Detección de hormonas sexuales en película lagrimalial humana mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Resumen

Este protocolo describe un método optimizado de ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) para detectar y cuantificar el 17β-estradiol y la testosterona en el líquido lacrimal humano recogido a través de tubos microcapilares. Este enfoque permite medir de forma mínimamente invasiva los niveles de hormona lacrimal.

Resumen

La película lagrimal es un fluido complejo y multicapa, esencial para mantener la salud de la superficie ocular, la claridad visual y la protección frente a patógenos y factores de estrés ambiental. Compuesto principalmente por lípidos, líquido acuoso, proteínas solubles y mucinas, sirve no solo para lubricar y proteger el ojo, sino también como un valioso medio diagnóstico para trastornos de la superficie ocular como la enfermedad ocular seca (DED). Se sabe que las hormonas sexuales, incluidos andrógenos y estrógenos, influyen en la composición de la película lagrimal, pero la medición de estas hormonas en el líquido lacrimal está limitada por el bajo volumen de muestras y desafíos técnicos. Este protocolo describe un método paso a paso para adaptar kits de ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) disponibles comercialmente para detectar y cuantificar 17β-estradiol y testosterona en desgarros basales recogidos mediante tubos microcapilares. El flujo de trabajo incorpora estrategias optimizadas de recogida, dilución y preparación de ensayos para permitir el análisis de muestras de lágrimas de bajo volumen. El protocolo demuestra la viabilidad y reproducibilidad de la detección hormonal en fluido lacrimal utilizando métodos adaptados de ELISA. Los resultados representativos se obtienen a partir de muestras piloto agrupadas y están destinados a ilustrar el rendimiento del ensayo más que diferencias biológicas. Este enfoque podría apoyar futuros estudios que investiguen el fluido lagrimal como matriz para la medición hormonal en la investigación de la superficie ocular.

Introducción

La película lagrimal desempeña funciones vitales en la protección, nutrición y lubricación de la superficie^{ocular 1}. Tiene un grosor aproximado de 2–5,5 μm y un volumen de 3–10 μL, con una tasa de recambio de 1–2 μL por minuto en un ojo^{sano de 2,3}. Las glándulas lagrimales secretan el componente acuoso de las lágrimas, rico en agua, electrolitos, proteínas y factores antimicrobianos, mientras que las glándulas de Meibomio producen lípidos que ralentizan la evaporación de la película lagrimal, y las células conjuntivales liberan mucinas que sostienen la lubricación de la superficie^{ocular 4}. La producción de lágrimas ocurre de dos formas principales: 1) secreción basal, que mantiene una película lagrimal estable en una superficie ocular sana, y 2) secreción refleja, que se activa por estímulos como irritación, emoción o luces brillantes. La composición bioquímica varía entre ambas, lo que puede influir en última instancia en el método utilizado para recoger las lágrimas y^{analizarlas 5,6}. Las lágrimas basales generalmente contienen concentraciones más altas de proteínas y lípidos que favorecen la estabilidad de la película lagrimal y la salud corneal, mientras que las lágrimas reflejas tienden a tener un mayor volumen acuoso y se diluyen más para eliminar irritantes y proteger la superficie ocular ^7,8,9.

Debido a que las lágrimas funcionan para modular la inflamación, defenderse contra patógenos y suministrar nutrientes a la córnea^{avascular 1}, se han convertido en un punto focal para la investigación de^{biomarcadores 10}. Las lágrimas ofrecen una alternativa mínimamente invasiva y relativamente rentable a la toma de muestras de sangre para monitorizar los cambios fisiológicos, especialmente aquellos que ocurren cerca del lugar de la enfermedad⁸. Para capturar estos datos con precisión, una recogida adecuada es^{esencial 10}. Los tubos microcapilares de vidrio se utilizan ampliamente para muestrear desgarros basales porque permiten su recogida con mínima irritación y dilución de^{lágrimas 5}. Este método minimiza el riesgo de estimular el desgarro reflejo, que puede alterar la composición del^{desgarro 9,11}, posicionando cuidadosamente el tubo para evitar el contacto con la conjuntiva bulbar y el margen del párpado. Con este enfoque, los investigadores pueden obtener desgarros basales sin diluir que reflejan el estado fisiológico de la superficie ocular. Esto garantiza que la muestra siga siendo un medio fiable para cuantificar analitos sensibles, como las hormonas^{sexuales 10,12}. Sin embargo, el volumen limitado obtenido presenta desafíos analíticos para los ensayos bioquímicos posteriores. La recogida de lágrimas basales mediante tubos microcapilares suele arrojar unos pocos microlitros por muestra, lo que limita la compatibilidad con ensayos estándar.

