Un modelo integral de ratas para evaluar las vías de transporte hepático mediante muestreo simultáneo de vasculedades linfáticas y hematobacterias

Resumen

Este protocolo experimental describe un modelo de rata canalizada por conducto linfático hepático que permite una evaluación directa y cuantitativa del drenaje linfático y vascular hepático. El modelo permite el muestreo simultáneo de sangre linfa hepática y sistémica para investigar el transporte hepático, el metabolismo y la señalización inmunitaria, apoyando estudios de farmacocinética de fármacos y biología específica del hígado.

Resumen

El hígado es un centro metabólico e inmunológico que procesa nutrientes, xenobióticos y mediadores inmunitarios circulantes. Las sustancias llegan a los hepatocitos y otras células hepáticas a través de los capilares sinusoidales que reciben sangre del intestino a través de la vena porta y de la circulación sistémica a través de la arteria hepática. El filtrado plasmático de los capilares sinusoidales drena al espacio de Disse, donde puede sufrir una transformación metabólica, participar en la vigilancia inmunitaria o fluir hacia los vasos linfáticos para formar linfa hepática. La toma de muestras de linfa hepática y sangre puede ayudar a permitir un análisis detallado del transporte hepático, los procesos metabólicos y la actividad inmunitaria. Se describe un modelo quirúrgico de rata que permite muestrear simultáneamente el flujo linfático hepático y la sangre sistémica a través de tres sitios de canulación distintos: conducto linfático hepático, arteria carótida y vena yugular. Las canuladuras linfáticas y arteriales hepáticas permiten la toma continua de muestreos, mientras que la cánula de la vena yugular puede utilizarse para la hidratación continua y el soporte de líquidos o para la recogida venosa, permitiendo la comparación entre sangre arterial y venosa. La canulación exitosa produce tasas de flujo linfático hepático de aproximadamente 0,1 mL/h en ratas anestesiadas, lo que permite muestreo linfático continuo de hasta 8 horas mientras se realiza una toma de sangre arterial y venosa simultáneamente. Este sistema permite la comparación directa entre la sangre arterial sistémica y la salida linfática hepática, facilitando un examen exhaustivo del transporte y eliminación hepática, así como de los procesos metabólicos y de señalización inmunitaria. Para ampliar aún más el modelo, al final del procedimiento se puede realizar un muestreo terminal de la arteria hepática y la vena porta para permitir la comparación directa de la entrada, salida y drenaje linfático hepático. En última instancia, estas técnicas proporcionan una plataforma versátil para evaluar procesos hepáticos, incluyendo la farmacocinética de fármacos, el flujo y metabolismo de nutrientes, y las respuestas hepáticas específicas, bajo diversas condiciones fisiopatológicas.

Introducción

El hígado es un órgano metabólico e inmunológico central responsable del procesamiento de nutrientes, la desintoxicación de xenobióticos y la vigilancia inmunológica. El hígado es el órgano más grande productor de linfa del cuerpo. Estudios en grandes mamíferos sugieren que contribuye entre el 25% y el 50% del flujo linfático^{total 1,2}. En roedores, los estudios de canulación indican que aproximadamente entre el 10% y el 20% del flujo linfático torácico total se origina en el^{hígado 3,4}. La linfa hepática se origina a partir de plasma filtrado a través del endotelio fenestrado de los capilares sinusoidales dentro del parénquima hepático. Este filtrado se acumula en el espacio de Disse, un compartimento intersticial entre los hepatocitos y las células endoteliales sinusoidales. El filtrado pasa entonces por el espacio del Mall hacia capilares linfáticos portales que convergen en vasos colectores que drenan hacia el hilo hepático y la cisterna^{quília 5,6}.

El sistema linfático hepático está anatómicamente dividido en redes portal, subcapsular y sublobular ^6,7. Estudios recientes de imagen volumétrica demuestran que los linfáticos hepáticos forman una red altamente ramificada del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular C (VEGF-C), en gran medida confinada a los tractos porta. Esta red está compuesta predominantemente por capilares linfáticos que drenan retrogradamente hacia la vena porta. Por otro lado, los linfáticos subcapsular y sublobular, distribuidos a lo largo de la superficie hepática y en las regiones venosas centrales, respectivamente, son vías adicionales de drenaje. La imagen postmortem humana ha revelado además una densa red de vasos linfáticos a lo largo de las venas hepáticas, lo que indica que los linfáticos venosos periportal y hepático regulan conjuntamente la salida linfática^{hepática 8}.

La linfa hepática representa un ultrafiltrado derivado del plasma que refleja tanto procesos metabólicos como^{inmunológicos 9,10}. Los análisis bioquímicos demuestran que la linfa hepática contiene albúmina, lipoproteínas, citocinas y metabolitos derivados de la actividad parenquimatosa^{hepática 3,4,6}, consistente con el perfil proteómico general del líquido linfático reportado en^{otros tejidos 10}. Los primeros estudios demostraron que la linfa hepática contiene clases distintas de lipoproteínas, siendo las lipoproteínas de alta densidad (HDL) una fracción dominante, consistente con el papel central del hígado en la síntesis y remodelación del^{HDL 11}. Cabe destacar que trabajos más recientes mostraron que la linfa hepática está enriquecida en ésteres de HDL y colesterol en comparación con la linfa mesentérica, destacando su contribución clara al tráfico lipídico y al transporte inverso del^{colesterol 3}. Además, la linfa hepática actúa como conducto inmunológico, transportando mediadores inmunitarios, células presentadoras de antígenos y vesículas extracelulares que conectan los microambientes hepáticos con la inmunidad^{sistémica 9}.

Las alteraciones en la formación y drenaje de la linfa hepática son características clave de la enfermedad hepática. En la cirrosis y la hipertensión portal, la presión sinusoidal elevada provoca un aumento varias veces en la producción de linfa, lo que conduce a linfangioectasia, fibrosis y ascitis una vez superada la capacidad de drenaje. La lesión hepática crónica también favorece la linfangiogénesis dependiente de VEGF-C/VEGFR-3, con una remodelación linfática excesiva o aberrante que contribuye a la inflamación hepática, el edema y la acumulación^{de lípidos 9,12}. Además, en la enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) y en el carcinoma hepatocelular, se ha demostrado que el aumento de la densidad linfática hepática se correlaciona con la progresión de la enfermedad y la metástasis^13,14.

