tubos sobre hielo hasta que hagas un análisis más profundo.
11. Realiza la configuración inicial y la comprobación de rendimiento en el citómetro.
12. Ajusta los voltajes usando muestras sin teñir y completamente teñidas. Realiza la compensación con controles de talón y procede a la adquisición.
    NOTA: Los experimentos con más de un fluoróforo requieren compensación. Prepara los controles de compensación necesarios. Necesitarás controles con una sola tinción (es decir, perlas de compensación) para cada fluoróforo utilizado en el experimento. La compensación puede realizarse automáticamente según la configuración del software del citómetro de flujo. Se recomiendan controles FMO (fluorescencia menos uno) para distinguir entre poblaciones celulares positivas y negativas para un fluoróforo dado. Prepara los FMO incluyendo todos los fluoróforos de la muestra excepto el que se está controlando.
13. Ajusta las compuertas usando controles FMO (fluorescencia menos uno) y adquiere 50.000 eventos por muestra.

5. Cultivo de organoides epiteliales uretrales

NOTA: Para organoides epiteliales uretrales de ratón, sigue los Protocolos, Sección 3, Digestión a suspensión unicelular, pasos 3.1 a 3.11. para obtener suspensiones de celda única.

1. Resuspende el pellet de células epiteliales uretrales en un medio de expansión organoide de 50–100 μL (detalles en la Tabla Suplementaria 4). Obtén la viabilidad y el número celular contando con un hemotómetro.
2. Preparar una mezcla 1:4 de suspensión celular (1 parte) y Cultrex (4 partes), con una concentración final de 5000 celdas en 25 μL. Añadir 3 gotas de suspensión de celda de 25 μL (5000 celdas/gota) a cada pozo de una placa de 12 pozos.
   NOTA: Siempre pipete Cultrex suavemente con una punta cortada para evitar burbujas.
3. Transfiere la placa a una incubadora a 37 °C (5% de_CO2) durante 15 minutos para solidificar las gotas.
4. Cubre las gotas con 800 μL de medio de expansión organoide, suavemente desde los laterales del pozo, y transfiere la placa de nuevo a la incubadora.
   NOTA: Es obligatorio cambiar los medios cada 2 días. Sustituir el medio gastado por medios de expansión organoides frescos de 800 μL.
5. Toma imágenes de los organoides cada día desde el día 0 hasta el día 6 usando un microscopio invertido con una ampliación de 4x–20x.

6. Organoides uretrales, histología e inmunotinción

PRECAUCIÓN: El xileno es un disolvente altamente inflamable. Utiliza el EPI adecuado para manejar el producto químico. Recoge xileno usado como residuo orgánico de disolvente. Eliminarlo a través de programas aprobados para residuos químicos peligrosos. El formol es tóxico y causa irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias. Evita el contacto con la piel e inhalación. Utiliza el EPI adecuado para manejar el producto químico. Eliminarlo mediante sistemas institucionales de eliminación de residuos químicos peligrosos. El protocolo para incrustar organoides uretrales en bloques de parafina fue modificado y optimizado a partir de un protocolo para incrustar organoides^{endometriales 14}.