La superficie ocular humana se reconoce cada vez más como tejido objetivo de las hormonas^{sexuales 13,14}. La evidencia que respalda esto incluye la detección de transcritos de ARNm para receptores de andrógenos (RA), receptores de estrógeno (RE) y receptores de progesterona (PR) en células acinas de las glándulas lagrimales y de Meibomio, así como en las células epiteliales de la córnea, la conjuntiva y las células del cáliz^{conjuntival 15}. Además, se han identificado ARNm que codifican enzimas esteroidogénicas en estos tejidos, lo que sugiere la capacidad de convertir precursores de esteroides en hormonas sexuales biológicamente activas^localmente. Esto indica un potencial de síntesis hormonal in situ en la superficie ocular y plantea una cuestión crítica sobre si estas hormonas se secretan en la película lagrimal en niveles detectables.

La evidencia actual sugiere que las hormonas sexuales son fundamentales para mantener la homeostasis de la superficie ocular, aunque los mecanismos moleculares precisos siguen siendo^{investigados 13,14}. Los andrógenos, como la testosterona, parecen estimular la secreción de lípidos y suprimir la inflamación; En consecuencia, la deficiencia de andrógenos es ampliamente reconocida como un factor que causa la sequedad ocular^evaporativa 13,14,17. En cambio, el papel de los estrógenos es más matizado y depende del^contexto 13,14,18. Aunque están implicadas en la modulación de la composición y volumen de las lágrimas, las fluctuaciones de estrógeno, como las que ocurren durante la menopausia, el embarazo o el uso de anticonceptivos orales, se asocian frecuentemente con secreción acuosa comprometida, disminución de la estabilidad de la película lagrimal e inflamación de la superficie^{ocular 19,20}. Como resultado, las personas que experimentan estos desequilibrios hormonales representan una población con mayor riesgo de desarrollar enfermedad ocular seca (DED⁾13,14,20.

A pesar de esta evidencia, monitorizar el estado hormonal en pacientes con TEM sigue siendo un desafío. Específicamente, aún no se ha establecido si los niveles sistémicos de hormonas séricas reflejan con precisión los niveles hormonales locales en el^{ojo 21}. Esta distinción es fundamental porque se ha demostrado que los tejidos de la superficie ocular poseen receptores hormonales sexuales y expresión enzimática esteroidogénica que apoyan la síntesis local y el metabolismo de los esteroides^{sexuales 16}. Esta capacidad intracrina sugiere que las concentraciones hormonales locales en la película lagrimal pueden diferir significativamente de los niveles^{séricos circulantes 13}. Por lo tanto, es necesario medir directamente la concentración hormonal en el líquido lacrimal para comprender mejor los efectos hormonales locales en la superficie ocular. Sin embargo, estas medidas son técnicamente complicadas debido al pequeño volumen de muestras de lágrimas disponibles para su análisis. Se han utilizado técnicas analíticas avanzadas como la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para cuantificar hormonas en sangre y fluidos lagrimales con alta sensibilidad, pero este método requiere instrumentación especializada y conocimientos técnicos que pueden no ser fácilmente accesibles para todos los^{investigadores 21,22}.

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una técnica ampliamente establecida para la detección y cuantificación de proteínas, anticuerpos y hormonas. Para el análisis de moléculas pequeñas como los esteroides sexuales, este protocolo utiliza un formato de unión competitivo. En este método, la hormona no marcada presente en la muestra de lágrima compite con un análogo hormonal marcado con enzimas por un número limitado de sitios de unión a anticuerpos. Debido a esta competencia, la intensidad de la señal, medida como densidad óptica, es inversamente proporcional a la concentración de la hormona en la muestra; Efectivamente, una señal más baja indica una mayor concentración de la hormona objetivo^23,24.

