Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de células madre de la pulpa dental a través de los conductos celulares

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado para aislar y caracterizar exosomas derivados de células madre pulpares dentales (DPSC) a través de los conductos, permitiendo una evaluación reproducible de la calidad y actividad funcional de los exosomas para aplicaciones regenerativas.

Resumen

Las células madre de la pulpa dental (DPSCs) representan una fuente accesible y clínicamente relevante de células madre mesenquimales, y sus exosomas derivados han surgido como vesículas bioactivas prometedoras para aplicaciones libres de células en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Sin embargo, los métodos reproducibles y estandarizados para aislar y validar funcionalmente exosomas derivados de DPSC siguen siendo limitados, especialmente en lo que respecta a la variabilidad introducida durante la expansión celular a través de los conductos. Aquí describimos un flujo de trabajo completo, estandarizado y basado en kits para el aislamiento y purificación de exosomas de un medio condicionado por DPSC, compatible con la práctica rutinaria de laboratorio. Este método permite la recuperación constante de vesículas intactas, adecuadas para la caracterización morfológica, molecular y funcional utilizando técnicas comúnmente disponibles. La identidad del exosoma se evalúa en función de la morfología, distribución de tamaño y expresión de marcadores, mientras que la actividad biológica se evalúa mediante un ensayo antiinflamatorio in vitro definido. Para examinar los efectos relacionados con los conductos, se comparan exosomas derivados de diferentes conductos DPSC utilizando esta lectura funcional, proporcionando un marco práctico para evaluar la consistencia durante la expansión celular. Al integrar aislamiento, purificación, caracterización y validación funcional en un único flujo de trabajo, este protocolo ofrece un enfoque reproducible y escalable para generar exosomas derivados de DPSC validados funcionalmente para la investigación de biomateriales y aplicaciones regenerativas.

Introducción

Los exosomas derivados de células madre mesenquimales actúan como mediadores cruciales de la comunicación intercelular y demuestran un potencial terapéutico significativo en los campos de la ingeniería tisular y la medicina regenerativa. Los exosomas son vesículas que miden entre 30 y 150 nm de diámetro, capaces de entregar moléculas bioactivas y regular diversas funciones en las células receptoras, como la proliferación, diferenciación y respuesta^{inmunitaria 1,2}. Entre las diversas fuentes de células madre mesenquimales (MSC), las células madre de la pulpa dental (DPSCs) son de particular interés debido a su fácil accesibilidad, robusta capacidad proliferativa, bajo riesgo tumorigénico y mínimas preocupaciones ^{éticas 3,4,5}. Los exosomas derivados de DPSC (DPSC-Exos) contienen un repertorio diverso de carga funcional, incluyendo proteínas, ARNm y microARNs, lo que les permite conservar muchas de las propiedades biológicas de sus células parentales. Estudios previos han demostrado que DPSC-Exos puede promover la angiogénesis, la reparación neural, la regeneración ósea y las respuestas antiinflamatorias. Más allá de sus funciones en la ingeniería de tejidos, los exosomas son cada vez más reconocidos como reguladores importantes en la oncogénesis y la terapia contra el cáncer, donde contribuyen a la remodelación del microambiente tumoral, la resistencia a fármacos y la evasión inmune⁶. Los exosomas derivados de las MSC, incluidos los de DPSC, poseen capacidades inherentes de localización tumoral y propiedades inmunomoduladoras, posicionándolos como vehículos prometedores de próxima generación para la administración dirigida de fármacos anticancerígenos o como agentes inmunoterapéuticos libres de células. Al eludir varias limitaciones asociadas a las terapias basadas en células, DPSC-Exos se ha consolidado como un prometedor componente bioactivo acelular para aplicaciones^{regenerativas} 7,8,9,10,11,12.