A pesar del papel fisiológico y clínico central de la linfa hepática, sigue siendo poco estudiada y poco explorada en la investigación experimental, principalmente debido a los desafíos técnicos para aislar la linfa hepática pura. Se han descrito más ampliamente modelos de recogida linfática torácica y mesentérica, pero estos solo proporcionan información indirecta sobre los mecanismos de transporte hepático. Una limitación en el campo se abordó desarrollando un modelo de canulación linfática hepática de rata, que permitió la recogida directa de la linfa^{hepática 4}. Con este enfoque, se demostró que la mayor parte de la absorción linfática de proteínas terapéuticas administradas por vía intravenosa ocurre en el hígado y el mesenterio. Estos hallazgos destacan la linfa hepática como una vía clave para el intercambio macromolecular entre los sistemas sanguíneo y linfático, con importantes implicaciones para la farmacocinética y la distribución de terapias^{biológicas 4}.

Para cerrar las lagunas restantes, el presente estudio describe un modelo integral de ratas que permite muestrear simultáneamente sangre linfa hepática y sistémica mediante la canulación del conducto linfático hepático, la arteria carótida y la vena yugular. Este enfoque permite la evaluación en tiempo real del transporte de solutos y el intercambio entre compartimentos intersticiales y sistémicos hepáticos, proporcionando una plataforma experimental robusta para investigar el transporte hepático, el metabolismo, la señalización inmune y la disposición de fármacos bajo condiciones fisiológicas y patológicas. El modelo también incluye muestreo terminal opcional de la arteria hepática y la vena porta para permitir la comparación directa de la entrada, salida y drenaje linfático hepático.

Figura 1. Esquema del modelo de multi-canulación para muestreo linfático y sanguíneo simultáneo. Un modelo integral de canulación que ilustra muestreo simultáneo de la arteria carótida, vena yugular, arteria hepática, conducto linfático hepático y vena porta. (A) La arteria carótida se canula para muestreos sanguíneos intermitentes. (B) La vena yugular externa se canula para una infusión continua de solución salina para mantener la hidratación y compensar la pérdida de líquido durante la muestreo. (C) La arteria hepática común, que discurre paralela al conducto linfático hepático, se canula para la toma de muestras terminales de sangre. (D) El conducto linfático hepático se canula para una recogida linfática continua. (E) Se accede a la vena porta mediante punción con aguja para la toma de muestras terminales de sangre. Los procedimientos mostrados en (A), (B) y (D) se realizan antes del muestreo terminal, seguidos de (C) muestreo de la arteria hepática y, posteriormente, muestreo de la vena porta (E). Abreviaturas: EJV, vena yugular externa; CA, arteria carótida; SVC, vena cava superior; VCI, vena cava inferior; Ao, aorta; CHA, arteria hepática común; HL, conducto linfático hepático; ML, conducto linfático mesentérico; AME, arteria mesentérica superior; PV, vena porta. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales que involucraron animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Monash de Ciencias Farmacéuticas (ID Ético #46283) y se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices del Consejo Australiano y de Nueva Zelanda para el Cuidado de Animales en la Investigación y la Enseñanza (ANZCCART) y el Código Australiano para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica, Australia)¹⁵.

Modelos animales: Se utilizaron ratas albinas Rattus norvegicus macho o hembra de acría superior, o ratas Sprague–Dawley (SD) que pesaban entre 250 y 350 g. Los animales se obtuvieron de proveedores autorizados de animales de laboratorio (Monash Animal Research Platform) y se alojaron en jaulas ventiladas individualmente bajo temperatura controlada (22 ± 2 °C) y un ciclo de 12 horas de luz a oscuridad, con acceso libre a comida y agua antes de la experimentación. Los animales fueron aclimatados al menos una semana antes de la cirugía para minimizar la variación fisiológica relacionada con el estrés.

Se describe un modelo de canulación hepática de conducto linfático, arteria carótida y vena yugular que permite muestrear simultáneamente sangre linfática hepática y sistémica. Se puede realizar un muestreo terminal opcional de la arteria hepática y la vena porta bajo anestesia para un análisis comparativo de la entrada y salida linfática hepática. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparativos el día antes de la cirugía

1. Ayunar la rata durante la noche si es necesario para el protocolo experimental específico. Asegúrate de tener acceso libre al agua en todo momento.
2. Prepara solución salina estéril para la infusión intravenosa durante la recogida linfática. Determinar el volumen requerido en función de la duración de la extracción (normalmente 3–5 horas) y una tasa sugerida de infusión de 1,5–3,0 mL/h para reemplazar la pérdida de líquido debida a la recogida de linfa y sangre, así como pérdidas fisiológicas como la producción de orina.
3. Prepara tres cánulas de polietileno para la canulación del conducto linfático hepático, la arteria carótida y la vena yugular de la siguiente manera:
   1. Conducto linfático hepático
      1. Corta una cánula de 0,8 mm de diámetro exterior (O.D.) y 0,5 mm de diámetro interior (I.D.) a 30–35 cm. Asegúrate de que la longitud permita la recogida sin tensión.
      2. Biselar la punta de inserción aproximadamente a 45° con una cuchilla quirúrgica estéril para facilitar la inserción.
   2. Arteria carótida
      1. Corta una cánula de 0,8 mm de diámetro polar y diámetro interior de 0,5 mm a 20–30 cm. Marque aproximadamente 2–2,5 cm desde el extremo interno para indicar la profundidad de inserción.
   3. Vena yugular
      1. Corta una cánula de 0,8 mm de diámetro dentro, 0,5 mm de diámetro interior o 0,96 mm de diámetro interior, y 0,58 mm de diámetro interior a 50 cm o más. Marca 1–1,5 cm desde el extremo interno para la profundidad de inserción. Asegúrate de que la longitud pueda llegar a la bomba de infusión sin tensión.
4. Prepara una solución anticoagulante que consista en 0,1% de EDTA en agua estéril o 20 UI/mL de heparina en solución salina estéril.
5. Llena una jeringuilla de 1 mL con solución anticoagulante y coloca una aguja de 25 g en las cánulas de 0,8 mm de sobredosis o una aguja de 23 g en las cánulas de 0,96 mm.
6. Enjuaga cada cánula con aproximadamente tres veces su volumen interno, asegurándote de que no queden burbujas de aire.
7. Mantén las cánulas llenas de anticoagulante y tapadas con la aguja y la jeringuilla adjuntas durante la noche. El pre-remojo con un anticoagulante minimiza la formación de coágulos.
8. Prepara tubos de recogida para sangre y linfa. Añadir solución anticoagulante para lograr una concentración final de 1 mg/mL de EDTA o 10 UI/mL de heparina tras la recogida de la muestra.

