La regulación a la baja del miR-483-3p es un indicador pronóstico pobre en el NSCLC. La sobreexpresión de miR-483-3p suprime los fenotipos malignos de las células NSCLC, cuya función se revirtió por la sobreexpresión de KIF3B.
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Artículo de investigación
La regulación a la baja del miR-483-3p es un indicador pronóstico pobre en el NSCLC. La sobreexpresión de miR-483-3p suprime los fenotipos malignos de las células NSCLC, cuya función se revirtió por la sobreexpresión de KIF3B.
Los microARNs desempeñan un papel amplio en el cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC). Para investigar el valor clínico de miR-483-3p en CPNPC y su objetivo molecular, se reclutaron 350 pacientes con CPNM en este estudio. Los resultados de RT-qPCR mostraron que la expresión histológica tumoral de miR-483-3p disminuía progresivamente a medida que aumentaba la etapa de metástasis tumor-ganglio (TNM). La curva de característica operativa del receptor (ROC) mostró que el nivel histológico de miR-483-3p puede distinguir eficazmente a pacientes con NSCLC con alto estadio TNM (III) de aquellos con estadio bajo (I+II) (área bajo la curva ROC = 0,869). La curva de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con CPNM con baja expresión de miR-483-3p mostraron una tasa de supervivencia global menor a 5 años. Tras ajustar por otros factores de confusión, el análisis multivariante de Cox identificó aún más el miR-483-3p como un factor protector independiente para la supervivencia de los NSCLC. Mecánicamente, el ensayo de arrastre de ARN mostró que la regulación alza de miR-483-3p se coprecipitaba con el ARNm de KIF3B e inhibía su expresión, suprimiendo así los fenotipos malignos de las células NSCLC e induciendo la apoptosis. En conclusión, la regulación a la baja de miR-483-3p actúa como un marcador pronóstico negativo en la CPNC, lo que podría afectar la progresión del cáncer al regular negativamente el KIF3B.
Entre las muertes relacionadas con el cáncer, el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es una de las principales causas. Su alta tasa de mortalidad se debe principalmente al crecimiento agresivo de tumores, la metástasis temprana y el desarrollo de resistenciaadquirida 1,2,3. A pesar de los avances en las estrategias clínicas actuales, el pronóstico general para los pacientes con CPNM sigue siendodeficiente 4,5,6. Además de los desafíos biológicos, los pacientes con CPNM suelen experimentar una carga sintomática elevada, incluyendo dolor, disnea, fatiga y malestar psicológico, lo que afecta significativamente su calidad de vida y complica el manejo clínico. La atención de enfermería eficaz —como la evaluación de síntomas, la educación del paciente, el apoyo psicosocial y la coordinación de la atención multidisciplinar— desempeña un papel crucial en la mejora de los resultados del paciente y la adherencia al tratamiento. Por lo tanto, una investigación en profundidad sobre los principales mecanismos moleculares que impulsan el desarrollo y progresión del NSCLC es de suma importancia para el desarrollo de nuevos biomarcadores pronósticos y estrategias terapéuticas efectivas, así como para informar intervenciones de enfermería dirigidas que aborden tanto la enfermedad como las necesidades centradas en el paciente.
Se ha reportado ampliamente que los microARN (miARN) regulan la expresión génica inhibiendo la traducción de ARNm objetivo o promoviendo su degradación en el nivelpost-transcripcional 7. Investigaciones extensas indican que los miARN desempeñan un papel regulador crucial en varios tipos de cáncer, incluido el NSCLC. Su desregulación está estrechamente asociada con el fenotipo maligno de células tumorales y la resistencia a laquimioterapia 7,8,9,10,11. Por ello, identificar miARNs que se expresan de forma anormal en el NSCLC y que poseen funciones significativas se ha convertido en un tema candente en la investigación tumoral actual. Nuestro análisis bioinformático preliminar reveló una regulación a la baja consistente de miR-483-3p tanto en pacientes con CPNPC como en líneas celulares resistentes a fármacos, lo que sugiere su posible asociación con la progresión adversa de la enfermedad. Por ello, este estudio se centra en miR-483-3p para explorar su función en NSCLC. La evidencia existente indica que miR-483-3p actúa como un gen supresor de tumores en varios cánceres humanos 12,13,14,15, cuyo silenciamiento se cree está asociado con la resistencia al gefitinib en NSCLC 16. Sin embargo, su patrón específico de expresión en los CPNs, el valor pronóstico clínico y los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo incompletamente comprendidos.