A pesar de estas ventajas, la traducción de la investigación DPSC-Exo a un uso experimental o clínico reproducible sigue siendo un reto. Una limitación importante es la falta de protocolos unificados y estandarizados para el aislamiento y purificación de exosomas. Los enfoques actualmente utilizados incluyen ultracentrifugación¹³, ultrafiltración, precipitación, cromatografía por exclusión de tamaño y captura de^{inmunoafinidad 14,15}. Entre estos métodos, la precipitación basada en polímeros ofrece ventajas prácticas, incluyendo alto rendimiento, compatibilidad con una amplia gama de volúmenes de muestras y simplicidad operativa, lo que la hace adecuada para estudios que implican grandes cantidades de muestras o requisitos de ampliación^{16, 17, 18}. Análisis comparativos de diferentes métodos de aislamiento, especialmente en lo relativo al rendimiento de proteínas y la relación partícula-proteína, han sido ampliamente documentados^{en la literatura 19}. Sin embargo, la influencia del número de pasadas de DPSC en las características y la actividad biológica de los exosomas derivados no ha sido suficientemente abordada, lo que representa una importante laguna para la estandarización y control de calidad de la producción de DPSC-Exo.

Para abordar estas limitaciones técnicas, este estudio presenta un protocolo estandarizado basado en kits para aislar y purificar exosomas de un medio condicionado por DPSC. Además de la caracterización física y molecular, el protocolo incorpora un ensayo funcional para evaluar la actividad antiinflamatoria de exosomas derivados de diferentes pasajes DPSC, permitiendo una evaluación comparativa de la consistencia dependiente del paso en la calidad y función de los exosomas. El flujo de trabajo está diseñado para una implementación sencilla en laboratorios equipados con instalaciones estándar de cultivo celular y biología molecular. Depende de kits comerciales para reducir la variabilidad interexperimental y puede escalarse fácilmente para adaptarse a diferentes necesidades experimentales. Para minimizar la variabilidad de donante a donante, los DPSC se aíslan de dientes individuales y se expanden de forma independiente en lugar de agruparse de varios donantes. Este protocolo es especialmente útil para investigadores que buscan generar exosomas derivados de DPSC validados funcionalmente para aplicaciones posteriores, incluyendo cicatrización de heridas, ingeniería de tejido óseo y estudios de inmunomodulación, donde la consistencia de lote a lote es esencial. En conjunto, proporciona un marco práctico y estandarizado para la producción de exosomas derivados de DPSC para su uso en la ingeniería de tejidos y la investigación en medicina regenerativa.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo conforme a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités de ética institucional. Los tejidos pulpares dentales humanos se obtuvieron de terceros molares desechados o premolares ortodóncicos recogidos en el Hospital de Estomatología de Ningbo, conforme a las directrices éticas institucionales (Protocolo nº NBKQYY2025LS-04; fecha de aprobación: 30 de mayo de 2025). Los tejidos cutáneos humanos se obtuvieron de muestras descartadas de prepucio recogidas durante procedimientos rutinarios de circuncisión en el Departamento de Urología del Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Ningbo, conforme a las directrices éticas institucionales (Protocolo nº 2024104; fecha de aprobación: 30 de octubre de 2024). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes o de sus tutores legales antes de la recogida de la muestra.