1. En el día 6 de cultivo organoide, descarta el medio gastado y lava los organoides con 1x HBSS a temperatura ambiente. Añade 1,5 mL de formalina neutral amortiguada (10%) a los pozos durante 15 minutos.
2. Desecha el fijador y añade 1,5 mL de hematoxilina a los pozos durante 10 minutos. Descarta la mancha y lávate dos veces con 1x HBSS.
3. Añade 1 mL de agarosa UltraPure al 2% de bajo punto de fusión hecha en 1x HBSS en cada pozo con 3 gotas, y deja que la agarosa solidifique durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Retira suavemente la agarosa del pozo usando el extremo plano de una espátula fina, asegurando que las gotas de Cultrex se desprendan con ella.
5. Transfiere el disco de agarosa a un casete de tejido y deshidrata en etanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación constante.
6. Deshidrata además en diferentes concentraciones de etanol y duración: 90% etanol durante 30 minutos, 100% etanol durante 30 minutos, 100% etanol durante 60 minutos, 100% etanol durante 90 minutos.
7. Seca el exceso de etanol y limpia con xileno durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repite el paso de limpieza de xileno durante 60 minutos.
8. Seca el exceso de xileno y transfiere a la cera de parafina infiltrante (65 °C) durante la noche.
9. Añade una capa fina de cera de incrustación a la base de un molde metálico y coloca el disco de agarosa encima. Retira el molde del calentador de corredera y cúbrelo rápidamente con cera incrustada a través de las ranuras del fondo del casete. Déjalo solidificar a temperatura ambiente.
10. Corta bloques organoides de parafina en un microtomo para obtener secciones de 5 μm. Coloca secciones en toboganes cargados positivamente.
11. Tinción de hematoxilina-eosina
    1. Cocer las láminas a 60 °C y desparafinizar con xileno y rehidratar mediante una serie de lavados con etanol (xileno 1 min, 100% etanol 1 min, 95% etanol 1 min, 75% etanol 1 min)
    2. Lava los deslizamientos con agua del grifo e incuba con Hematoxilina nº 2 de Gill durante 3 minutos. Coloca los deslizadores bajo un chorro de agua del grifo para que desarrollen un color azul.
    3. Incubar las láminas en etanol al 95% durante 1 minuto, seguidas de una solución de eosina al 0,25% durante 1 minuto. Lavar los deslizamientos en agua del grifo hasta que el agua se despeje.
    4. Deshidrata las láminas (95% etanol 1 min, 100% etanol 1 min) y limpia con xileno (1 min) antes de montar con medio de montaje de endurecimiento rápido.
12. Inmunotinción de secciones de parafina
    1. Hornea secciones de parafina de 5 μm en un horno de hibridación a 60 °C durante 1–2 horas.
    2. Dewax se desliza sumergiéndolo en xileno durante 6 minutos en un tarro de tinción para diapositivas.
    3. Rehidrata se introduce 100%, 95%, 75% de etanol en agua destilada durante 6 minutos cada uno. Luego lava las láminas en agua destilada durante 5 minutos.
    4. Añade láminas en un plato cuadrado de Pyrex que contiene 0,01 M de ácido cítrico (en agua destilada) para la recuperación de antígenos, y cubre el recipiente con film transparente. Realiza la extracción de antígenos calentando en microondas a alta potencia durante 20 minutos.
    5. Enfría a tibia durante 20 minutos y enjuaga las láminas en PBS durante 5 minutos. Dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de secciones de tejido y añade 100 μL/sección de buffer bloqueador de caballos durante 1 h a temperatura ambiente con un suave balanceo (véase la Tabla Suplementaria 5 para la preparación del buffer de bloqueo de caballos).
    6. Preparar la solución primaria de anticuerpos en el tampón de bloqueo de caballos añadiendo anticuerpos primarios en una dilución adecuada (1:100–1:200). Añade 100 μL de solución primaria de anticuerpos a cada sección. Incuba las láminas durante la noche a 4 °C con un suave balanceo.
       NOTA: Los organoides fueron inmunotiñados con anticuerpos contra la queratina 5/KRT5 (marcador epitelial basal), P63 (marcador epitelial basal), KRT4 (marcador epitelial intermedio/suprabasal) y KRT13 (marcador epitelial intermedio/suprabasal).
    7. Tras la incubación nocturna, lavar las láminas en PBS 4 x 5 min a temperatura ambiente con un suave mecimiento.
       NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en una caja protegida de luz a temperatura ambiente.
    8. Preparar una solución secundaria de anticuerpos en un tampón bloqueador de caballos, añadiendo anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a una dilución 1:500. Incuba las láminas durante 1 hora a temperatura ambiente con un suave balanceo.
    9. Lava las láminas en PBS 4 x 5 min a temperatura ambiente con un suave balanceo.
       NOTA: Paso opcional: usar kits de apagado de autofluorescencia para apagar la señal de autofluorescencia.
    10. Incuba con solución DAPI de 300 nM durante 5 minutos con un suave mecimiento. Lava en PBS durante 2 x 5 minutos a temperatura ambiente con un suave mecimiento.
    11. Montar con solución de montaje anti-desvanecimiento (90% glicerol, 0,2% n-propilo galato en 1x PBS). Secciones de imagen en un microscopio fluorescente de campo amplio.
        NOTA: Los ajustes de exposición de la cámara para cada fluoróforo deben ajustarse para maximizar la relación señal-ruido evitando la saturación de píxeles. Utiliza los mismos ajustes de exposición al fotografiar organoides teñidos en una sesión determinada.