El objetivo de este estudio fue clarificar sistemáticamente la importancia clínica y las funciones biológicas de miR-483-3p en el NSCLC, y esclarecer el papel de su miembro posterior de la familia cinesina 3B (KIF3B). Para lograrlo, primero analizamos su expresión en muestras de tejido clínico y su correlación con las características clínico-patológicas y el pronóstico de los pacientes. Posteriormente, se realizaron ensayos funcionales in vitro para investigar los efectos de miR-483-3p en las funciones celulares de las células NSCLC. Además, identificamos KIF3B como un gen clave posterior de miR-483-3p mediante predicción bioinformática y experimentos de biología molecular, y validamos la relación regulatoria mediante ensayos funcionales de rescate. La alta expresión de KIF3B se asocia con un aumento de la proliferación, una migración aumentada y resistencia a la quimioterapia en célulascancerosas 17,18,19,20,21,22, pero su papel funcional en los NSCLC sigue sin estar claro. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en caracterizar el papel y la importancia clínica del eje miR-483-3p/KIF3B en los NSCLC desde tres perspectivas: pronóstico clínico, identificación del gen objetivo y mecanismos funcionales, proporcionando así potencialmente nuevas perspectivas para la evaluación del pronóstico y la terapia dirigida de los NSCLC.
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El Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nankín aprobó este estudio. Los principios fundamentales de la Declaración de Helsinki se han aplicado de forma constante a lo largo de todo el proceso de investigación. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. La información detallada sobre todos los materiales y reactivos se proporcionaba en la Tabla de Materiales.
Análisis de bioinformática:
La base de datos Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov) se aplicó para buscar en los conjuntos de datos relacionados con NSCLC. GSE171517 es un análisis de ARN no codificante basado en muestras de suero de pacientes con CPNM y controles sanos. GSE110815 es un análisis de matriz de ARN no codificante realizado en células NSCLC resistentes y sensibles al gefitinib. Los miARN expresados diferencialmente en estos dos conjuntos de datos se evaluaron estableciendo un umbral de |log 2FC| ≥ 2, p < 0,05. Aunque estos conjuntos de datos provienen de diferentes compartimentos (suero, líneas celulares), utilizamos una estrategia complementaria: miARNs derivados del suero para potencial biomarcador no invasivo, y miARNs derivados de líneas celulares resistentes a fármacos para su relevancia funcional en la progresión y resistencia. La intersección nominó miR-483-3p para validación tisular, asumiendo que la desregulación entre compartimentos indica una relevancia biológica robusta para el NSCLC.
Los objetivos potenciales de miR-483-3p se predijeron simultáneamente en las bases de datos de miRDB (https://mirdb.org/custom.html) y base estelar (https://rnasysu.com/encori/index.php). El umbral de selección en estas dos bases de datos era Target Score ≥ 60 y TDMDScore ≥ 1, respectivamente. Después, se utilizó una Plataforma de Análisis de Bioinformática (www.bioinformatics.com.cn) para el análisis GO usando la intersección de estos objetivos.
Inclusión de muestras clínicas:
Este estudio es un estudio observacional retrospectivo basado en especímenes de NSCLC resecados quirúrgicamente. Este estudio incluyó a 350 pacientes con CPNM que fueron sometidos a tratamiento quirúrgico en el hospital, comprendiendo 96 pacientes con metástasis de ganglios tumorales (TNM) en estadio I, 96 pacientes con enfermedad en estadio II y 158 pacientes con enfermedad en estadio III. Sus características clínicas detalladas se presentaron en la Tabla 1. A todos estos pacientes se les diagnosticó CPNM mediante examen histológico. Los criterios de exclusión incluyen función cardíaca, hepática o renal deteriorada, infecciones activas o enfermedades autoinmunes, trastornos psiquiátricos graves o deterioro cognitivo, historiales clínicos ausentes o incompletos, y la falta de consentimiento informado de los pacientes. El análisis clínico se realizó recogiendo muestras de tejido tumoral y su estado de supervivencia en un plazo de cinco años tras el diagnóstico. La metodología de seguimiento es la siguiente: todos los pacientes fueron seguidos desde la fecha de la cirugía hasta su fallecimiento, pérdida para seguimiento o finalización del estudio. Durante el primer año, el seguimiento se realizó cada 3 meses. A partir de entonces, se realizó cada 6 meses mediante exámenes ambulatorios y entrevistas telefónicas. En cada seguimiento, se registró información sobre el estado de supervivencia, causa de la muerte, recurrencia de la enfermedad y tratamiento posterior. El periodo de supervivencia global se definía como el periodo desde la fecha de la cirugía hasta la fecha de la muerte por cualquier causa.