1. Aislamiento de exosomas derivados de células madre de la pulpa dental

1. Aislamiento, cultura e identificación de los DPSCs
   1. Recogida y transporte de muestras
      1. Recoger los terceros molares humanos intactos de donantes de 18 a 25 años o premolares de donantes de 12 a 16 años tras la extracción ortodóncia.
      2. Colocar inmediatamente los dientes extraídos en suero salino tamponado con fosfato preenfriado (PBS) suplementado con 100 U/mL de penicilina-G y 100 μg/mL de estreptomicina.
      3. Transportar muestras al laboratorio a 4 °C y procesar en un plazo de 6 horas desde la extracción.
   2. Exposición de la pulpa dental y disociación tisular
      1. Sumergir en etanol al 70% durante 30 s; lavar tres veces con 1× PBS que contenga 3% P/S (30 s cada uno). Retira cuidadosamente los tejidos gingivales y periodontales residuales de la superficie dental usando tijeras estériles o un bisturí.
      2. Envuelve el diente en gasas estérils y luego agrieta cuidadosamente la corona con un martillo esterilizado para exponer la cámara pulpa.
      3. Separa suavemente el tejido pulpar de la dentina, pícelo en pequeños fragmentos (<1 mm³) usando cuchillas quirúrgicas estériles.
      4. Transfiere los fragmentos de tejido a un tubo centrífugo de 1,5 mL que contiene una solución digestiva de 2,5 mg/mL de Dispasa II y 2,5 mg/mL de colagénasa tipo I.
      5. Incuba la mezcla en una incubadora a 37 °C durante 30–45 minutos con una agitación suave.
         NOTA: La duración de la digestión enzimática se determinó en función del volumen y grado de homogeneización del tejido pulpar dental.
   3. Terminación de la digestión y cultivo celular primario
      1. Detener la digestión enzimática añadiendo un volumen igual de Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%.
      2. Centrifuga la suspensión celular a 200 × g durante 5 minutos para pelletar las células y fragmentos de tejido.
      3. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo completo (α-MEM con 20% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina).
      4. Siembra las células y explantaciones resuspendidas en un plato de cultivo de 60 mm y añade el medio de cultivo completo a un volumen final de 5 mL.
      5. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂.
   4. Mantenimiento celular y subcultivo
      1. Renova el medio de cultivo cada 2–3 días.
      2. Monitoriza las células a diario.
         NOTA: Los DPSC primarios suelen migrar desde explantaciones de tejido y alcanzarán una confluencia del 80–90% en 7–14 días.
      3. Para la subcultura, desprende las células usando ácido tripsina-etilendidiamina (EDTA) al 0,05% cuando alcanzan una confluencia del 80–90%.
         PRECAUCIÓN: La tripsina es un irritante. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y gafas de seguridad.
      4. Las células del paso en una proporción de 1:3 usando el medio de cultivo completo (con 20% de FBS).
      5. Utiliza DPSCs en los pasajes 2, 4 y 6 para todos los ensayos de aislamiento y funcionalidad de exosomas aguas abajo.
   5. Caracterización de DPSC mediante citometría de flujo
      1. Desacoplar los DPSC en el paso deseado usando tripsina-EDTA al 0,05%, neutralizar con medio de cultivo completo y recoger la suspensión celular.
      2. Centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y descarta el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en PBS y cuenta las células. Ajusta la densidad celular a aproximadamente 1 × 10⁶ celdas/mL.
      3. Alicuota de 100 μL de la célula en suspensión en cada tubo de citometría de flujo. Incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 y CD14 con una dilución de 1:100 en PBS durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.
      4. Lava las pilas añadiendo 1 mL de PBS a cada tubo, seguido de centrifugación a 300 × g durante 5 minutos. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 300–500 μL de PBS para su análisis.
      5. Incluir anticuerpos de control isotípico apropiados en concentraciones iguales para cada fluorocromo para permitir la corrección de fondo y la gating.
      6. Analizar muestras utilizando un citómetro de flujo equipado con láseres y filtros adecuados para los fluorocromos seleccionados. Adquiere al menos 10.000 eventos por muestra.
      7. Realizar análisis de datos utilizando software de citometría de flujo. Primero, celdas viables por compuertas basadas en dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para excluir los residuos. Luego aplica la reja de suelta para eliminar dobletes.
      8. Determinar la expresión de marcadores comparando la intensidad de fluorescencia con los controles isotipo correspondientes para definir poblaciones positivas y negativas.
2. Aislamiento y purificación de DPSC-Exos
   1. Preparación del medio acondicionado
      1. Cultiva DPSCs en un plato de cultivo de 10 cm hasta alcanzar una confluencia del 70–80%.
      2. Retira el medio gastado y luego lava suavemente la monocapa de la célula dos veces con PBS precalentado.
      3. Añade 10 mL de medio completo complementado con un 10% de FBS agotado en exosomas.
      4. Incubar el cultivo a 37 °C hasta que la confluencia celular alcance el 90–100% (un proceso que suele superar las 24 horas).
   2. Colección de medios acondicionados
      NOTA: Mantén todos los pasos siguientes en hielo o a 4 °C.
      1. Transfiere el medio acondicionado a un tubo de centrífuga.
      2. Centrifuga el medio a 4 °C y 3.000 × g durante 10 minutos para eliminar las celdas y los restos grandes.
      3. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga sin alterar el perdigón.
      4. Centrifugar el sobrenadante a 4 °C y 10.000 × g durante 10 minutos para pelletar partículas más pequeñas y cuerpos apoptóticos.
      5. Filtra el sobrenadante a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm hasta un tubo de centrífuga limpio de 50 mL.
      6. Procesa el medio clarificado inmediatamente para aislamiento de exosomas, o alicuota, y guárdalo a -80 °C.
         NOTA: El medio acondicionado clarificado puede almacenarse a -80 °C durante varios meses. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