ELISA ofrece varias ventajas prácticas para la cuantificación dirigida. Es rentable y técnicamente accesible, permitiendo su implementación en entornos estándar de laboratorio sin necesidad de instrumentación especializada. Además, ELISA facilita el cribado de alto rendimiento en formatos de plancha de 96 pozos con una preparación mínima de la muestra, ofreciendo tanto eficiencia en tiempo como alta^{reproducibilidad 23}. Sin embargo, los kits ELISA comercialmente disponibles suelen estar optimizados para muestras biológicas de mayor volumen, como suero o plasma, y su rendimiento en muestras de lágrima de bajo volumen no está bien definido. Para abordar esta limitación, el protocolo incorpora estrategias optimizadas de dilución y manipulación de muestras para permitir la detección hormonal dentro del rango de sensibilidad del ensayo.

En este estudio, presentamos un protocolo visualizado que adapta kits ELISA disponibles comercialmente para la detección y cuantificación de 17β-estradiol y testosterona en muestras de lágrimas humanas de bajo volumen recogidas utilizando tubos microcapilares de vidrio. Este protocolo enfatiza modificaciones prácticas en la recogida, manejo y preparación de muestras para permitir la medición de hormonas reproducibles a partir de volúmenes lagrimales limitados. Este trabajo se centra en establecer un flujo de trabajo viable para aplicar la metodología ELISA existente al análisis de fluidos desgarrados. Este enfoque podría servir como base para futuros estudios que investiguen los niveles hormonales locales en la superficie ocular.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Indiana (IRB#1908362633), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recogida de la muestra.

1. Colección de películas lacrimógenas

1. Preparación
   1. Determina el volumen de desgarro a recoger, teniendo en cuenta que se necesitan 2 réplicas para la fiabilidad estadística de los resultados de ELISA.
   2. Prepara un tubo microcentrífuga de 1,5 mL para almacenar película lagrimal.
   3. Selecciona tubos microcapilares adecuados para recoger las lágrimas. Recomiendo empezar con 3,33 μL o 5 μL y cambiar a un tamaño más pequeño si se recoge de un volumen menor de desgarros en la superficie ocular.
   4. Prepara una bombilla de presión de goma incluida con el kit de tubos microcapilares, para facilitar la transferencia del líquido lacrimal a un tubo microcentrífuga.
2. Colección de lágrimas
   1. Indica al jugador que mire directamente al frente o ligeramente hacia arriba.
   2. Coloca suavemente la abertura del tubo microcapilar en el menisco de desgarro cerca del canto lateral para recoger las roturas basales.
   3. Minimiza el contacto con la conjuntiva bulbar y el margen del párpado para evitar el desgarro reflejo tanto como sea posible.
   4. Llena el tubo con desgarros hasta que esté lleno.
   5. Si se necesitan varias sesiones de recogida, programar sesiones con un plazo de 24 horas y en horarios similares durante el día para minimizar la variabilidad de los niveles hormonales.
3. Almacenamiento de lágrimas
   1. Ocluye el orificio en la parte superior de la lámpada de presión de goma y luego inserta el tubo microcapilar en la lámpada mientras colocas el extremo abierto dentro del tubo de la microcentrífuga para que las lágrimas fluyan por el tubo microcapilar. Puede ser necesario apretar más el bulbo para extraer la mayor cantidad posible de la muestra de lágrima del tubo microcapilar.
   2. Cierra la tapa del tubo de la microcentrífuga para evitar la evaporación.
   3. Centrifuga el tubo usando un microcentrífuga de mesa a 2.000 × g. durante 3–5 segundos para dejar la muestra en el fondo del tubo antes del almacenamiento.
   4. Almacene a -80 °C para preservar la estabilidad del analito antes del análisis.