2. Preparativos inmediatos antes de la cirugía

1. Enjuaga todas las cánulas con anticoagulante para confirmar la patencia. Asegúrate de que no haya burbujas de aire.
2. Inducir anestesia en la rata con un 5% de isoflurano en oxígeno a 1 L/min en una cámara de inducción.
3. Monitoriza la respiración y asegúrate de que la frecuencia se haya reducido a aproximadamente 1,5 respiraciones por segundo (aproximadamente 90 respiraciones/min), indicando una profundidad anestésica adecuada.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico volátil y debe usarse dentro de un sistema anestésico o campana extractora correctamente ventilado para minimizar la exposición ocupacional.
4. Transfiere a la rata a una almohadilla quirúrgica calentada (37°C) y mantenga la anestesia con un 1–3% de isoflurano en oxígeno administrado a 0,4–0,6 L/ min a través de un cono nasal.
5. Confirma la profundidad anestésica adecuada por la ausencia de reflejos corneales y de pellizco en los dedos del pie. Mantén la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico y el periodo de recogida de linfa.
   NOTA: La anestesia continua es esencial para prevenir el dolor durante la cirugía y evitar el desplazamiento de la cánula debido al movimiento.
6. Afeita las regiones quirúrgicas, incluyendo el cuadrante abdominal derecho (de la línea media al flanco derecho, aproximadamente 2 cm por debajo de la caja torácica) y la región clavicular derecha o izquierda.
7. Desinfectar todas las áreas quirúrgicas usando clorhexidina al 0,5% seguida de etanol al 70%.

3. Anulación de la arteria carótida

NOTA: La canulación de la arteria carótida puede realizarse antes o después de la canulación de la vena yugular.

1. Mantén la misma posición dorsal e incisión cervical.
2. Coloca un pequeño soporte (por ejemplo, jeringuilla de 3 mL) bajo el cuello para elevar la región carótida.
   NOTA: Este paso es opcional.
3. Separa los músculos del cuello para exponer la arteria carótida aproximadamente a 1 cm por debajo de la superficie cutánea.
4. Aísla la arteria usando pinzas de iris curvadas. Identificar y separar suavemente el nervio vago adyacente para evitar daños en el nervio.
5. Coloca pinzas Graefe rectas bajo la arteria para ocluir el flujo sanguíneo y pasa dos suturas de seda 4-0 debajo. Ata la sutura proximal (craneal) de forma firme.
6. Haz una pequeña incisión en la superficie de la arteria.
7. Levanta suavemente la colgaja del vaso con la punta de las pinzas del cristalino para estabilizar el lumen del vaso para la inserción de la cánula.
8. Inserta la cánula a la profundidad premarcada de 2–2,5 cm. Espera un reflujo leve; Si es excesivo, vuelve a ocluir y limpia antes de continuar.
   PRECAUCIÓN: La punción y canulación vascular implican instrumentos afilados y deben realizarse con cuidado para evitar lesiones accidentales.
9. Confirma la colocación correcta extrayendo suavemente un pequeño volumen de sangre e infundiendo solución anticoagulante de nuevo en la cánula sin sentir resistencia ni observar hinchazón subcutánea.
10. Asegura la cánula con suturas y sella el extremo exterior con un tapón.
11. El procedimiento puede pausarse brevemente tras la canulación de la arteria carótida mientras se mantiene la anestesia.
12. Cierra la herida en el cuello con suturas estériles. En la Figura 2 se muestra una visión general del aislamiento de la arteria carótida y la canulación exitosa.

Figura 2: Canulación de la arteria carótida. (A) Los músculos del cuello emparejados que flanquean la arteria carótida (flechas naranjas). La glándula salival (flechas azules) está colocada cranealmente. (B) La arteria carótida expuesta está aproximadamente a 1 cm bajo la superficie de la piel. La glándula salival (flechas azules) está colocada cranealmente. (C) Montaje quirúrgico previo a la inserción de la cánula, mostrando oclusión del flujo sanguíneo con pinzas Graefe rectas y dos suturas de seda que aíslan la arteria, con su extremo superior atado. (D) Aproximadamente 2 cm de la cánula se insertan con éxito en la arteria carótida (flechas amarillas). La cánula de la arteria carótida está indicada por las flechas verdes. (E) Se confirmó la canulación exitosa de la arteria carótida mediante la extracción de sangre en la cánula. (F) Se atan tres suturas (tamaño 4-0) alrededor de la arteria carótida y la cánula para asegurar (flechas moradas). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Canulación de la vena yugular