   3. Aislamiento de exosomas por precipitación basada en polímeros
      1. Descongela el medio acondicionado clarificado sobre hielo si estaba congelado.
      2. En un tubo estéril sobre hielo, combina el medio con una solución de concentración de exosomas en una relación de volumen 4:1 (por ejemplo, medio de 20 mL: solución de 5 mL). Haz un vórtice en la mezcla durante 1 minuto para asegurar la homogeneidad.
      3. Dejar la mezcla intacta a 4 °C durante 16–18 horas para permitir la precipitación de exosomas.
         NOTA: El tiempo de incubación puede extenderse adecuadamente para aumentar potencialmente el rendimiento, pero no debe superar las 24 horas.
      4. Centrifugar la mezcla a 4 °C y 10.000 × g durante 75–80 minutos para pelletar los exosomas. Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante sin alterar el pellet.
      5. Centrifuga el tubo de nuevo a 4 °C y 10.000 × g durante 2 minutos. Elimina cualquier sobrenadante residual con una pipeta.
      6. Resuspende el pellet del exosoma en 1x PBS (utiliza 200 μL de PBS por medio acondicionado de 20 mL).
      7. Transfiere la resuspensión a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mL y centrifuga a 4 °C y 12.000 × g durante 2 minutos, conservando el sobrenadante, que se enriquece con partículas de exosomas (repita si es necesario).
   4. Purificación de exosomas
      1. Aplicar la suspensión del exosoma a una columna de filtro de purificación de exosomas situada en un tubo de recogida.
      2. Centrifuga la columna a 4 °C y 3.000 × g durante 10 minutos.
      3. Recoge el líquido de paso del fondo del tubo de recogida. Este líquido contiene los exosomas purificados.
   5. Almacenamiento de exosomas purificados
      1. Alicuota, la suspensión purificada de exosomas en volúmenes de un solo uso, aptos para experimentos aguas abajo.
      2. Guarda las alicuotas a -80 °C.
         NOTA: La alicotización es fundamental para evitar ciclos repetidos de congelación y deshielo, que pueden degradar la integridad del exosoma y la actividad biológica.
   6. Caracterización e identificación de DPSC-Exo
      1. Realizar análisis morfológicos mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) tal y como se describe en los pasos 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Utiliza una pipeta, extrae 10 μL de la muestra preparada de suspensión del exosoma y déjala caer sobre Parafilm pre-preparado. Coloca la rejilla de cobre recubierta con formvar/carbono, con el lado de la película hacia abajo, sobre la gota, dejando que se adsorba de forma natural durante 10–15 minutos.
      3. Usa una tira de papel filtro para absorber el exceso de líquido y deja que se seque brevemente al aire.
      4. Usa una pipeta, extrae 10 μL de solución de ácido fosfotungstico al 2% y mételo sobre el Parafilm. Invierte la cuadrícula que ha completado el paso de adsorción para que su lado de la película se enfrente a la solución de tinción y déjala reposar entre 3 y 5 minutos.
      5. Utiliza una tira de papel filtro para absorber el exceso de líquido y deja que la rejilla se seque bajo una lámpara incandescente.
      6. Observa y captura imágenes usando un microscopio electrónico de transmisión.
      7. Realizar análisis de distribución de tamaño y concentración mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) como se describe en los pasos 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Enjuaga la cámara de muestra tres veces con agua ultrapura.
      9. Calibra el instrumento usando perlas estándar de poliestireno de 100 nm según las instrucciones del fabricante. Procede con las mediciones tras una calibración exitosa.
      10. Enjuaga la cámara de muestra con 1× PBS.
      11. Diluye la muestra del exosoma en 1× PBS (dilución 1:500) y cárgala en la cámara de muestra. Monitoriza el movimiento de partículas en tiempo real usando el software del instrumento.
      12. Recopila datos y genera el informe de análisis correspondiente.
      13. Identificar los marcadores proteicos mediante análisis de Western blot como se describe en los pasos 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Lisar muestras de exosomas usando un tampón de lisis proteico específico para exosomas y cuantificar la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
      15. Prepara geles de resolución y apilamiento. Carga cantidades iguales de proteína por vía y añade 5 μL de marcador proteico a cada gel.
      16. Realizar electroforesis a un voltaje constante de 80 V hasta que el frente del tinte alcance el gel de resolución, luego aumentar hasta 120 V y continuar hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
      17. Corta una membrana de polivinilideno fluoruro (PVDF) al tamaño adecuado y actívala remojándola en metanol durante 5 minutos.
      18. Prepara el tampón de transferencia compuesto por 25 mM de Tris base, 192 mM de glicina y metanol al 20% (v/v) (pH = 8,3). Equilibra todos los componentes de transferencia en el buffer de transferencia.
      19. Montar el sándwich de transferencia en el siguiente orden, desde cátodo hasta ánodo: esponja – papel filtro – gel – membrana PVDF – papel filtro – esponja. Elimina cualquier burbuja de aire y realiza transferencia de proteínas a una corriente constante de 300 mA.
      20. Después de la transferencia, enjuaga brevemente la membrana PVDF con suero salino con Tris-buffer y Tween20 al 0,1% (TBST) y bloquea con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente con agitaciones suaves.
      21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios (por ejemplo, anti-CD63 y anti-TSG101) diluidos en leche desnatada al 5% durante la noche a 4 °C con suaves agitaciones. Lava la membrana tres veces con TBST durante 5 minutos cada una.
      22. Incubar con el anticuerpo secundario adecuado a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de tres lavados con TBST (5 minutos cada uno).
      23. Preparar una nueva solución de trabajo por electroquimioluminiscencia (ECL) (mezclar las soluciones A y B en una proporción 1:1), aplicar a la membrana y detectar señales mediante un sistema de imagen quimioluminiscencia.