2. Ensayo de testosterona

1. Prepara los estándares de testosterona, sigue el protocolo
   1. Sigue el protocolo del kit, asegúrate de que dispongan de reactivos y equipos para preparar los estándares, controles y muestras de testosterona.
   2. Reconstituye el estándar de testosterona con agua desionizada o destilada para obtener una solución estándar de 100 ng/mL. Asegúrate de una reconstitución completa y deja reposar un mínimo de 15 minutos.
   3. Prepara la testosterona estándar el día de la prueba.
   4. Preparar 6 tubos de microcentrífuga para el estándar, con 900 μL de diluyente calibrador en el tubo de 10 ng/mL y 400 μL en los tubos restantes.
   5. Pipete 100 μL de solución de base en el primer tubo (tubo de 10 ng/mL), mezcla bien y cambia la punta de la pipeta para la siguiente transferencia.
   6. Pipete 200 μL del primer tubo (tubo de 10 ng/mL) en el siguiente tubo (3,33 ng/mL), mezcla bien, cambia la punta de la pipeta para la siguiente transferencia y repite el paso hasta el último tubo (0,041 ng/mL).
   7. Nota: Tras completar todos los pasos, debería haber 7 concentraciones de estándares. El diluyente calibrador actúa como estándar cero (0 ng/mL). Cada estándar preparado es más que suficiente para dos replicaciones.
2. Prepara controles de testosterona: Baja, Media y Alta concentración
   1. Reconstituye cada vial con el volumen de agua desionizada o destilada indicado en el certificado de análisis (COA) del kit de control
   2. Diluye cada control en 2 veces en el diluyente calibrador antes de usarlo en el ensayo
3. Prepara muestras
   1. Retira muestras de lágrimas a -80 °C y colócalas sobre hielo para que se descongelen.
   2. Una vez que las muestras están completamente descongeladas, centrifuga brevemente las muestras de lágrimas para asegurarse de que todas estén en el fondo de los tubos a temperatura ambiente durante 3–5 segundos.
   3. Mezcla 20 μL de muestra con 80 μL de diluyente calibrador para obtener un volumen total de 100 μL por replicado.
   4. Planificar dos réplicas para el experimento para la fiabilidad y pozos de unión no específica (NSB) para el control en segundo plano.
   5. Nota: Cada muestra se analiza en pozos duplicados. Por lo tanto, se requieren 40 μL de muestra de lágrima por participante para realizar el ensayo, mezclando con 160 μL de diluyente calibrador para obtener un volumen total de 200 μL.
4. Procedimiento de ensayo
   1. Prepara todos los reactivos, estándares de funcionamiento, muestras de desgarro y controles de control.
   2. Retira los pozos sobrantes del marco de la microplaca y revuélvelos en el paquete desecante a 4 °C.
   3. Añadir 50 μL de Solución Primaria de Anticuerpos (de color azul) a cada pozo, excluyendo los pozos designados para pozos NSB. Cubre la placa con papel de aluminio.
   4. Incuba la placa a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplaca orbital horizontal (órbita de 0,12") ajustado a 500 ± 50 rpm o en la configuración más cercana disponible.
   5. Prepara suficiente tampón de lavado para un total de 8 lavados, 400 μL/pozo/lavado (4 lavados antes y 4 lavados después del paso de incubación de 3 horas).
   6. Aspira el contenido de cada pozo y lava la placa 4 veces con un tampón de lavado.
   7. Añadir 100 μL de diluyente calibrador a los pozos NSB y cero pozos estándar.
   8. Añadir 100 μL de muestras de desgarro estándar, control y preparadas a los pozos designados.
   9. Añade 50 μL de conjugado de testosterona a cada pozo y mezcla bien pipeteando.
   10. Incubar a temperatura ambiente durante 3 horas en un microplacas orbital horizontal (órbita de 0,12") ajustado a 500 ± 50 rpm o en la configuración más cercana disponible.
   11. Aspira cada pozo y lávate 4 veces usando un tampón de lavado.
   12. Prepara la solución del sustrato inmediatamente antes de usarla mezclando el Reactivo de Color A y el Reactivo de Color B en una proporción 1:1. Asigna 200 μL por pozo. Aspiración completa del tampón residual de lavado antes de añadir el sustrato.
   13. Añade 200 μL de solución de sustrato a cada pozo en un plazo de 15 minutos después de la preparación. Incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la encimera. Protege de la luz cubriéndolo con papel de aluminio.
   14. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pozo en el mismo orden que para la solución de sustrato. Mezcla bien cada pozo y el color debería cambiar de azul a amarillo.
   15. Mide la densidad óptica a 450 nm y 560 nm en un plazo de 30 minutos tras añadir la solución de parada usando un lector de microplacas.
   16. Nota: Las instrucciones del fabricante recomiendan una longitud de onda de referencia de 540 nm o 570 nm. En este protocolo, se utilizaba una longitud de onda de 560 nm como la opción más cercana disponible en el lector de microplacas, para la corrección de señales de fondo e imperfecciones ópticas.
5. Cálculo
   1. Se resta la densidad óptica medida en 560 nm (longitud de onda de referencia) de la densidad óptica medida en 450 nm.
   2. Resta la densidad óptica media NSB de cada lectura individual de estándares, muestras y controles, y luego calcula la media de mediciones duplicadas.
   3. Genera una curva estándar ajustando los datos usando un modelo logístico de cuatro parámetros (4PL).
   4. Determina las concentraciones de testosterona interpolando los valores de las muestras a partir de la curva estándar.
   5. Ajusta las concentraciones calculadas aplicando un factor de dilución de 5 para tener en cuenta la dilución de la muestra 1:5.
   6. Verifica la medición calculando el coeficiente de variación (CV) entre réplicas que no debe superar el 20%.
      1. Nota: %CV = (D/media) × 100