1. Coloca la rata en reclinancia dorsal con el cuello extendido y la cabeza ligeramente girada hacia la izquierda.
2. Identifica la vena yugular situada sobre la clavícula por su ubicación y el flujo sanguíneo visible. Realiza una incisión oblicua de 1–1,5 cm desde la clavícula hacia la tráquea.
3. Disecciona de forma directa el tejido subcutáneo para exponer la vena.
4. Separa la vena del tejido conectivo circundante usando pinzas de iris curvas. Confirma el aislamiento pasando pinzas por debajo de la vena.
5. Coloca dos suturas de seda 4-0 bajo la vena en cada extremo del segmento expuesto. Ata la sutura craneal (superior) de forma firme para ocluir el flujo sanguíneo.
6. Para evitar el reflujo de sangre, coloque pinzas Graefe rectas bajo la vena y apoye las empuñaduras sobre una jeringuilla o soporte.
7. Haz una pequeña incisión (~1 mm) en la parte superior de la vena a un tercio del segmento aislado usando tijeras de iris.
8. Levanta suavemente la colgaja del vaso con la punta de las pinzas del cristalino para estabilizar el lumen del vaso para la inserción de la cánula.
9. Inserta la punta de la cánula en la incisión usando pinzas de iris y avanza hasta la profundidad marcada previamente (1–1,5 cm).
10. Libera la oclusión una vez que la cánula esté estabilizada para permitir el flujo sanguíneo.
    NOTA: Mantén un agarre estable para evitar el reflujo venoso. Si se produce sangrado, vuelve a ocluir inmediatamente y limpia el campo antes de continuar.
11. Confirma la colocación correcta extrayendo suavemente un pequeño volumen de sangre e infundiendo solución anticoagulante de nuevo en la cánula sin sentir resistencia ni observar hinchazón subcutánea.
12. Asegura la cánula con suturas en ambos extremos proximal y distal.
13. Ocluye temporalmente el tubo externo, retira la jeringuilla y sella la cánula con un tapón.
14. Cubre la incisión con gasa humedecida con suero salino tibio hasta que la canulación de la arteria carótida esté completa. Imágenes representativas del aislamiento y canulación de la vena yugular se muestran en la Figura 3.

Figura 3: Canulación de la vena yugular. (A) La vena yugular (contorno negro con puntos) se encuentra justo debajo de la piel, por encima de la clavícula. La cánula de la arteria carótida establecida puede observarse cerca de la vena yugular (flechas verdes). (B) La vena yugular está aislada con dos suturas de seda; el extremo superior se ató. (C) Aproximadamente 1 cm de la cánula se inserta con éxito en la vena yugular (flechas amarillas). La cánula de la vena yugular se indica con las flechas azules; La cánula de la arteria carótida está indicada por las flechas verdes. (D) Se atan tres suturas (tamaño 4-0) alrededor de la vena yugular y la cánula para asegurar (flechas moradas). Una canulación exitosa de la vena yugular confirmada mediante inyección salina suave. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Canulación del conducto linfático hepático

1. Coloca a la rata en reclinación dorsal bajo un microscopio quirúrgico.
2. Realizar una incisión horizontal cutánea de 4–5 cm desde la línea media hasta el flanco derecho, aproximadamente entre 1,5 y 2 cm por debajo de la caja torácica (Figuras 4A, B).
3. Retrae la piel y realiza incisiones iguales en los músculos oblicuos externos e internos.
4. Cauteriza o liga cualquier vaso sanguíneo grande que encuentres para evitar una pérdida excesiva de sangre.
5. Reposiciona suavemente los órganos usando hisopos de algodón humedecidos con solución salina: mueve el hígado hacia el diafragma, el estómago hacia la izquierda y el intestino delgado hacia abajo.
6. Mantén los órganos retraídos con gasas empapadas en suero. El lugar de la incisión y la posición del órgano se ilustran en la Figura 4C.
7. Identificar el conducto linfático hepático (diámetro ~0,6 mm) utilizando los puntos anatómicos establecidos. El conducto discurre paralelo y ligeramente caudal a la arteria hepática, situado medial al riñón derecho y adyacente a la vena cava inferior.
8. Observa la apariencia del conducto linfático hepático. Normalmente parece translúcida y estrecha.
9. Distinguir el conducto linfático hepático del conducto linfático mesentérico, que es más grande y suele parecer opaco o blanco debido al contenido de quilomicrón. Por tanto, el conducto linfático mesentérico puede servir como un punto anatómico para ayudar en la identificación del conducto linfático hepático situado cranealmente.
10. Retira el tejido conectivo que cubre el conducto linfático y la vena cava usando pinzas Graefe rectas.
11. Crea un paso bajo la vena cava insertando pinzas Graefe rectas a través de la cama grasa bajo el riñón derecho. Avanza hasta que las puntas emergan en el lado opuesto, bajo la vena cava, paralela al conducto linfático hepático.
12. Agarra el extremo externo de la cánula preparada con las pinzas Graefe rectas y tira de ella a través del túnel creado bajo la vena cava hasta que la punta salga por el lado opuesto.
13. Usando las pinzas hemostáticas Halsted-Mosquito, dobla la punta de una aguja de 25G aproximadamente a 90°. Con la aguja doblada, perfora el conducto linfático hepático en el lado derecho (más cercano al operador).
    PRECAUCIÓN: Ten cuidado al manipular agujas afiladas durante la punción del conducto linfático para evitar lesiones accidentales.
14. Asegúrate de que la cánula esté llena de solución anticoagulante sin burbujas de aire. Inserta el extremo biselado aproximadamente 2 mm dentro del conducto.
15. Observa el extremo externo de la cánula para el flujo linfático (~ 100 μL/h). Si no se observa flujo, ajusta o vuelve a insertar la cánula.
16. Una vez confirmado el flujo linfático, tapa la cánula antes de aplicar una pequeña gota de adhesivo veterinario para asegurar el lugar de inserción. Una vez seco, confirma el flujo linfático a través del tubo.
17. Retirar la gasa y devolver los órganos a sus posiciones originales.
18. Coloca el tubo de recogida que contiene la solución anticoagulante debajo de la salida de la cánula. Confirma que la linfa fluye gota a gota hacia el tubo.
19. Cierra la pared abdominal suturando secuencialmente las capas oblicua interna, oblicua externa y cutánea. La identificación y canulación exitosa del conducto linfático hepático se muestran en la Figura 5.
    NOTA: Tras una canulación hepática exitosa del conducto linfático, el procedimiento puede pausar brevemente mientras se mantienen la anestesia y la hidratación antes de iniciar la recogida linfática.