2. Aislamiento y cultivo de queratinocitos epidérmicos primarios de la piel humana

1. Recogida y transporte de muestras
   1. Obtén muestras de tejido del prepucio de donantes varones sanos en el Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Ningbo.
   2. Colocar inmediatamente el tejido extraído del prepucio en PBS de 4 °C suplementado con 100 U/mL de penicilina-G y 100 μg/mL de estreptomicina.
   3. Transportar muestras al laboratorio a 4 °C y procesar en un plazo de 6 horas.
2. Preparación aséptica y fragmentación de tejidos
   1. Sumerge el tejido en etanol al 70% durante 30 segundos a 3 minutos.
      NOTA: Ajusta el tiempo de inmersión en función del tamaño del tejido para la desinfección inicial.
   2. Utilizando tijeras estériles o un bisturí, disecciona y elimina la grasa subcutánea y el tejido conectivo de la muestra de tejido lavado.
   3. Pícalo en pequeños fragmentos (tamaño de fragmento <1^{mm 3}) usando cuchillas quirúrgicas estériles.
      NOTA: Picar 3–4 muestras de tejido suele requerir menos de 15 minutos. Añade una pequeña cantidad de PBS durante el picado si el tejido parece seco.
   4. Transfiere la suspensión de tejido picado a un tubo centrífugo de 50 mL que contiene una solución digestiva de 2,5 mg/mL de colagenosa tipo I y 2,5 mg/mL de dispasa II. Añade entre 10 y 20 mL de solución digestiva por cada pieza de tejido picado.
   5. Incuba la mezcla en una incubadora a 37 °C durante 60 minutos. Mantén una agitación suave a 80 × g, o agita vigorosamente el tubo con la mano cada 20 minutos.
3. Digestión secundaria y tratamiento de la DNasa
   1. Añade 0,25% de tripsina-EDTA a la mezcla digestiva en una proporción de volumen 1:5. Incuba la sonda a 37 °C durante 25 minutos con una agitación suave.
      PRECAUCIÓN: La tripsina es un irritante. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y gafas de seguridad.
   2. Añadir solución de DNasa I (10 mg/mL) a la mezcla con una relación de 10 μL por mL del volumen total de digestión. Incuba a 37 °C durante 5 minutos con agitación suave.
4. Terminación de la digestión y cultivo celular primario
   1. Detén la digestión enzimática añadiendo un volumen igual de DMEM suplementado con un 10% de FBS.
   2. Tritura la mezcla a fondo pipeteando arriba y abajo aproximadamente 20 veces para disociar los fragmentos de tejido. Filtra la suspensión de la celda a través de un colador de celda de 100 μm hasta un nuevo tubo centrífugo de 50 mL.
   3. Centrifuga la suspensión celular a 200 × g durante 5 minutos para pelletar las células y fragmentos de tejido.
   4. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo completo (α-MEM con 20% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina).
   5. Siembra las células y explantas resuspendidas en un plato de cultivo de 10 cm y añade el medio de cultivo completo a un volumen final de 6 mL.
   6. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂.
      NOTA: Suplementar los cultivos de queratinocitos con Y-27632 a una concentración final de 5 μM durante el cultivo.
5. Mantenimiento celular y subcultivo
   1. Renova el medio de cultivo cada 2–3 días.
   2. Monitoriza las células a diario.
      NOTA: Los queratinocitos epidérmicos primarios de la piel suelen migrar desde explantaciones tisulares y alcanzarán una confluencia del 80-90% en 10-14 días.
   3. Para la subcultura, desprende las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando alcanzan una confluencia del 80–90%.
      PRECAUCIÓN: La tripsina es un irritante. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y gafas de seguridad.