3. Ensayo de estradiol

1. Preparar estándares, controles y muestras de estradiol
   1. Sigue el protocolo del kit, asegúrate de que haya reactivos y equipos disponibles para preparar estándares, controles y muestras.
   2. Deja que todos los reactivos y materiales alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
   3. Prepara un reactivo fresco el día del experimento.
   4. Los estándares y el control están listos para usar. Solo la cantidad requerida para el ensayo actual para minimizar la contaminación y limitar los cambios repetidos de temperatura durante la manipulación.
   5. Asegúrese de que se preparen seis estándares (nº 0–5), siendo el estándar 0 0 pg/mL, e incluya una muestra de control proporcionada con el kit.
   6. Descongela las muestras congeladas de -80 °C poniéndolas en hielo.
   7. Centrifuga las muestras de desgarro para asegurarte de que todas están en el fondo del tubo.
2. Procedimiento de ensayo
   1. Retira los pozos sobrantes de la microplaca y revuélvelos en el paquete desecante a 4 °C.
   2. Añadir 20 μL de estándares, controles y muestras en los pozos.
   3. Nota: cada estándar y muestra debe analizarse con 2 réplicas.
   4. Para asegurar una distribución homogénea, mezcla cuidadosamente todos los estándares, controles y muestras inmediatamente antes de pipetear en los pozos.
   5. Añadir 160 μL de 17 beta-estradiol-HRP conjugado en los pozos de prueba.
   6. Deja un pozo en blanco para el sustrato.
   7. Cubre el pozo con papel de aluminio antes de meterlo en la incubadora. La solución en los pozos puede evaporarse hacia el papel de aluminio.
   8. Incuba a 37 °C durante 2 horas.
   9. Prepara el Wash Buffer con la solución de lavado 10X durante el tiempo de incubación.
   10. Cuando la incubación termine, se retira el papel de aluminio y se aspira el líquido de los pozos.
   11. Lava cada pozo 3 veces con Wash Buffer. Remojad > 5 segundos en cada ciclo de lavado.
   12. Añade 100 μL de solución de sustrato TMB en todos los pozos.
   13. Cubre toda la placa con papel de aluminio y incuba a temperatura ambiente durante exactamente 30 minutos.
   14. Añadir 100 μL de solución de parada en todos los pozos en el mismo orden y a la misma velocidad que la solución de sustrato TMB añadida anteriormente.
   15. Agita suavemente la microplaca y el reactivo cambia de azul a amarillo.
   16. Mide la absorbancia a 450 nm en los 30 minutos siguientes a la aplicación de la solución de parada.
3. Cálculo
   1. Resta la absorción del pozo en blanco de las lecturas de todos los estándares, muestras y controles para corregir las imperfecciones de la señal de fondo y ópticas.
   2. Calcula la media de las mediciones duplicadas.
   3. Genera una curva estándar de mejor ajuste usando la logística de cuatro parámetros (4PL).
   4. Determinar la concentración de estradiol interpolando los valores de las muestras de la curva estándar...
   5. Verifica la medición calculando el coeficiente de variación (CV) entre réplicas que no debe superar el 20%.
      1. Nota: %CV = (SD/media) × 100.