7. Inmunotinción integral de láminas epiteliales uretrales aisladas

NOTA: Para la inmunotinción de montaje completo, siga el Protocolo, Sección 2, Aislamiento del tejido epitelial uretral, pasos 2.1 a 2.12. para obtener láminas epiteliales uretrales.

1. Transfiera cuidadosamente el tejido epitelial utilizando una pipeta de transferencia o una punta de 200 μL a un pozo de una bandeja de cultivo de 24 pozos que contenga 500 μL de formalina neutral tamponada al 10%. Sella la tapa de la placa con parafina y déjala incubar en un balancín durante 20 minutos a 4 °C.
   NOTA: Realiza todos los pasos en el mismo pozo para evitar la pérdida de tejido epitelial.
2. Aspira cuidadosamente el formol del pozo. Realiza un lavado con 500 μL de 1x PBS e incuba en una balancín durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repite el mismo paso de lavado una vez más.
3. Añadir 500 μL de solución de permeabilización que contenga 1x PBS + 1% Triton X-100 al pozo. Sella la tapa de la placa usando parafilm y incuba durante 2 horas a 4 °C con un suave balanceo.
4. Aspira cuidadosamente la solución de permeabilización del pozo.
5. Realizar bloqueo incubando tejidos en un buffer de bloqueo de caballos de 500 μL que contiene un 1% adicional de Triton X-100 (la receta para el buffer de bloqueo de caballos se proporciona en la Tabla Suplementaria 5). Sella la tapa del plato con parafilm y incuba durante la noche a 4 °C con un suave mecimiento.
6. Preparar la solución primaria de anticuerpos en un tampón de bloqueo de caballos que contenga un 1 % adicional de Tritón X-100 añadiendo anticuerpos primarios en una dilución adecuada (1:100–1:200). Aspirar la solución bloqueadora y añadir 500 μL de solución primaria de anticuerpos: anti-CDH1 (marcador de células epiteliales) y anti-F4/80 (marcador de macrófagos murinos). Sella la tapa con parafilm e incuba durante 48–72 horas a 4 °C con un suave balanceo.
7. Aspira cuidadosamente la solución primaria de anticuerpos y lava 3 veces con 1 PBS durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente, con un suave balanceo.
8. Preparar soluciones secundarias de anticuerpos en un tampón de bloqueo de caballos con un añadido del 1% de Triton X-100 añadiendo anticuerpos secundarios en una dilución adecuada (1:500).
9. Añade 500 μL de solución secundaria de anticuerpos al pozo y cubre la placa con papel de aluminio, e incuba durante 4–6 horas a temperatura ambiente sobre un balancín.
10. Aspira cuidadosamente la solución secundaria de anticuerpos y lava 3 veces con 1 PBS durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente.
    NOTA: La tinción con DAPI puede realizarse incubando tejidos con solución de material DAPI diluida (concentración final de 300 nM) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lava los pañuelos con 1x PBS (2x 5 min) a temperatura ambiente sobre una mecedora.
11. Transfiere cuidadosamente los tejidos epiteliales a una lámina de cristal o plato de imagen y añada una solución anti-desvanecimiento (90% glicerol, 0,2% n-propilo galato en 1x PBS).
12. Tejidos de imagen en un microscopio fluorescente.
    NOTA: Dado el grosor de la muestra, los autores recomiendan realizar imágenes con un microscopio fluorescente capaz de seccionar ópticamente. En este estudio, los autores utilizaron un microscopio fluorescente de campo amplio con sección óptica Apotome para eliminar la luz desenfocada y obtener pilas z. Se obtuvieron pilas z de imagen para visualizar proyecciones dendríticas de macrófagos asociados a epitelios.

Resultados

Disección y recogida de la uretra de ratón hembra adulta

En la primera parte de este estudio, los autores proporcionan un protocolo detallado para la disección de la uretra de ratón femenina. Dada su inserción a la pared vaginal ventral y su ubicación bajo la sínfisis púbica, el método aquí proporcionado permite la disección limpia de la uretra femenina de longitud completa (Figura 1).

