Un modelo murino de lesión cerebral cerrada rotacional y repetitiva

Resumen

Se describe un modelo ratón reproducible de lesión cerebral concusiva rotacional, que proporciona un método versátil para investigar los sutiles fundamentos funcionales y biológicos —incluidos cambios neurovasculares, inflamatorios y de comportamiento— tras un impacto único o repetitivo en ausencia de daño cerebral estructural evidente.

Resumen

La lesión cerebral conmocionosa (ICC), el sustrato fisiopatológico subyacente a la conmoción clínica, es una condición frecuente pero poco comprendida, con potencial de deterioro neurológico a largo plazo en un subconjunto de pacientes. Especialmente el CBI repetitivo, es decir, en deportes de contacto, se ha asociado con déficits cognitivos duraderos y neurodegeneración progresiva (por ejemplo, encefalopatía traumática crónica, CTE). Para cubrir esta brecha de conocimiento, se estableció un modelo reproducible de ratón de lesión cerebral rotacional en cabeza cerrada que recapitula características biomecánicas y patológicas clave de la CBI. Se utilizaba un impactador electromagnético guiado estereotácticamente para dar un golpe estandarizado al cráneo intacto. Para reducir la tensión focal sobre el cráneo y el tejido cerebral adyacente, la punta impactadora fue equipada con una tapa de silicona hecha a medida. Esta configuración inducía de forma fiable la rotación de la cabeza con baja variabilidad entre animales, evitando fracturas de cráneo o lesiones microscópicas de tejido. Para preservar la actividad neuronal y vascular fisiológica y evitar posibles efectos neuromoduladores de la anestesia profunda, se indujo lesión cerebral en ratones conscientes bajo sedación ligera utilizando el agonista α2 medetomidina. Los impactos inducidos provocaron un movimiento rotacional reproducible de la cabeza, con solo una variabilidad menor atribuible a la posición de la cabeza. La integridad estructural del cerebro se evaluó mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 in vivo y se confirmó mediante análisis histológicos ex vivo , que no revelaron evidencia de alteración tisular, contusión o microhemorragias, pero sí una alteración leve y generalizada de la interfaz microvascular. Este novedoso modelo de lesión cerebral rotacional en cabeza cerrada proporciona una plataforma experimental robusta para investigaciones longitudinales de alteraciones sutiles neurovasculares, inflamatorias y de barrera hematoencefálica que ocurren en ausencia de patologías estructurales evidentes. Su aplicación permite obtener conocimientos mecanicistas sobre la fisiopatología de la conmoción cerebral y las posibles consecuencias neurodegenerativas de lesiones repetitivas, facilitando así el desarrollo de biomarcadores clínicos urgentemente necesarios.

Introducción

La lesión cerebral traumática (LCT) sigue siendo una causa significativa de discapacidad a largo plazo en todos los grupos de edad, con adolescentes y adultos jóvenes afectados ^{de forma desproporcionada 1,2,3}. La gran mayoría de los TCE se clasifican como leves (mTBI), comúnmente conocidos como conmoción cerebral a nivel clínico. Aunque la conmoción no está asociada por definición con daño cerebral estructural evidente detectable por la neuroimagen convencional, cada vez más evidencia sugiere que el mecanismo subyacente de lesión —aquí denominado lesión cerebral concusiva (CBI)— representa una entidad fisiopatológica distinta y clínicamente relevante.

En particular, la CBI repetitiva, especialmente cuando ocurre en sucesión temporal cercana, como se encuentra frecuentemente en deportes de contacto y entornos militares, se ha relacionado con un deterioro cognitivo persistente, síntomas neuropsiquiátricos y el desarrollo de encefalopatía traumática crónica (CTE^)1,2,3. Esta aparente discrepancia entre la naturaleza leve de la lesión inicial y el potencial de secuelas neurológicas a largo plazo supone un gran desafío tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación mecanicista.