3. Verificación funcional de la función antiinflamatoria de exosomas de diferentes conductos

1. Siembra y preparación de células
   1. Sembra queratinocitos epidérmicos a una densidad de 1,5 × 10⁵ células por pozo en una placa de 12 pozos. Añade 1 mL de medio completo a cada pozo y cultiva las células durante 24 horas.
   2. Cuando la confluencia celular alcanza aproximadamente el 70%, aspira cuidadosamente el medio y lava suavemente la monocapa celular dos veces con 1× PBS precalentado.
2. Estimulación inflamatoria y tratamiento con exosomas
   1. Inducir un modelo celular psoriasiforme, estimular las células con la mezcla proinflamatoria de citocinas "M5" (que contiene IL-1α, IL-17A, IL-22, oncostatina M y TNF-α, cada una a una concentración final de 10 ng/mL).
   2. Para los grupos de tratamiento, coincubar las células estimuladas con DPSC-Exos (50 μg por pozo).
   3. Para el grupo control negativo (NC), añade un volumen equivalente de PBS en lugar de exosomas.
      NOTA: Realizar todas las estimulaciones y tratamientos en un medio desprovisto de Y-27632 para evitar su posible interferencia con las vías de señalización inflamatoria.
3. Recogida de muestras y análisis qRT-PCR (comparación funcional entre pasajes)
   1. Extrae las células y extrae ARN tras 24 horas de tratamiento.
   2. Analizar la expresión del marcador inflamatorio clave IL-23A.
      1. Comparar los efectos inhibitorios sobre la expresión de IL-23A entre grupos de tratamiento con exosomas derivados de diferentes conductos (P2, P4 y P6) utilizando qRT-PCR para evaluar los cambios dependientes del conducto en la función del exosoma.
      2. Realizar qRT-PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s.
      3. Realizar un análisis de curva de fusión de 65 °C a 95 °C para confirmar la especificidad de amplificación.
         NOTA: Secuencias cebadoras: Humano-IL-23A (adelante: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAC-3', reversa: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); Humano-H36B4 (adelante: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3', reversa: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Resultados

Identificación y caracterización de células madre de la pulpa dental
Las células madre primarias de la pulpa dental (DPSC) aisladas mediante el protocolo descrito mostraron un crecimiento estable y una morfología mesenquimatosa típica durante la expansión in vitro. Como se muestra en la Figura 1, las DPSC en los pasajes 2, 4 y 6 mostraron una población homogénea de células con forma de fuso, similares a fibrob...