Aislamiento del tejido epitelial uretral y análisis de citometría de flujo para aislados unicelulares

La digestión con tripsina facilita la separación del revestimiento epitelial de la uretra del estroma circundante. Tras la separación pueden observarse láminas epiteliales con mayor transparencia que el tejido estromal (Figura 2). Las láminas epiteliales separadas produjeron suspensiones unicelulares tras la digestión enzimática. Las células individuales aisladas del epitelio uretral muestran una viabilidad consistentemente alta (>80%) mediante exclusión de azul de tripán en un hemocitómetro (Figura 2L) y citometría de flujo utilizando tintes de viabilidad para engatar células vivas (Figura 3, Archivo Suplementario 1).

Los autores realizaron citometría de flujo para evaluar el enriquecimiento de células epiteliales a partir de suspensiones unicelulares de epitelio uretral. Para comprobar la viabilidad de la célula, la suspensión celular se teñió con un marcador vivo/muerto, el tinte fantasma reactivo a aminas V450. Los autores observaron consistentemente una viabilidad celular del >80% por el marcador vivo/muerto. El marcador vivo/muerto permitió la filtración de escombros y células muertas durante el análisis de flujo. Tintaron muestras con un marcador de células epiteliales (CD326/EPCAM), un marcador de macrófagos (F4/80) y un marcador de células inmunitarias (CD45) para registrar la composición de las células aisladas mediante este método. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que los autores aislaron una población celular epitelial enriquecida del epitelio uretral femenino del ratón. En ambos experimentos independientes realizados, el grupo logró entre el 80 y el 90 % de células epiteliales positivas para EPCAM tras la transición en células vivas. Los autores también observaron ~1,30 % de células inmunitarias CD45+ en la preparación epitelial. Los macrófagos asociados al revestimiento epitelial representaban ~1,18 % de las células vivas del compartimento epitelial. El análisis de citometría de flujo de suspensiones unicelulares a partir de láminas epiteliales muestra una contaminación estromal mínima (5–6%), que se debe principalmente al endotelio vascular según su estudio^{previo 5}. El Archivo Suplementario 1 muestra resultados de citometría de flujo para preparaciones unicelulares de los compartimentos epitelial y estromal. En comparación con el enriquecimiento del 80–90% de células epiteliales aisladas del compartimento epitelial, el compartimento estromal, que también mostró entre el 40 y el 50% de células epiteliales, que provienen de los conductos cortos y el epitelio glandular que se extienden desde la luz uretral hacia el estroma circundante (Figura 3, Archivo suplementario 1).

Cultivo de organoides epiteliales uretrales, histología e inmunotinción

Los autores también demuestran cómo las células epiteliales individuales aisladas de la uretra son viables y pueden formar organoides en una matriz 3D, y observaron el crecimiento de organoides desde células epiteliales uretrales individuales hasta el día 6 en cultivo (Figuras 4B–G). Realizaron tinción de hematoxilina-eosina (H&E) para observar la histología de los organoides (Figuras 4H–J). Los autores observaron dos morfologías distintas de organoides epiteliales uretrales, una grande y hueca, mientras que la otra tipo era más pequeña y sólida. En ambos casos, los organoides fueron marcadores estratificados y recapitulados expresados en el revestimiento epitelial de la uretra femenina, incluyendo KRT5 y P63 que marcan la capa basal y KRT4 y KRT13 que marcan las capas celulares suprabasales/intermedias (Figura 4K–N), Figura suplementaria 1). Se examinaron las diferencias en la capacidad de formación de organoides entre la uretra proximal y distal. Los organoides generados por la uretra proximal tenían una mayor proporción de organoides huecos, mientras que los organoides de la uretra distal formaban esferas sólidas (Figura 4O–P). Además, observaron diferencias en la eficiencia formadora de organoides en células epiteliales aisladas de las partes proximal y distal de la uretra. El epitelio uretral distal formó organoides con mayor eficiencia que el epitelio uretral proximal con la misma densidad inicial de siembra (5000 células/gota) (Figura 4Q–S).