Procesamiento celular:
BEAS-2B, una línea celular epitelial pulmonar humana normal, fue cultivada en DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Todas las líneas celulares de NSCLC (HCC827, H1299, H520, A549) se cultivaron en el medio de cultivo dedicado suministrado por el mismo proveedor. La formulación básica del medio especializado para HCC827, H1299 y H520 es RPMI-1640 + 10% FBS + 1% P/S, y para A549 es F-12K de Ham + 10% FBS + 1% P/S. Las celdas congeladas se descongelan rápidamente en un baño maria a 37 °C, se centrifugan para eliminar el medio de criopreservación y se resuspenden en un medio de cultivo fresco. Cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, se digieren con un 0,25% de tripsina-EDTA y se transmiten en una proporción de 1:3. Todas las líneas celulares han sido verificadas mediante análisis STR (Archivo Suplementario 1), y están libres de contaminación por micoplasmas. Todos los experimentos in vitro utilizaron células de la cuarta a la décima generación.
El agonista miR-483-3p y su control negativo (agonista-NC), el pequeño ARN interferente de KIF3B (si-KIF3B) y su control negativo (si-NC), así como el vector de sobreexpresión de KIF3B (oe-KIF3B) y su control en blanco (oe-NC) fueron transfectados usando un reactivo de transfección. La concentración de trabajo del agonista o agonista-NC de miR-483-3p era de 100 nM, y la cantidad del plásmido oe-KIF3B era de 2,5 μg (placa de 6 pozos). Las células se extrajeron 48 horas después de la transfección para experimentos posteriores.
RT-qPCR:
El ARN total de las muestras y células de tejido tumoral fue extraído utilizando el reactivo TRIzol. El cDNA transcrito inversamente se preparó usando un kit de reactivos RT, y luego se realizó qPCR en un sistema RT-PCR rápido 7500 usando SYBR Green Pro Taq HS Premix. La expresión relativa de miR-483-3p y KIF3B se normalizó con el mantenimiento de U6 y GAPDH mediante el método 2-ΔΔCT . Las secuencias correspondientes de cebadores son las siguientes:
miR-483-3p (F), 5'-ACACTCCAGCTGGGTCACTCCTCTCTCCTCC-3'
miR-483-3p (R), 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAAGACGG-3'
KIF3B (F), 5'-ATCCTGGAGCAGAAACGAACAGG-3'
KIF3B (R), 5'-GTTCCAAGGTCTCCTCATCG-3'
U6 (F), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'
U6 (R), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'
GAPDH (F), 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
GAPDH (R), 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'
La RT-qPCR se realizó con tres réplicas biológicas independientes.
Viabilidad celular:
Las células HCC827 (3000 células/pozo) y A549 (2000 células/pozo), con o sin transfección, se sembraron en una placa de 96 pozos durante periodos de cultivo variables. Después de que las células se adhierían a la superficie, la viabilidad celular se evaluaba en puntos temporales específicos en pozos designados. Específicamente, se añadieron 10 μL de Kit de Conteo Celular-8 (CCK-8) y 90 μL de medio para una incubación de 2 horas a 37 °C. La absorbancia de cada pozo se medía entonces a 450 nm usando un lector de microplacas. La viabilidad celular se realizó con tres réplicas biológicas independientes.