La evidencia emergente indica que alteraciones sutiles pero sostenidas en la interfaz neurovascular y neuroglial representan un mecanismo relevante de la enfermedad⁴. Estos cambios abarcan la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB), la estructura microvascular, la activación glial, la excitabilidad neuronal y los procesos de reparación endógeno, lo que podría vincular la fisiopatología a nivel celular con los déficits funcionales y conductuales a largo plazo observados después, especialmente en el CBI^repetitivo 5,6,7,8 . En conjunto, estas alteraciones se reconocen cada vez más como posibles contribuyentes a los retardos funcionales y conductuales tras la CBI. Sin embargo, la naturaleza difusa y multifacética complica la comprensión mecanicista y hasta ahora ha obstaculizado el desarrollo de intervenciones terapéuticas dirigidas.

Los modelos preclínicos que recapitulan aspectos clave de la cascada fisiopatológica son herramientas cruciales para diseccionar estos mecanismos e identificar nuevas vías terapéuticas. Aunque existe una amplia gama de modelos experimentales de LCT, la mayoría fueron diseñados para imitar lesiones moderadas a graves o basarse en daños estructurales^{focales 9,10,11}. En contraste, hay una sorprendente falta de modelos animales para el mecanismo característico de lesión de^{CBI 5}. En su mayoría, un trauma cerebral etiquetado como "leve" se induce por un impacto focal en la cabeza rigidamente fijada, o incluso por un impacto cortical directo tras una craneotomía, lo que contradice fundamentalmente el mecanismo difuso de lesión impulsado por aceleración-desaceleración que define la conmoción en^{humanos 6,7}. Aunque estos enfoques permiten un control preciso sobre los parámetros de la lesión, su capacidad limitada para replicar la dinámica de las conmociones en el mundo real reduce su relevancia traslacional.

Para superar estas limitaciones, existen varios métodos para inducir una lesión cerebral cerrada replicable^{y difusa} 12,13,14. Basándose en estos conceptos y con el objetivo de minimizar la complejidad técnica, se desarrolló un modelo controlado de lesión rotacional en ratones utilizando un impactador electromagnético comercialmente empleado a menudo en otros modelos experimentales de trauma (es decir, impacto cortical controlado, CCI). Al proporcionar un impacto reproducible a la cabeza que se mueve libremente, este enfoque preserva la integridad estructural al tiempo que permite la investigación longitudinal de alteraciones neurovasculares, neurogliales y funcionales tras un CBI único y repetitivo bajo condiciones que se asemejan a las características biomecánicas de la conmoción cerebral humana.

Combinado con evaluación conductual longitudinal, imágenes in vivo e histología ex vivo , este modelo proporciona una plataforma versátil y accesible para explorar alteraciones neurovasculares, gliales y conductuales tras impactos únicos o repetitivos. Por ello, es muy adecuado para estudiar los sutiles mecanismos secundarios de la enfermedad CBI, identificar parámetros sustitutos traslacionales y evaluar posibles intervenciones terapéuticas en un entorno experimental clínicamente relevante.

Protocolo

Todos los procedimientos animales cumplían con la Ley Alemana de Bienestar Animal y eran aprobados por autoridades institucionales y gubernamentales (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Los experimentos se realizaron siguiendo las directrices de ARRIVE. Un flujo de trabajo esquemático se detalla en la Figura 1. Este protocolo induce de forma fiable lesiones cerebrales conmocionarias, como lo demuestra un panel definido de resultados estructurales, conductuales y neurovasculares (Figura 2). Todos los materiales utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales.

1. Consideraciones generales

NOTA: Los ratones fueron alojados socialmente bajo condiciones estandarizadas (ciclo luz/oscuridad de 12 horas) con acceso ad libitum a comida y agua. Los ratones se aclimataron a la instalación experimental durante al menos 7 días antes de la cirugía. En este estudio piloto se utilizaron un total de 40 ratones, asignados 10 animales a cada grupo experimental (sham como grupo de control, grupo CBI único, CBI repetitivo en alta frecuencia y CBI repetitivo en grupo de baja frecuencia). Instala un sistema de cámara de alta velocidad a la altura de los ojos con la cabeza del ratón en una posición fija delante del ratón (por ejemplo, 10 cm). Para asegurar la consistencia entre los ensayos, mantén la posición y orientación de la cámara constantes. En este estudio se utilizó una GoPro Hero6 a 240 fotogramas por segundo (fps) con una resolución de 1080px. El software de análisis de movimiento de código abierto Kinovea (versión 2025.2.0) se utiliza para los análisis cinemáticos descritos.