Inmunotinción de montaje completo de láminas epiteliales uretrales aisladas

Los investigadores también presentan un método optimizado para la tinción completa de las láminas epiteliales uretrales de ratón. Aquí, tiñeron láminas epiteliales con dos marcadores: F4/80 para macrófagos y E-cadherina/CDH1 para marcar las uniones epitelial célula-célula (Figura 5). Los tejidos se fotografiaron utilizando un microscopio Zeiss Axio Observer 7 con sección óptica Apotome 3. Las láminas epiteliales muestran un marcaje fuerte con el anticuerpo CDH1. Preparaciones de epitelio uretral de montaje completo marcadas con anticuerpos contra F4/80 mostraron macrófagos formando un árbol de dendritas en el revestimiento epitelial. Se pudieron observar macrófagos enviando procesos dendríticos entre células epiteliales de la uretra. En conjunto, los resultados demuestran la utilidad de los protocolos descritos aquí para el estudio del revestimiento epitelial de la uretra de ratón femenina.

Figura 1: Disección de ratón para la recogida de la uretra femenina. (A) Colocar al ratón en posición supina y rociar el abdomen con un 70% de EtOH. (B–C) Abre el abdomen levantando la piel y haciendo una incisión vertical. (D) Recortar tejido graso y conectivo para exponer los huesos púbicos en forma de mariposa conectados en la sínfisis púbica (flecha en negro). (E) Corta la sínfisis púbica. (F) Una vez retirados los huesos púbicos, se puede ver la uretra descendiendo (delineada con una línea punteada en negro) desde la vejiga. (G) Tira suavemente de la vejiga con pinzas. La uretra es claramente visible como un tubo rojo y delgado. (H–I) Tira de la vejiga hacia arriba desde la cavidad corporal. Utiliza tensión en la vejiga para separar la uretra de la pared vaginal ventral. Pasa las tijeras entre la uretra y la pared vaginal para separar los tractos urinario y reproductor. (J–K) Desprenda el extremo distal de la uretra unida a la piel. (Izquierda) Imagen de una hembra de ratón diseccionada en el tracto urinario inferior (FLUT), mostrando vejiga y uretra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Aislamiento del epitelio uretral y preparación de una suspensión unicelular. (A) Esquema que representa la digestión enzimática y la separación mecánica de los compartimentos epitelial y estromales de la uretra, seguida de la digestión unicelular. (B) Eliminar la grasa extra del tracto urinario inferior femenino. (C–F) Corta la uretra de la zona del cuello de la vejiga para separar la uretra de la vejiga. Luego corta la uretra en dos mitades con tijeras finas. (G) Lavar las piezas uretrales con una solución de HBSS 1x pasando sobre un filtro de 100 micras. (H) Transferir fragmentos de tejido uretral a una solución de tripsina al 1%. Incuba en un rotador de muestra en la cámara fría. Añade MgCl₂ y DNasa I al mismo tubo. Incubar a 37 °C en un horno de hibridación sobre un rotador de muestras. (I–J) Aísla el epitelio apretando suavemente con pinzas finas a lo largo del fragmento uretral. (K) Los tejidos se pican en pequeños fragmentos usando tijeras finas. Transfiere el tejido epitelial picado a una solución digestiva de Accutasa e incuba a 37 °C en un horno de hibridación sobre un rotador de muestras. (L) Contar las células epiteliales y evaluar la viabilidad usando azul de tripán con un hemocitómetro. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Citometría de flujo para evaluar suspensiones unicelulares de los compartimentos del epitelio uretral y estroma. Se realizó citometría de flujo en preparaciones unicelulares de compartimentos epitelial (A) y estromales de ratón agrupados. Las células vivas fueron bloqueadas para excluir las células muertas teñidas con Ghost Dye V450. Se evaluaron las células vivas para la expresión de CD45 (marcador paninmunitario), CD326/EPCAM (marcador panepitelial) y expresión de F4/80 (marcador de macrófagos murinos). Los datos son representativos de 2 experimentos independientes realizados en un grupo de 5–6 ratones por experimento para generar muestras epiteliales y estromales. Abreviaturas; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Histología e inmunotinción de organoides epiteliales uretrales. (A) Esquema que muestra el flujo de trabajo para la generación de organoides epiteliales uretrales. (B–G) Micrografías representativas de campo claro de organoides epiteliales uretrales (UEOs) generadas a partir de células individuales en diferentes días de expansión in vitro. Imágenes representativas en campo claro de organoides epiteliales huecos (H) y (I) sólidos uretrales (UEOs) teñidos con hematoxilina y eosina (H&E). (J) Cuantificación de tipos de organoides generados a través de tres experimentos independientes. La barra de error representa el error estándar de la media. Imágenes representativas de organoides epiteliales uretrales huecos y (L) sólidos (UEOs) inmunoteliados con marcadores epiteliales KRT13 (marcador epitelial suprabasal), KRT5 (marcador epitelial basal) y P63 (marcador epitelial basal). Las imágenes que muestran canales fluorescentes individuales se muestran en K', K'', K', L', L'' y L''''. Imágenes representativas de organoides epiteliales uretrales huecos (M) y (N) sólidos (UEOs) inmunoteliados con marcadores