Figura 4: Exposición a los conductos linfáticos hepáticos. (A) Punto anatómico que indica entre 1,5 y 2 cm por debajo de la caja torácica derecha para la incisión. (B) Incisión a través de la piel y los músculos abdominales, exponiendo los órganos internos. (C) Órganos reposicionados para exponer el conducto linfático hepático. El hígado se desplaza hacia el diafragma, el estómago a la izquierda del animal y el intestino delgado se coloca hacia abajo. El conducto linfático hepático se encuentra entre la arteria hepática (flecha verde) y la arteria mesentérica (flecha azul). I: hígado; SI: intestino delgado; VIC: vena cava inferior; RK: Riñón derecho. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Identificación y canulación de conductos linfáticos hepáticos. (A) Las estructuras linfáticas y arteriales pueden observarse tras reposicionar órganos y antes de la extirpación del tejido conectivo circundante. La arteria hepática (flechas verdes) se encuentra cranealmente en relación con el conducto linfático hepático adyacente (flechas amarillas). El conducto linfático mesentérico (flechas moradas) se encuentra sobre la arteria mesentérica (contorno negro con puntos). Estas estructuras son perpendiculares a la vena cava inferior. VIC: vena cava inferior; RK: Riñón derecho. (B) El conducto linfático hepático (flechas amarillas) puede visualizarse claramente tras la extracción del tejido conectivo circundante. El conducto linfático hepático discurre paralelo a la arteria hepática (contorno punteado en verde) y cranealmente en relación con el conducto linfático mesentérico (flechas moradas) y la arteria mesentérica (contorno punteado en negro). (C) La cánula (flechas blancas) se inserta en el conducto linfático hepático (flechas amarillas) mediante la pequeña perforación realizada en el conducto linfático (flechas naranjas). Se puede visualizar el conducto linfático mesentérico (flechas azules). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Periodo postquirúrgico

1. Inmediatamente después de una canulación linfática hepática exitosa, iniciar la rehidratación infundiendo suero fisiológico estéril a 1,0–2,0 mL/h a través de la cánula de la vena yugular.
2. Mantén la infusión durante toda la recogida de linfa. Alternativamente, la rehidratación puede realizarse mediante una cánula gástrica o duodenal, lo que permite reservar la cánula de la vena yugular para la extracción de sangre venosa si es necesario.
3. Mantenga al animal bajo anestesia sobre una almohadilla quirúrgica calentada (37°C) durante todo el periodo de recogida.
4. Monitoriza la frecuencia respiratoria y la profundidad anestésica durante todo el experimento observando los patrones respiratorios y las respuestas reflejas, manteniendo la anestesia isoflurana mediante un cono nasal.
5. La hidratación se mantuvo mediante infusión continua de suero fisiológico (1,0–2,0 mL/h) a través de la cánula de la vena yugular.
6. Para minimizar la alteración fisiológica, el volumen total de sangre recogido antes de la toma de muestras terminales se limitó al <10% del volumen sanguíneo circulante estimado, de acuerdo con las directrices de ética animal institucional.
7. Recoge la linfa hepática de forma continua en tubos que contienen anticoagulantes. Cambia los tubos de recogida cada hora o según sea necesario.
8. Recoger muestras de sangre arterial en los momentos designados:
   1. Ocluye temporalmente el tubo externo y coloca una jeringuilla vacía.
   2. Retira sangre hasta que el tubo esté lleno.
   3. Sustituye la jeringuilla por una nueva para la recogida de la muestra y extrae aproximadamente 100–200 μL de sangre arterial en cada punto de muestreo designado.
   4. Enjuaga la cánula con solución anticoagulante tras cada recolección.
   5. Sella la cánula con un tapón.
9. Tras completar la recogida de la muestra, procede a la toma terminal de la arteria hepática y la vena porta, o bien elimina humanamente a la rata con pentobarbitona sódica (>100 mg/kg) a través de la cánula carotídea o yugular.

7. Muestreo terminal de la arteria hepática y la vena porta

1. Al finalizar la extracción de linfa y sangre, mantener la anestesia profunda y asegurar una respiración estable antes de proceder con la toma de muestras vasculares terminales.
2. Reabre cuidadosamente la incisión abdominal para exponer la cavidad abdominal superior.
3. Retrae suavemente el hígado hacia el diafragma, el estómago a la izquierda y el intestino delgado hacia abajo usando gasa humedecida con solución salina para revelar el conducto linfático hepático canulado.
4. Identifica la arteria hepática, que discurre paralela y caudal al conducto linfático hepático.
   NOTA: La arteria parece más pequeña y pálida que la vena porta y presenta un flujo más pulsátil.
5. Preparar una cánula de polivinilo de 0,61 mm de sobredosis y 0,28 mm de diámetro interior, prellena con solución anticoagulante y libre de burbujas de aire.
6. Usando pinzas de iris curvas, aísla un segmento corto de la arteria hepática y coloca una sutura de seda 4-0 debajo.
7. Levanta suavemente la arteria y coloca una segunda sutura distal a la primera. Ata la sutura distal para controlar el reflujo mientras deja la sutura proximal sin atar para su cierre posterior.
8. Con tijeras micro de punta fina, realiza una pequeña incisión transversal (aproximadamente 0,5 mm) en la pared arterial entre las suturas.
9. Levanta suavemente la colgaja del vaso con la punta de las pinzas Dumont para estabilizar el lumen del vaso para la inserción de la cánula.
10. Inserta el extremo biselado de la cánula de polivinilo en la abertura y avanza aproximadamente 2–3 mm.
11. Asegura la cánula atando la sutura proximal alrededor tanto del vaso como de la cánula.
12. Confirma la colocación correcta observando el flujo sanguíneo pulsátil hacia la cánula o aspirando suavemente una pequeña cantidad de sangre arterial roja brillante.
13. Recoger entre 0,5 y 1 mL de sangre en un tubo premarcado que contiene anticoagulante.
14. Tras la recogida, retira la cánula y logra la hemostasia apretando ambas suturas. La exposición de la arteria hepática y el procedimiento de canulación se ilustran en la Figura 6.
15. Identifica la vena porta, que discurre medial y perpendicular a la arteria hepática. La vena porta tiene un diámetro mayor y una coloración más oscura en comparación con la arteria hepática.
16. Coloca una aguja de 23 o 25 g en una jeringuilla de 1 mL y enjuagada previamente con solución anticoagulante.
17. Inserta el bisel de aguja hacia arriba en la vena porta en un ángulo poco profundo (aproximadamente 20°–30°) para evitar el colapso o desgarro del vaso.
18. Aspira suavemente el volumen sanguíneo necesario.
19. Dado que la punción de la vena porta es terminal, se mata humanamente al animal inmediatamente después de la recogida de la muestra administrando >100 mg/kg de pentobarbitona sódica a través de la cánula carótida o yugular mientras permanece bajo anestesia profunda. La localización de la vena porta y el método de muestreo terminal se muestran en la Figura 7.
    PRECAUCIÓN: La pentobarbitona sódica es una sustancia controlada y debe manipularse y administrarse conforme a las normativas institucionales y los procedimientos de seguridad adecuados.
20. Confirmar la muerte por cesación de la respiración y la actividad cardíaca antes de la eliminación del cadáver, de acuerdo con el Código Australiano para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (NHMRC) ¹⁵ y las directrices ANZCCART.