4. Análisis de datos usando R y RStudio

1. Instala R y RStudio, e instala los paquetes requeridos que aparecen en la Tabla de Materiales antes de realizar el análisis de datos.
2. Importar mediciones de densidad óptica para estándares, controles y muestras en el software de análisis.
3. Preprocesar los datos aplicando una corrección de longitud de onda según lo especificado por el ensayo. Luego restar valores en blanco o NSB y calcular la media de mediciones duplicadas.
4. Ajusta una curva estándar usando un modelo de regresión logística de cuatro parámetros (4PL) con concentración como variable independiente y densidad óptica como variable de respuesta.
5. Realizar ajuste de curvas en R usando la función drm() del paquete drc, con el modelo especificado como fct = LL.4() para regresión 4PL, con datos de concentración y densidad óptica como entrada.
6. Verifica la calidad del ajuste de la curva (por ejemplo, R² > 0,99 o la bondad aceptable) antes de interpretar las concentraciones de la muestra.
7. Calcular las concentraciones hormonales mediante la predicción inversa utilizando la función ED() basada en la curva estándar ajustada, especificando la dosis efectiva correspondiente a los valores de densidad óptica muestreados según el modelo ajustado.
8. Ajusta las concentraciones calculadas aplicando el factor de dilución adecuado (por ejemplo, ×5 para una dilución 1:5).
9. Informa de las concentraciones hormonales finales en las unidades adecuadas (por ejemplo, ng/mL o pg/mL), asegurando la coherencia con la curva estándar, y exporta los datos procesados para su análisis o visualización posterior.

Resultados

Estudio piloto de película de lágrimas

En total se incluyeron 20 mujeres (de 45 a 63 años) en este estudio. La clasificación de DED se basó en síntomas y al menos un signo clínico de DED. Específicamente, todos los participantes con DED tenían una puntuación en el Índice de Enfermedad de la Superficie Ocular (OSDI) > 12 y al menos un ojo con un tiempo de ruptura de la lágrima de fluoresceína (TBUT) de < 5 s o puntuación de tinción con fluoresc...

Discusión

La recogida y análisis de lágrimas permiten un fácil acceso para la evaluación científica de la salud de la superficie ocular y la identificación de posibles biomarcadores^10,22. Nuestro protocolo describe la adaptación exitosa de métodos ELISA comúnmente utilizados para analizar muestras de película lagrimal para hormonas sexuales. Desarrollamos este método para abordar la limitación principal del análisis de desgarros, el volume...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Hoja de aluminio	Reynolds Wrap	10900000154	Cualquier hoja de aluminio disponible para la cocina para proteger los reactivos de la luz
Tubo microcapilar 3.33 μL	Drummond	1-000-0033	Incluye una pera de presión para la transferencia de fluidos
Tubo microcapilar 5 μL	Drummond	1-000-0050	Incluye una pera de presión para la transferencia de fluidos
Dispositivo de microcentrífuga	Benchmark Scientific	C1012
Tubo de microcentrífuga de 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Lector de microplacas	Promega	GM3000
Agitador orbital de microplacas	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
Lenguaje de computación R	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)	R versión 4.5.1	Descargar el lenguaje R antes de Rstudio a través de https://cran.r-project.org/
Software RStudio	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
Paquetes de R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)		Instalar el paquete en Rstudio
Kit de control de testosterona	R&D Parameter	QC165	Se vende por separado del kit ELISA (KGE010)
Kit ELISA de testosterona	R&D Parameter	KGE010