epiteliales KRT4 (marcador epitelial suprabasal) y KRT5 (marcador epitelial basal). Las imágenes que muestran canales fluorescentes individuales se muestran en M', M'', N' y N". (O) Esquema de disección de la uretra proximal y distal. (P) Cuantificación de tipos de organoides generados a partir de la uretra proximal y distal a través de dos experimentos independientes. Micrografías representativas de campo claro de organoides epiteliales uretrales (UEOs) de día 6 generadas a partir de epitelio aislado de la uretra proximal (Q) y distal (R). Los datos de organoides generados a partir de la uretra completa representan 3 experimentos independientes realizados con un grupo de 3–5 ratones por experimento. (S) Los datos de organoides generados a partir de la uretra proximal y distal son representativos de 2 experimentos independientes realizados con un grupo de 3–4 ratones por experimento. Núcleos marcados con DAPI (azul). (Barras de escala, 100 μM). Esquemas preparados con BioRender y Adobe Illustrator. Creado en BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Inmunotinción completa de láminas epiteliales uretrales. (A) Sección congelada de 10 micras de la uretra hembra adulta del ratón en un medio de corte óptimo, mostrando inmunotinción para el marcador macrófago murino F4/80 (en rojo) y la proteína epitelial E-cadherina/CDH1 (en verde). (A') representa la vista ampliada de la inserción en (A). (B) Diagrama esquemático que muestra los pasos para la tinción completa de láminas epiteliales uretrales aisladas. Se realizó una inmunotinción integral del revestimiento epitelial uretral femenino aislado de ratón con anticuerpos contra el marcador macrófago murino F4/80 (en rojo) y la proteína epitelial E-cadherina/CDH1 (en verde). (C) Imagen representativa de la vista fusionada. (D) Proyección ortogonal de intensidad máxima del canal rojo mostrando la organización de los macrófagos. (E–F) Vista ampliada del epitelio y macrófagos asociados. Barra de escala blanca, 50 μM. Barra de escala de grises, 500 μM. Los datos representan 2 experimentos independientes realizados en un grupo de 4–5 ratones. Esquemas preparados en BioRender y Adobe Illustrator. Creado en BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Preparación de 1x HBSS (sin Ca, Mg).Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Preparación de 1x sHBSSa y 1 % de solución de tripsina.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Preparación del tampón de tinción de célula/flujo.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Preparación de medios de expansión organoidales para organoides epiteliales uretrales.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 5: Preparación del amortiguador de bloqueo de caballos.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Recuentos celulares para el experimento de citometría de flujo realizado en células individuales de los compartimentos epitelial uretral y estromales de dos experimentos independientes.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Comparación del epitelio uretral femenino de ratón adulto con organoides epiteliales uretrales. Imágenes representativas de (A) epitelio uretral femenino de ratón adulto, (B) organoides epiteliales uretrales huecos, y (C) organoides epiteliales uretrales sólidos (UEOs) inmunoteñidos con marcadores epiteliales KRT13 (marcador epitelial suprabasal), KRT5 (marcador epitelial basal) y P63 (marcador epitelial basal). Las imágenes que muestran canales fluorescentes individuales se muestran en A', A'', A', B', B'', B'', C'', C'' y C'''. Imágenes representativas de (D) epitelio uretral femenino adulto de ratón, (E) organoides epiteliales uretrales huecos y organoides epiteliales uretrales sólidos (UEOs) inmunoteñidos con marcadores epiteliales KRT4 (marcador epitelial suprabasal) y KRT5 (marcador epitelial basal). Las imágenes que muestran canales fluorescentes individuales se muestran en D', D''', E', E'', F' y F". Datos representativos de 3 experimentos independientes realizados con un grupo de 3–4 ratones por experimento. Núcleos marcados con DAPI (azul). (Barras de escala, 100 μM). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Las barreras epiteliales en el cuerpo son de vital importancia para la defensa del huésped. Estos son compartimentos especializados con múltiples tipos de células epiteliales y células inmunitarias residentes asociadas. Las barreras epiteliales cambian a lo largo del desarrollo, adquiriendo la expresión génica de defensa del huésped a menudo en respuesta a la microbiota o exposiciones ambientales. Los defectos en la integridad epitelial o la expresión génica pueden influir en la defensa del huésped¹⁵. Es esencial estudiar el tejido epitelial en aislamiento para entender las firmas transcriptómicas, así como para investigar los contactos célula-célula y la integridad epitelial. Actualmente no se han descrito en detalle métodos optimizados para aislar el tejido epitelial uretral de la ratón. Mientras que el epitelio de la vejiga solo puede aislarse por separación^{mecánica 16}, el epitelio uretral está presente dentro del tubo estromal de la uretra y requiere una combinación de separación enzimática y mecánica para aislar el tejido epitelial.