Ensayo de Transwell:
El dispositivo de cámara Transwell, recubierto o sin recubrimiento matricial de membrana basal (8 μm), se utilizó para el ensayo de invasión/migración. Después de que la cámara superior se siembrara con las células de NSCLC transfectadas (8 × 104, 500 μL), la cámara inferior se llenó con 700 μL de DMEM (10% FBS). Se realizó una incubación de 24 horas a 37 °C. Después de limpiar suavemente las células de la capa superior de la membrana de la cámara con un hisonete, las células de la superficie inferior de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego se teñieron con solución de violeta cristalina al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de un breve lavado con agua del grifo para eliminar el exceso de tinte. Las células migradas se contaban manualmente usando un microscopio óptico. Para cada cámara Transwell, se seleccionaron aleatoriamente tres campos de visión no solapados y se contó el número de celdas teñidas en cada campo. Luego se calculó el recuento medio de células. Este recuento fue realizado por dos investigadores independientes que desconocían las condiciones experimentales, y los valores medios resultantes se utilizaron para el análisis estadístico. El ensayo transwell se realizó con tres réplicas biológicas independientes.
Detección de apoptosis celular
Se utilizó un kit de tinción Annexin V-FITC/PI para la detección de apoptosis de células NSCLC. En resumen, se preparó primero una suspensión que contenía 6 × 104 celdas utilizando 195 μL de buffer de unión Annexin V-FITC. Luego se añadieron secuencialmente Annexin V-FITC (5 μL) y solución de tinción PI (10 μL) para incubaciones de 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras completar la incubación, el citómetro de flujo se utilizó inmediatamente para detectar las células a analizar. Por cada muestra, se adquirieron 10.000 eventos. La estrategia de acceso fue la siguiente: las celdas se activaron primero en FSC-A frente a SSC-A para excluir los residuos, seguidas por las puertas de singlets en FSC-A frente a FSC-H. Posteriormente se identificaron células apoptóticas en los gráficos de puntos Annexin V-FITC frente a PI. Los cuadrantes se configuraron usando controles sin tinte ni con una sola tinción. El porcentaje de apoptosis se calculó como la suma de las células apoptóticas tempranas (Anexina V⁺/PI⁻) y las apoptóticas tardías (Anexina V⁺/PI⁺). La detección de apoptosis celular se realizó con tres réplicas biológicas independientes.
Pull-down de ARN
El segmento del ARNm KIF3B (KIF3B/NM004798.4/NP004789.1: 32334713–32334791, 5'-AGAAATCTGTGTCACCTTCTGCCTGCTTTTGTTTGTGTTGAATGAATGCTTGTGTTTTATGAATGCTTGTGTTTTATGAAAGGAGTGATCCT-3', 78 nt) fue sintetizado in vitro y marcado con biotina utilizando un kit de destiobiotinilación al extremo de ARN 3'. Tras incubar extractos celulares con ARNm KIF3B marcado con biotina durante 1,5 h a 4 °C, se añadieron perlas magnéticas de estreptavidina para una incubación de 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, el nivel de miR-483-3p en cada reacción fue detectado por RT-qPCR, con tres réplicas biológicas independientes.
Análisis estadístico
Las variables continuas en este estudio se expresaron como media ± desviación estándar (media ± DS), mientras que los datos categóricos se presentaron como conteos. Se utilizó software de análisis estadístico adecuado para el análisis estadístico. Se utilizó ANOVA unidireccional/bidireccional para el análisis experimental de datos, seguida por la prueba post hoc de Tukey. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Se realizó un análisis de curva de características de operación del receptor (ROC) para determinar la capacidad de la expresión de miR-483-3p para distinguir a pacientes con NSCLC en estadio alto (III) de aquellos con clasificación TNM en estadio bajo (I + II). El índice de Youden (sensibilidad + especificidad – 1) se utilizó para identificar el valor de corte que maximizaba el equilibrio entre sensibilidad y especificidad. El área bajo la curva (AUC) se calculó para evaluar la capacidad discriminatoria global de la expresión de miR-483-3p. Se consideró aceptable un AUC > 0,7. Todos los análisis ROC se realizaron utilizando GraphPad Prism.