Discusión

El protocolo estandarizado descrito en este estudio proporciona un marco reproducible para el aislamiento de células madre pulpares dentales (DPSCs), la producción de exosomas derivados de DPSC (DPSC-Exos) y la validación funcional de estas vesículas a través de múltiples conductos celulares. La siguiente discusión destaca consideraciones procedimentales críticas, estrategias de optimización, limitaciones metodológicas y la relevancia más amplia de este flujo de trabajo para la investiga...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25300054	Debido a su fuerza digestiva, la tripsina se usa ampliamente para disociación celular, pasaje de cultivo celular de rutina y disociación de tejidos primarios.
100 mm Cell and Tissue Culture Dish	Biofil	TCD010100	Tratamiento superficial/No tratado Estéril & No Pirogénico Libre de DNase/RNase
100 nm PS beads	Thermo Fisher	3100A	Antes de realizar experimentos de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), el instrumento debe calibrarse utilizando un estándar con un tamaño de partícula conocido con precisión (100 nm).
15-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2611	Estéril, libre de RNase/Dnase y pirógenos
200-mesh Formvar-carbon-coated copper grid	Zhongjing Scientific Instruments	AZH200	Apoya muestras de exosomas para imágenes TEM. El recubrimiento de Formvar-carbon mejora la adhesión y conductividad de la muestra, mientras que la rejilla de 200 mallas proporciona un área abierta adecuada para una distribución uniforme de partículas e imágenes estables.
37 °C Incubator	Thermo Scientific	51032877	El incubador de CO2 a 37 grados proporciona un entorno ideal in vitro.
50-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2811	Estéril, libre de RNase/Dnase y pirógenos
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5] (ab193349) es un anticuerpo monoclonal de ratón que detecta CD63 en Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Apto para Humano.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] (ab125011) es un anticuerpo monoclonal de conejo que detecta TSG101 en Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Apto para Humano, Ratón, Rata.
Automated cell counter	Countstar	IC1000	Contador de células automático para un recuento rápido y preciso de células
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	Tiene una buena relación lineal dentro del rango de concentración de 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop Centrifuge	BIORIDGE	TD5	Centrífuga de sobremesa para la separación rápida y eficiente de muestras en entornos de laboratorio
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1379	El Gabinete de Seguridad Biológica es un dispositivo de contención estéril que protege a los operadores, muestras y entornos de los biopeligros al filtrar los patógenos aerotransportados y prevenir la contaminación cruzada durante el trabajo microbiológico.
Cell Culture Plate,12-Well	Eppendorf	0030721110	Tratado para cultivo de tejidos,con tapa, fondo plano Estéril, libre de pirógenos detectables, RNase & DNase, ADN humano & bacteriano No citotóxico
Cell Culture Plate,96-Well	NEST	701001 0714B	Tratado para Cultivo de Tejidos, Poliestireno, No Pirogénico, Estéril
Cellsaving	NCM	C40100	Libre de suero, libre de proteína animal Medio de Congelación Celular
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100017	La colagenasa es una proteasa que escinde el enlace entre un aminoácido neutro (X) y la glicina en la secuencia Pro-X-Gly-Pro, que se encuentra con alta frecuencia en el colágeno.
Dispase II, powder	Gibco	17105041	Dispase II (proteasa neutra) es una amino-endo peptidasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminales de los residuos de aminoácidos no polares.
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT	[+]4.5g/L D-Glucosa [+]L-Glutamina [+]110mg/L Sodio Piruvato
Evo M-MLV Reverse Transcription Kit	AG	AG11707	Un reactivo de transcripción reversa dedicado para RT-PCR en tiempo real. Utiliza la transcriptasa reversa Evo M-MLV con fuerte capacidad de extensión, permitiendo una síntesis eficiente de cDNA en un corto período de tiempo.
Exosome Concentration Solution	Umibio	UR52111	Extraer exosomas del sobrenadante celular
Exosome Depleted Fetal Bovine Serum	Umibio	UR50202	El suero fetal bovino libre de exosomas se obtuvo mediante la filtración del suero fetal bovino estéril recolectado, y se eliminaron ≥99% de los exosomas endógenos en el suero fetal bovino. Tenía la misma tasa de crecimiento celular y morfología que el suero fetal bovino antes del procesamiento.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141	Nivel de hemoglobina: ≤30 mg/dL (niveles rutinariamente ≤25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Forward: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; Reverse: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Forward: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Reverse: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Inverted Biological Microscope	Leica	DMI1	Observar directamente las células o tejidos vivos que se adhieren a las paredes de recipientes como matraces de cultivo y placas de petri.
Minimum Essential Medium	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamina [+]Ribonucleósidos [+]Desoxirribonucleósidos
NcmSpin Rapid RNA Extraction Kit	NCM	M5106	Este kit puede extraer rápidamente ARN total de hasta 3.000.000 de células y hasta 10 mg de tejido.
Penicillin-Streptomycin	NCM	C100C5	Contiene 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 microgramos/ml de estreptomicina. Ha sido filtrado para eliminar bacterias y se puede usar directamente para cultivo celular. Previene eficazmente la contaminación bacteriana de las células.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	Trans