Aquí, los autores presentan un método optimizado para aislar láminas epiteliales del lumen uretral de ratones hembras. El método puede utilizarse para generar suspensiones unicelulares de alta viabilidad de células epiteliales uretrales para aplicaciones posteriores como citometría de flujo, cultivo de organoides e inmunotinción. La compatibilidad de este método con los flujos de trabajo de secuenciación de ARN unicelular ya había sido demostrada previamente por el mismo grupo⁵. Con modificaciones y optimizaciones adicionales, el protocolo presentado aquí puede adaptarse para extraer tejidos epiteliales de otros órganos tubulares para aplicaciones posteriores.

Los pasos clave del protocolo implican una disección cuidadosa de la uretra de ratón adulta de longitud completa, lo que permite estudiar diferencias regionales a lo largo del eje proximal-distal. A continuación, el protocolo utiliza una digestión enzimática suave para aflojar el revestimiento epitelial de la uretra respecto al estroma circundante. La digestión enzimática afloja el epitelial para permitir la separación mecánica, apretando suavemente el tubo uretral entre las pinzas para liberar el tejido epitelial. Los investigadores han optimizado cuidadosamente el momento de la digestión de la tripsina para permitir el aislamiento del epitelio uretral con alta viabilidad (> 80%) como láminas para inmunotinción o para aislamiento monocelular posterior (Figura 3, Archivo suplementario 1). La digestión unicelular del epitelio uretral reveló entre el 80 y el 90% de las células epiteliales en aislados epiteliales uretrales. A partir de un estudio previo, los autores identificaron que las células no epiteliales en esta preparación están compuestas principalmente por células inmunitarias asociadas al epitelio y endotelio^{vascular 5}. El método actual para el aislamiento de célula única produce suspensiones de célula única de alta calidad para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular, eliminando los agrupamientos celulares mediante interrupciones mecánicas mediante aspiración de agujas de pequeño calibre y la eliminación de glóbulos rojos mediante lisis suave.

Los resultados demuestran que este método puede usarse para enriquecer células inmunitarias específicas de compartimentos (Figura 3). El epitelio aislado de la uretra proximal y distal también puede estudiarse por separado. Además, los autores demostraron que las células epiteliales aisladas pueden utilizarse para la generación de organoides uretrales que no se han descrito previamente (Figura 4). Estos resultados también demuestran variabilidad regional en la capacidad de generación de organoides en la uretra femenina. Aunque los estudios recientes del autor han mostrado diferencias proximal-distales en la expresión génica epitelial y la organización de las células inmunitarias en la uretra⁵ femenina del ratón, el estudio actual muestra que las células epiteliales uretrales proximales forman menos organoides que el epitelio aislado de la uretra distal (Figura 4). Una limitación de esta demarcación espacial entre uretra proximal y distal es que no existe un punto anatómico que pueda usarse en el momento de la disección para distinguir entre estas dos áreas. En este estudio, los autores han dividido la longitud de la uretra por la mitad para obtener compartimentos proximal y distal. El método de aislamiento epitelial descrito aquí puede utilizarse para caracterizar aún más las diferencias en la expresión génica y la composición celular entre el epitelio uretral proximal y distal.