Para el análisis de supervivencia, se utilizó el método de Kaplan-Meier para estimar curvas de supervivencia global. La prueba log-rank se aplicó para comparar las distribuciones de supervivencia entre grupos (grupos de alta expresión miR-483-3p). Las curvas de Kaplan-Meier se graficaron con un intervalo de confianza (IC) del 95%. Para el modelo multivariante de regresión proporcional a riesgos de Cox, se aplicó la siguiente estrategia de selección de variables: se realizó primero el análisis univariante para cada variable candidata. Las variables con un valor p < 0,10 en el análisis univariante se consideraron como predictores potenciales y posteriormente se introdujeron en el modelo de regresión multivariante de Cox. El análisis multivariante se realizó utilizando el método de selección progresiva (condicional) basado en la prueba de razón de verosimilitud, con criterios de entrada y eliminación establecidos en p < 0,05 y p > 0,10, respectivamente. La suposición de riesgos proporcionales se verificó para cada variable utilizando residuos de Schoenfeld (p > 0,05 indicó que no hubo violación). Los resultados se informaron como razones de riesgo (HR) con IC del 95%. Todas las pruebas fueron bilaterales, y un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo salvo que se especificara lo contrario.
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El miR-483-3p regulado a la baja representa un pronóstico negativo en la NSCLC
El diagrama de Venn (Figura suplementaria 1) indica que miR-483-3p aparece regulado a la baja tanto en muestras séricas de pacientes con CPNPC como en líneas celulares de CPNPC resistentes a la quimioterapia. Un análisis ANOVA unidireccional mostró que la expresión de miR-483-3p en el tumor disminuía progresivamente con el aumento d...
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Este estudio investigó sistemáticamente el papel del miR-483-3p en la supresión de tumores de CPNM y su mecanismo subyacente mediante análisis clínico de muestras y exploración de mecanismos moleculares. El objetivo de este estudio fue doble: (1) determinar si miR-483-3p actúa como marcador pronóstico independiente en la CPNM, y (2) esclarecer el mecanismo molecular por el cual miR-483-3p puede suprimir fenotipos malignos mediante la selección de KIF3B. Nuestros hallazgos sugieren el val...
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Los autores no tienen nada que revelar.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1% violeta cristalino | Solarbio/China | G1064 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco/EE. UU. | 25200056 | |
| 4% de paraformaldehído | Beyotime/China | P0099 | |
| Sistema RT-PCR Rápido 7500 | Biosistemas Aplicados/EE. UU. | 4351106 | |
| A549 | Procell/China | CL-0016 | |
| Medio específico para A549 | Procell/China | CM-0016 | |
| Kit de tinción Annexin V-FITC/PI | Beyotime/China | C1062S | |
| BEAS-2B | STEM RECELL/China | STM-CL-5102 | |
| Kit de Recuento de Celdas-8 (CCK-8) | Solarbio/China | CA1210 | |
| Medio DMEM | MeilunBio/China | PWL003 | |
| Suero fetal bovino | Gibco/EE. UU. | A5256701 | |
| Software GraphPad Prism | GraphPad | Versión 7.0 | |
| H1299 | Procell/China | CL-0165 | |
| Medio específico H1299 | Procell/China | CM-0165 | |
| H520 | Procell/China | CL-0402 | |
| Medio específico para H520 | Procell/China | CM-0402 | |
| HCC827 | Procell/China | CL-0094 | |
| Medio específico para HCC827 | Procell/China | CM-0094 | |
| ARNm KIF3B | Genscript Biotech/China | Personalizado | |
| Reactivo Lipo6000 | Beyotime/China | C0526 | |
| miR-483-3p agonista/agonista-NC | MedChemExpress/EE. UU. | HY-R01451A y nbsp; | |
| oe-KIF3B/oe-NC | RiboBio/China | Personalizado | |
| Penicilina/estreptomicina | Solarbio/China | P1400 | |
| ARN de Pierce 3' Kit de destiobiotilinilación final | Thermo Fisher Scientific/EE. UU. | 20163 | |
| PrimeScript RT Reactivo Kit (Tiempo Real Perfecto) | TaKaRa/Japón | RR037A | |
| si-KIF3B/si-NC | RiboBio/China | Personalizado | |
| SPSS | IBM | Versión 23.0 | |
| Cuentas magnéticas de estreptavidina | New England Biolabs/EE. UU. | S1420S | |
| SYBR Green y nbsp; Pro Taq Premezcla HS | Biología Precisa/China | AG11701 | |
| Cámara Transwell | Corning/USA | 3428 | |
| Reactivo de Trizol | Invitrogen/EE. UU. | 15596026CN |
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