Figura 6: Identificación de la arteria hepática y canulación. (A) Exposición de la arteria hepática (flechas verdes). La arteria hepática se encuentra junto al conducto linfático mesentérico (contorno negro punteado) y perpendicular a la vena cava inferior. VIC: vena cava inferior; L: hígado. (B) Aislamiento de la arteria hepática mediante pinzas curvas. (C) Inserción exitosa (flechas moradas) de la cánula de polivinilo de 0,61 mm × 0,28 mm (flechas naranjas) en la arteria hepática (flechas verdes), asegurada con suturas de seda 4-0 para muestreo sanguíneo arterial terminal. Se puede visualizar el conducto linfático mesentérico (contorno negro con puntos). PV: vena porta. (D) Tras asegurar la cánula, se confirma la patencia de la cánula extrayendo sangre en la cánula. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Identificación de la vena porta y muestreo terminal. (A) La vena porta (indicada por la aguja de 25G) se encuentra entre la arteria hepática (contorno blanco con puntos) y el conducto biliar (contorno negro con puntos). La vena porta parece más grande y oscura que la arteria hepática y se accede bajo anestesia profunda para la recogida de sangre terminal. PV: vena porta; VIC: vena cava inferior; I: hígado; SI: intestino delgado; RK: Riñón derecho. (B) Inserción exitosa de la aguja de 25G en la vena porta (contorno negro con puntos) para muestreo de sangre venosa terminal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

El enfoque quirúrgico descrito en la sección de Protocolo permite identificar claramente el conducto linfático hepático, situado medial al riñón derecho y que discurre paralelo a las arterias celíaca y hepática, como se había informado^{previamente 4}. La anatomía representativa y la canulación se muestran en la Figura 5. La canulación exitosa se confirma por la aparición inmediata de líquido linfático claro a ligeramente turbio, libre de contaminación por quilomicrón lechoso, lo que sugiere una mezcla mínima con la linfa mesentérica. Esta observación es coherente con las características reportadas de la linfa^{hepática 3}. La identificación de la linfa hepática se basó en su posición anatómica respecto a la arteria hepática y la vena cava inferior, así como en su característica apariencia clara, en contraste con el aspecto típicamente opaco o lechoso de la linfa mesentérica.

El flujo linfático hepático debería mantenerse estable durante todo el periodo de recogida, con una tasa media de aproximadamente 0,1 mL/^{h 3,4,11}. El flujo linfático hepático suele mantenerse más estable durante aproximadamente 2–3 horas tras la canulación bajo anestesia, aunque periodos de extracción más largos (hasta ~6–8 horas) pueden ser posibles bajo condiciones experimentales óptimas. Los valores representativos del flujo linfático reportados en estudios^{previos 4} se resumen en la Tabla 1. El flujo linfático hepático suele ser menor que el reportado en los caudales de los conductos linfáticos mesentéricos y torácicos en ratas anestesiadas.

Sitios linfáticos (estado consciente)	Caudal linfático medio (mL/h)
Linfa torácica (consciente)	1,74 ± 0,33
Linfa torácica (anestesiada)	0,65 ± 0,10
Linfa mesentérica (anestesiada)	0,45 ± 0,11
Linfa hepática (anestesiada)	0,12 ± 0,02

Tabla 1: Caudales linfáticos medios (mL/h) a través de canulaciones de conductos linfáticos torácicos, mesentéricos y hepáticos en ratas conscientes y anestesiadas. Los datos se presentan como media ± SEM para n = 3–5 ratas. Adaptado de la Tabla 3 en Yadav et al. (2018)⁴.

Los resultados representativos que ilustran el transporte linfático de macromoléculas se muestran en la Figura 8. Estos ejemplos demuestran cómo el modelo puede utilizarse para evaluar la recuperación linfática tras la administración intravenosa de macromoléculas terapéuticas, incluyendo aproximadamente 60 kDa interferón pegilado α2a (IFN-PEG40), aproximadamente 31 kDa interferón pegilado α2b (IFN-PEG12) y el anticuerpo monoclonal trastuzumab, lo que sugiere que el hígado es un importante lugar de extravasación y acceso linfático para terapias^{macromoleculares 4}.

Figura 8: Recuperación linfática de terapias macromoleculares administradas intravenosamente en la linfa torácica, mesentérica y hepática. Porcentaje total de dosis recuperado en linfa torácica, mesentérica y hepática tras la administración intravenosa de interferones PEGilados de diferentes tamaños moleculares (IFN-PEG12 e IFN-PEG40) y un anticuerpo monoclonal (trastuzumab). Los datos representan la media ± SEM de recuperación de dosis durante 8 horas. Adaptado de Yadav et al. (2018)⁴. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El modelo también permite un perfilado detallado de lipoproteínas de la linfa^{hepática 3}. Análisis representativos de la composición lipídica linfádica se muestran en la Figura 9. En comparación con la linfa torácica y mesentérica, la linfa hepática presenta un contenido total de lípidos notablemente más bajo pero concentraciones de proteínas comparables a las de otras fuentes linfáticas. El análisis de lipoproteínas de la linfa hepática pone de manifiesto el papel único del hígado en el tráfico lipídico y el transporte inverso del colesterol. Los datos representativos de composición lipídica se resumen en la Tabla 2. La linfa hepática HDL está enriquecida en ésteres colesterílicos, la linfa mesentérica HDL es predominantemente rica en triglicéridos, y la linfa torácica HDL contiene un contenido relativamente mayor de fosfolípidos. Estas diferencias composicionales indican roles distintos de cada fuente linfática en el metabolismo y transporte lipídico.