Aunque el protocolo optimizado presentado aquí es accesible y reproducible, algunos pasos requieren práctica y una calibración cuidadosa. En particular, el método de disección que se muestra aquí requiere una extracción cuidadosa del tubo uretral desde debajo de la sínfisis púbica, preservando toda la longitud de la uretra. Además, se debe tener cuidado de eliminar cualquier tejido vaginal adherido a la pared uretral dorsal tras la disección. La grasa presente alrededor del cuello de la vejiga debe eliminarse cuidadosamente para reducir la contaminación por adipocitos durante aplicaciones aguas abajo, como la secuenciación de ARN unicelular. Además, la digestión con tripsina debe optimizarse cuidadosamente con cada lote de enzima para asegurar una digestión constante. La digestión excesiva del tejido puede provocar pérdida de viabilidad celular. Los autores han optimizado cuidadosamente el tiempo de digestión de la tripsina, indicando una ventana de 15–30 minutos para los pasos de incubación a 4 °C y 37 °C. Esto puede optimizarse aún más según el lote de enzima utilizada. También es fundamental picar los tejidos en pequeños trozos para una digestión eficiente de células individuales. Los autores han utilizado Accutasa para una digestión adicional de células individuales, ya que resulta en una disociación suave. En caso de una reducción en la viabilidad celular, el tiempo de incubación de Accutase puede reducirse. Además, los autores han incluido el inhibidor de roca en la mezcla digestiva de Accutasa para mejorar la supervivencia celular. Se recomienda la digestión de DNasa para reducir el agrupamiento celular mediante la digestión del ADN extracelular liberado por células muertas y moribundas. Los autores también recomiendan el uso del tampón de lisis de glóbulos rojos para reducir la contaminación por glóbulos rojos que confundan resultados posteriores como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular.

Una limitación del método de aislamiento epitelial presentado aquí es que ha sido optimizado para la uretra femenina del ratón. La uretra del ratón macho es más anatómicamente compleja, con una arquitectura epitelial variable de la uretra proximal a la distal. Además, el método solo puede aislar las células epiteliales que recubren la luz uretral. Las glándulas secretoras uretrales conectadas al lumen uretral mediante conductos epiteliales cortos no pueden aislarse porque están incrustadas en el tejido estromal. En cambio, estas estructuras epiteliales se enriquecen en el compartimento estromal, que queda tras aislar el revestimiento epitelial uretral (Figura 3).

A pesar de estas limitaciones, este método ha permitido importantes conocimientos sobre la arquitectura epitelial uretral y permitirá una investigación más profunda en las células inmunitarias asociadas a la epitelio mediante la visualización in situ de macrófagos asociados a la piel. Ya se ha demostrado que el método es compatible con los flujos de secuenciación de ARN unicelular para identificar la heterogeneidad celular en el epitelio uretral y las células inmunitarias^{asociadas 5}. Además, la capacidad de aislar el epitelio de la uretra proximal y distal permitirá que los estudios comprendan las diferencias espaciales en la uretra. De manera significativa, el método de digestión celular epitelial produce células individuales viables que pueden generar organoides epiteliales uretrales, útiles para estudiar las interacciones huésped-patógeno y la biología epitelial de la uretra. En general, estos métodos enriquecen el conjunto de herramientas para permitir investigaciones más profundas sobre la biología epitelial uretral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Para hacer paneles de figuras
Adobe Photoshop	Adobe		Para hacer paneles de figuras
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 dilution, para citometría de flujo
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 dilution, para citometría de flujo
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 dilution
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 dilution, para citometría de flujo
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 dilution
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 dilution
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 dilution
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 dilution
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 dilution
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 dilution
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 dilution
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Análisis de datos de citometría de flujo
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002