2. Inducción de analgesia y anestesia

1. Prepara la configuración, incluyendo el marco estereotáctico y el accesorio para el impactador electromagnético.
2. Administrar tramadol (1 mg/mL) bebiendo agua dos días antes de la inducción del trauma y continuar durante tres días después de la (última) cirugía.
3. Inducir anestesia utilizando isoflurano en una mezcla de óxido nitroso/oxígeno (_O2 30%,_N2O 70%), con un 4–4,5% de isoflurano en una cámara de inducción.
4. Evalúa la tolerancia quirúrgica usando el reflejo de pellizco en el dedo del pie. Procede una vez que no haya respuesta de retirada.
5. Saca el ratón de la cámara de inducción y colócalo sobre una almohadilla térmica dentro del marco estereotáctico. Mantener la temperatura central en 37 ± 1,0 °C utilizando una sonda rectal de fibra óptica. Protege los ojos de la desecación aplicando pomada oftálmica.
6. Mantener la anestesia administrando isoflurano al 2,0–2,5% mediante un cono nasal conectado al montaje estereotáctico.

3. Preparación del cráneo

1. Ajusta el ratón dentro del marco estereotáctico usando barras de oído específicas.
2. Afeita el cuero cabelludo y desinfecta a fondo la zona quirúrgica con un antiséptico a base de alcohol.
3. Aplicar anestesia local mediante inyección subcutánea de bupivacaína (0,1 mg/kg).
4. Reevalúa el reflejo de pellizco en el dedo del pie antes de la incisión en la piel. Proceda solo en ausencia de respuesta de retirada para asegurar una anestesia constante y profunda.
5. Realizar una incisión cutánea media de aproximadamente 7 mm para exponer el cráneo.
6. Expone cuidadosamente el cráneo sobre el hueso parietal derecho entre Bregma y Lambda.
7. Asegúrese de que el marco estereotáctico esté orientado perpendicularmente al cráneo, con el eje vertical situado a un ángulo de 90° respecto a la superficie de la cabeza.
8. Coloca un pasador marcador en el soporte estereotáctico y céntraslo directamente en Bregma.
9. Cero todas las coordenadas estereotácticas y mueve el pin marcador a las coordenadas anteroposterior (AP) y mediolateral (ML) predefinidas (en nuestro modelo, en AP 0,5, ML -2,5). Marca el punto objetivo con un rotulador resistente al agua.

4. Ajuste de la analgesia

1. Suelta el ratón de las barras de los oídos.
2. Inyectar medetomidina por vía subcutánea (0,5 mg/kg) y reducir gradualmente el isoflurano hasta <0,5 %.
3. Mantén la anestesia al < 0,5% de isoflurano mientras monitorizas continuamente la respiración y la temperatura corporal.
4. Permitir el equilibrio bajo estas condiciones durante 10 minutos para alcanzar un estado estable de anestesia mientras se preserva la actividad de la red neuronal. Se utilizaron la frecuencia respiratoria, la ausencia de respuestas reflejas y la temperatura corporal estable (37 ± 1,0 °C) como indicadores estandarizados para asegurar una profundidad anestesica comparable entre los animales.

5. Inducción de impacto

NOTA: Antes del experimento, fabrica un soporte para la cabeza del modelo animal con aislamiento de espuma de polietileno (PE) disponible comercialmente, una espuma polimérica de celda cerrada y no reticulada, que restringe la aceleración hacia abajo permitiendo el movimiento rotacional. Además, fabricar una punta esférica de impacto de 5 mm hecha a medida con silpurán (relación 1:1; rigidez 830 kPa).