	%wt/wt
Facciones	Fosfolípidos	Colesterol libre	Éster de colesterilo	Triglicéridos
Linfa mesentérica
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Linfa hepática
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Linfa torácica
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plasma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabla 2: Composición lipídica de las fracciones de lipoproteínas de alta densidad (D-HDL) y ligeras (L-HDL) aisladas de linfa mesentérica, hepática y torácica, y plasma. Los valores representan el porcentaje en peso (% en peso y en peso) de fosfolípidos, colesterol libre, éster colesterílico y triglicéridos en relación con la fracción lipídica total. Los datos se presentan como media ± SEM. Adaptado de la Tabla 1 en Gracia et al. (2020)³.

Figura 9: Composición de proteínas y lípidos de la linfa mesentérica, hepática y torácica. Contenido proporcional de proteínas y lípidos totales en linfa mesentérica, hepática y torácica. El contenido lipídico incluye fosfolípidos (PL), triglicéridos (TG), ésteres de colesterol (CE) y colesterol libre (FC), expresados como el porcentaje de peso lipídico en relación con el peso total de proteínas y lípidos. Los datos se presentan como media ± SEM. Adaptado de Gracia et al. (2020)³. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La canulación del conducto linfático hepático es un procedimiento técnicamente difícil, incluso para microcirujanos experimentados. Varios pasos críticos pueden aumentar la probabilidad de preservar la integridad de los conductos linfáticos y lograr un flujo linfático estable. Al identificar y aislar el conducto linfático hepático (pasos del protocolo 5.7-5.10), el primer paso es eliminar el tejido conectivo y la grasa que cubren el conducto linfático mesentérico y la vena cava cerca del conducto linfático hepático. El conducto linfático hepático es translúcido y frágil en comparación con el conducto linfático mesentérico, más grueso y opaco, y puede romperse fácilmente si se manipula directamente. El conducto linfático mesentérico sirve como un punto de referencia anatómico útil, ya que la limpieza de su tejido suprayacente revela que el conducto linfático hepático está ubicado superiormente. Dado que el conducto linfático hepático suele mostrar curvaturas o curvaturas, el operador debe seleccionar un punto de canulación a lo largo de un segmento recto y orientar la cánula paralela al curso natural del conducto para minimizar el riesgo de oclusión o desgarro (pasos 5.11-5.14).

La canulación en sí es el factor más crítico para el éxito. Tras perforar el conducto (paso 5.13), el acceso intraluminal puede confirmarse visualmente insertando la punta de la pinza en la abertura y asegurando que solo una pared del vaso cubra el instrumento. La aparición de dos muros opuestos indica una perforación de paso a través. Una vez confirmado el acceso intralumínico, la cánula puede avanzar suavemente a lo largo del conducto en el mismo ángulo. Se debe tener cuidado para evitar dañar la vasculatura adyacente, ya que la hemorragia en el campo puede introducir sangre en la cánula de recolección linfática, contaminando la muestra y aumentando sustancialmente el riesgo de formación de coágulos. Tras establecer el flujo linfático (paso 5.15), se debe tapar el extremo colector de la cánula y aplicarse con cuidado adhesivo veterinario para evitar que entre en la luz. También hay que revisar la cánula para detectar burbujas de aire, ya que el aire atrapado aumenta la contrapresión y puede dificultar el flujo linfático. Dado que la linfa hepática se genera bajo baja presión de impulsión, el extremo colector de la cánula debe estar siempre situado por debajo del nivel del lugar quirúrgico para facilitar el drenaje por gravedad.

La canulación exitosa del conducto linfático hepático se indica con el inicio inmediato del flujo linfático. Una vez establecida, la linfa hepática suele fluir a aproximadamente 0,1 mL/h, con una producción estable durante varias horas. El caudal puede variar según la anatomía, fisiología y condiciones experimentales del animal. Por ejemplo, la linfa se recogía bajo anestesia con isoflurano en este protocolo. La anestesia con isoflurano puede influir en parámetros fisiológicos relevantes para la función linfática, por lo que deben considerarse condiciones experimentales que impliquen anestesia al interpretar las tasas de formación^{linfática 16}. La canulación del conducto linfático hepático requiere laparotomía y una delicada manipulación microquirúrgica de los vasos linfáticos abdominales, por lo que la recogida de linfa de ratas conscientes no es factible en este modelo. Estudios previos que comparan el transporte linfático bajo condiciones anestesiadas y conscientes o utilizando diferentes regímenes anestésicos han demostrado que la anestesia puede influir modestamente en las tasas absolutas de flujo linfático, pero no altera sustancialmente los patrones generales de transporte^{linfático 4}. Por lo tanto, los valores de flujo linfático obtenidos en este modelo deben interpretarse en el contexto de condiciones experimentales anestesiadas.

Una reducción o cese gradual del flujo durante la recogida suele ser causada por la formación de coágulos dentro de la cánula, resultado de contaminación sanguínea o deposición de fibrina. El flujo a veces puede restablecerse localizando y pellizcando suavemente la cánula con pinzas finas para fragmentar mecánicamente el coágulo, o aspirando suavemente a través del extremo colector de la cánula para desalojar la obstrucción. Si la obstrucción está confinada a la parte externa, la cánula puede cortarse proximal al coágulo y volver a conectarse a un tubo nuevo mediante un conector de silicona estéril. Si el coágulo se forma en el lugar de la canulación, normalmente se requiere una nueva canulación. En estos casos, se puede intentar retirar el adhesivo con mucho cuidado para evitar la rotura del conducto o de los vasos sanguíneos adyacentes. La hemostasia debe lograrse antes de volver a intentar la canulación, ya que incluso una fuga leve de sangre a la cánula favorece notablemente la coagulación dentro del sistema linfático hepático de baja presión.