1. Retira la sonda de temperatura rectal y suspende la administración de isoflurano, luego coloca al ratón en posición prona sobre el soporte de la cabeza.
2. Coloca la tapa de silicona hecha a medida a la punta impactadora comercialmente disponible.
3. Monta el impactador electromagnético en el soporte estereotáctico y asegúrate de que el dispositivo esté orientado a un ángulo de 10° respecto a la superficie del cráneo.
4. Alinea la punta del impactador por encima de la región objetivo predefinida en el cráneo.
5. Baja la punta del impactador en posición prolongada hasta que toque ligeramente la superficie del cráneo.
6. Retrae la punta del impactador y avanza hasta la profundidad de indentación deseada (es decir, 3 mm en estos experimentos) hacia la superficie del cráneo. Para los animales de control, omite la bajada y sube la punta en la misma cantidad.
7. Inicia la grabación de vídeo. Realizar un único impacto concusivo rotacional activando el rayo electromagnético mediante el interruptor de control con una velocidad de 5 mm/s y una duración de pulso de 0,1 ms.
8. Retrae el impactador inmediatamente después de completar el impacto.
9. Antagoniza la anestesia de medetomidina usando el antagonista atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Evaluación posterior al impacto y cierre de la herida

1. Gira el ratón en posición supina.
2. Evalúa el reflejo de enderezamiento registrando el tiempo necesario para que el animal vuelva a una posición prona.
3. Reinducir la anestesia con isoflurano en una mezcla de óxido nitroso/oxígeno (_O2 30%,_N2O 70%) al 4% de isoflurano.
4. Saca el ratón de la cámara de inducción y colócalo sobre la almohadilla térmica junto al marco estereotáctico. Mantener la temperatura central en 37 ± 1,0 °C utilizando una sonda rectal de fibra óptica.
5. Fija el ratón en el marco estereotáctico usando barras para los oídos.
6. Cierra la incisión cutánea usando suturas interrumpidas con filamentos autoabsorbentes (por ejemplo, Polyglactin 910, 6-0).
7. Transfiere al ratón a una caja térmica y monitoriza hasta que recupere completamente la conciencia.
8. Devuelven al animal a su jaula de casa.

7. Paradigma de impacto repetido

1. Asigna ratones a grupos simulados, individuales o repetidos de CBI según el diseño experimental.
2. Para grupos con lesiones repetidas, programe sesiones CBI posteriores a intervalos definidos (por ejemplo, cada 48 horas).
3. Antes de cada CBI posterior, administrar analgesia preoperatoria mediante tramadol en agua potable, tal y como se describe en la sección 3.1.
4. Anestesia repetida, marcado estereotáxico e impacto siguiendo el mismo procedimiento descrito en las secciones 3–6, incluyendo anestesia local con bupivacaína (0,1 mg/kg, s.c.), administración de medetomidina (0,5 mg/kg, s.c.) con mantenimiento de isoflurano en < 0,5%, segmentación estereotáctica en AP 0,5 y ML −2,5 respecto al Bregma, y administración de un impacto concusivo rotacional usando un impactador electromagnético (profundidad de indentación 3 mm, velocidad 5 mm/s, duración del pulso 0,1 ms, ángulo de 10° respecto a la superficie del cráneo).
5. Asegurar una posición consistente (colocación prona sobre un soporte de espuma de polietileno que permita movimiento rotacional), parámetros de impacto idénticos (ángulo, profundidad, velocidad y duración) y condiciones peri y postprocedimentales estandarizadas, incluyendo antagonización de medetomidina con atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.), reinducción de anestesia (4% isoflurano en O₂ 30%/N₂O 70%) y control de temperatura a 37 ± 1,0 °C, durante sesiones repetidas para mantener la reproducibilidad en animales y en puntos temporales.
6. Asegurar una posición consistente, parámetros de impacto y condiciones de recuperación a lo largo de las sesiones repetidas para mantener la reproducibilidad entre animales y puntos de tiempo.
7. Monitoriza continuamente a los animales para detectar déficits conductuales acumulativos tras los impactos repetidos.

8. Análisis cinemático

1. Exporta los vídeos en formato estándar (por ejemplo, MP4) para su análisis y cárgalos en el software de Kinova.
2. Navega hasta la ventana temporal correspondiente que contiene los fotogramas previos y posteriores al impacto (por ejemplo, de -0,025 a 0,3 s desde el impacto). Asegúrate de establecer una tasa de frames adecuada (por ejemplo, 240 fps) en la configuración del software. Define una referencia de escala (por ejemplo, distancia entre ojos).
3. Utiliza la herramienta de seguimiento de Kinovae para establecer un sistema de seguimiento de tres puntos (por ejemplo, ojo derecho, ojo izquierdo, nariz; Figura 3A). Empieza a registrar cada punto y corrige manualmente los errores de seguimiento, especialmente durante movimientos rápidos u oclusión.
4. Exporta las coordenadas rastreadas como archivos CSV o Excel.
   NOTA: Se realizó un análisis cinemático adicional utilizando un script personalizado de MATLAB. Los datos de seguimiento resueltos en tiempo exportados desde Kinovea se importaban y preprocesaban para eliminar entradas inválidas y garantizar una escala temporal consistente. La traslación de cabeza se definió como el centroide de los tres puntos de referencia rastreados (ojo derecho, ojo izquierdo y nariz), de los cuales se derivaron el desplazamiento lineal, la velocidad y la aceleración mediante diferenciación numérica. La rotación de la cabeza se estimó a partir de la orientación del eje ojo-nariz, calculando el desplazamiento angular en relación con una línea base previa al impacto y la velocidad angular obtenida como primera derivada. Para reducir la amplificación del ruido, todas las señales de posición y angulares se suavizaban usando un filtro Savitzky–Golay antes de la diferenciación. El parámetro principal de resultado fue el desplazamiento angular máximo, mientras que los perfiles de velocidad y aceleración se analizaron como medidas relativas de la dinámica del movimiento de la cabeza en los ensayos.

Resultados

Consideraciones generales:

La aplicación de este protocolo induce de forma reproducible una lesión cerebral conmocionista, como demuestra un conjunto definido de lecturas de validación estructural, conductual y neurovascular (véase la Figura 2). La integridad estructural se mantuvo tras la lesión. No se detectó ninguna alteración macroscópica ni hemorragia evidente del tejido, lo que indica que el protocolo induc...

Discusión

Se caracteriza un modelo novedoso de TCC de cabeza cerrada basado en lesiones por aceleración-desaceleración, que presenta un deterioro leve pero generalizado de la BBB y un fenotipo neuropsiquiátrico distintivo que recuerda a una conmoción cerebral clínica. Al reproducir las características clave del CBI de manera controlada y consistente, preservando la integridad estructural, el modelo proporciona un marco experimental útil y bien caracterizado para estudiar los mecanismos subyacentes...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medicamento
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Antagonista de Medetomidina (antagonista del α2-adrenoceptor), subcutáneo (0.5 mg/kg)
Ungüento Oftálmico Bepanthen	Bayer	11809917	Protección ocular durante la anestesia, tópico
Bupivacaína	Sigma-Aldrich	B1160000	Anestesia local, subcutánea (0.1 mg/kg)
Isoflurano	CP pharma	1214CN	Anestesia, inhalación (inducción y mantenimiento)
Medetomidina	Vetoquinol	VM 06043/4003	Adjunto sedante/anestésico (agonista del α2-adrenoceptor), subcutáneamente (0.5 mg/kg)
Clorhidrato de Tramadol (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Analgésico administrado a través del agua potable, 1 mg/mL concentración final para ratones, desde 2 días antes hasta 3 días después de la cirugía
Equipo
Almohadilla de cuello de polietileno	Personalizado		Soporte para posicionamiento prono durante el impacto
Cubierta para Impactor Estereotáxico Silupran	Personalizado		Distribuye la carga mecánica, previene daños focales en el cráneo, se adjunta a la punta del impactor, 830 kPa
Impactor Estereotáxico	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Dispositivo de impacto electromagnético para la entrega controlada de impacto
Herramientas
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, EE. UU.
Kinovea		(versión 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, EE. UU.	NA