Los factores fisiológicos también influyen en el flujo y la patencia linfática. El flujo linfático hepático en ratas es inherentemente más lento que el flujo mesentérico o torácico, incluso en condiciones basales^17,18. Además, la anestesia general puede reducir el flujo linfático en otros circuitos linfáticos en comparación con ratas conscientes y en movimiento^{libre 19}. Dado que la canulación linfática hepática requiere anestesia y laparotomía, estos factores probablemente contribuyen a los caudales relativamente bajos y a la mayor tendencia a coágulos observados durante acumulaciones prolongadas. Mantener la hidratación a través de la vena yugular o la cánula gastrointestinal durante la recogida ayuda a estabilizar el flujo linfático y a reducir la formación de coágulos. En este modelo, el flujo linfático hepático estable suele ser posible durante 2–3 horas, tras lo cual el flujo puede deteriorarse y es más probable que se produzca coágulos. Sin embargo, en condiciones experimentales óptimas, la recogida de linfa puede mantenerse durante periodos más largos, con una duración máxima de hasta ~8 horas^{reportadas 4}.

La inclusión de muestreo de la arteria hepática y la vena porta (Figuras 6 y Figura 7) amplía la aplicabilidad del modelo al permitir la comparación directa entre el flujo hepático, el flujo linfático y la circulación sistémica. Este paso terminal de muestreo permite la evaluación simultánea del transporte microvascular hepático y del aclaramiento intersticial dentro de un solo animal. Estas comparaciones proporcionan información valiosa sobre la distribución de solutos entre los compartimentos vascular hepático y linfático, especialmente para macromoléculas grandes o compuestos lipofílicos que dependen de la difusión intersticial.

A pesar de estos desafíos, el modelo de canulación linfática hepática sigue siendo una técnica valiosa e informativa. El hígado contribuye con una proporción significativa del flujo linfático total del cuerpo, y la linfa hepática contiene proteínas y otros componentes que se originan del líquido intersticial hepático. Al muestrear la linfa que drena directamente del hígado, este modelo permite analizar moléculas y células que salen del hígado antes de ser diluidas por la linfa mesentérica y sistémica en el conducto torácico. El análisis bioquímico de la linfa hepática proporciona información sobre el metabolismo intersticial hepático y los procesos de transporte^{lipídico 12,20}. Esto complementa la información obtenida de la sangre portal o sistémica, que integra los efectos del metabolismo hepático y el intercambio extrahepático. Es importante destacar que esta configuración, que combina canulaciones linfática hepática, arterial carotídea y venosa yugular, permite una evaluación dinámica de los gradientes de solutos entre el flujo hepático y la entrada vascular, proporcionando una visión más completa del transporte y la limpieza hepática.

Estudios previos que utilizan este modelo demuestran que el muestreo linfático hepático permite evaluar la recuperación linfática de terapias macromoleculares y comparar el transporte de solutos entre la linfa hepática y la circulación sistémica. En conjunto, la canulación linfática hepática, el muestreo vascular concurrente y el perfilado bioquímico proporcionan una plataforma experimental robusta para estudiar la dinámica microvascular e intersticial hepática. El modelo permite la evaluación simultánea del transporte hepático, el metabolismo, el procesamiento de lípidos y la señalización inmunitaria, y puede adaptarse para investigar cambios bajo condiciones fisiopatológicas como la MASLD o la inflamación hepática.

En conclusión, este modelo quirúrgico refinado, que integra acceso linfático hepático, arterial hepático y venoso portal, ofrece un enfoque integral y reproducible para examinar las vías de transporte hepático. Permite la comparación directa del flujo vascular, el eflujo intersticial y el drenaje linfático, lo que respalda estudios que proporcionan una visión mecanicista del transporte, metabolismo y procesos farmacocinéticos específicos del hígado. Además, la capacidad de muestrear la linfa hepática ofrece una oportunidad única para estudiar el tráfico de células inmunitarias y antígenos del hígado, ofreciendo valiosos conocimientos sobre la vigilancia inmunitaria hepática, la inflamación y los mecanismos de tolerancia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Evita la formación de coágulos en cánulas y muestras recolectadas
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Evita la formación de coágulos en cánulas y muestras recolectadas
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Usado para desinfección del sitio quirúrgico
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Usado para recolección de linfa y sangre
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Usado para manipulación de órganos y mantenimiento de humedad
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Usado para reposicionar órganos durante cirugía
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Usado para aislamiento de vasos y manipulación de tejidos
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Usado para abrir y estabilizar el lumen del vaso de la arteria hepática para la inserción de cánulas
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Usado para desinfección del sitio quirúrgico
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Usado para doblar la aguja 25G para la punción del ducto linfático hepático
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Mantiene la temperatura corporal durante la cirugía
Induction chamber	Darvall	1859	Usado para la inducción inicial de la anestesia
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Proporciona infusión controlada de solución salina vía cánula
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Usado para incisiones en piel y músculo
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Anestésico de inhalación usado para inducción y mantenimiento de anestesia
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Usado para abrir y estabilizar el lumen del vaso de la vena yugular y arteria carótida para la inserción de cánulas
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Usado para punción de vena porta y toma de muestras de sangre
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Usado para el lavado de cánulas y punción del ducto linfático hepático
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Mantiene la anestesia durante la cirugía
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Gas portador para la anestesia con isoflurano
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Usado para la inserción de cánulas en arteria carótida, vena yugular y ducto linfático hepático
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Usado para la inserción de cánulas en arteria hepática
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Usado para asegurar vasos y cánulas
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Usado para eutanasia (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Usado para rehidratación y lavado
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Usado para el aislamiento delicado de vasos
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Usado para la visualización durante la inserción de cánulas en el ducto linfático hepático
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Usado para biselado de puntas de cánulas durante la preparación
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Usado para el lavado de cánulas
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Usado para toma de muestras de sangre
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Usado para infusión de solución salina
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Usado para incisiones vasculares
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Usado para asegurar la cánula del ducto linfático hepático