Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Resumen

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Resumen

Investigar la dinámica astrocito-neurona tras un ictus isquémico es esencial para comprender los mecanismos de recuperación post-ictus. Sin embargo, las metodologías actuales a menudo no logran captar interacciones en tiempo real entre neuronas y astrocitos en animales que realizan tareas conductuales específicas, limitando nuestra capacidad para investigar la fase aguda de la patología del ictus. Este protocolo presenta un método integrado que combina modelado fototrombótico del ictus con registro electrofisiológico multicanal simultáneo y fotometría de fibras en ratones despiertos y comportándose usando un optrode fabricado a medida. El protocolo incluye inducción de isquemia focal mediante fototrombosis seguida de registro simultáneo de picos neuronales y transitorios de calcio astrocíticos. El optrodo permite la administración simultánea de fototrombosis, registro de señales de calcio y manipulación optogenética sin requerir procedimientos quirúrgicos separados. Los resultados representativos validan el éxito en el registro simultáneo de la señal de calcio astrocítica y el pico neuronal. La manipulación optogenética de los astrocitos produce cambios medibles en los patrones de disparo neuronal (reducción de la frecuencia de disparo de neuronas piramidales en 1,55 ± 0,45 Hz y de la interneurona en 3,64 ± 1,37 Hz en comparación con la estimulación preoptogenética, n = 2), confirmando que el sistema es capaz de investigar las interacciones astrocito-neurona. Este enfoque integrado aborda brechas críticas en la metodología de investigación del ictus proporcionando registros multimodales en tiempo real desde la fase aguda hasta la crónica del ictus en animales que se comportan.

Introducción

El ictus isquémico sigue siendo un desafío principal de salud global, representando una de las principales causas tanto de mortalidad como de discapacidad adquirida a largo plazo^{a nivel mundial 1,2,3}. La alta tasa de discapacidad asociada al ictus isquémico se asocia a una amplia variedad de síntomas clínicos, que van desde la parálisis motora y la pérdida sensorial hasta el deterioro ^{cognitivo 4,5,6}. Es urgente comprender más profundamente los mecanismos patológicos y de recuperación del ictus isquémico durante la fase de reparación. Más allá de la falla neuronal, la falla catastrófica de los astrocitos ha sido destacada recientemente ^7,8. Los astrocitos, las células gliales más abundantes, son un componente esencial del sistema nervioso central, así como de la sinapsis tripartita. En cada fase de la cascada isquémica, los astrocitos desempeñan un papel indispensable y afectan profundamente la recuperación neuronal y^{funcional 9,10,11}. En el cerebro sano, los astrocitos y las neuronas están funcionalmente acoplados a través de la sinapsis tripartita, donde los procesos astrocíticos cubren los terminales pre y postsinápticos y participan activamente en la transmisión^{sináptica 7,8}. Los astrocitos regulan las concentraciones extracelulares de glutamato mediante transportadores excitatorios de aminoácidos, mantienen la homeostasis potástica a través de los canales Kir4.1 y modulan la fuerza sináptica mediante la liberación de gliotransmisores mediante exocitosis dependiente de^{calcio 7,8}. En este contexto, los transitorios intracelulares de calcio astrocíticos representan actividad astrocítica y están estrechamente vinculados a la activación^{neuronal 7}. Durante el ictus isquémico, esta relación tan finamente ajustada se interrumpe rápidamente. El colapso de los gradientes iónicos tras una falla energética desencadena una liberación masiva de glutamato y una despolarización en expansión, lo que conduce a una lesión neuronal excitotóxica y proliferación de astrocitos^{reactivos 12}. Los astrocitos en y alrededor del núcleo del infarto experimentan una cascada de cambios patológicos, incluyendo sobrecarga de calcio, deterioro de la recaptación de glutamato, pérdida de acoplamiento sinapsial y fallo de la liberación del^{gliotransmisor 13}. Simultáneamente, la actividad de picos neuronales se suprime profundamente a medida que las neuronas pierden viabilidad e integridad del potencial de^{membrana 14,15}. En la zona periinfarto, las neuronas supervivientes y los astrocitos reactivos participan en interacciones dinámicas que se considera fundamentales para determinar el resultado de la recuperación tras un ictus; sin embargo, los correlatos electrofisiológicos y de calcio en tiempo real de esta interacción en animales despiertos y comportados siguen siendo poco^{caracterizados 13,16}. Por ello, comprender la actividad astrocítica junto con las señales neuronales se considera una piedra angular para la recuperación funcional neural tras una lesión isquémica.

La fototrombosis es un modelo isquémico ampliamente utilizado; Utiliza tinte fotosensible y luz localizada para inducir lesiones isquémicas en áreas específicas^{objetivo 17}. Los protocolos actuales de modelado y registro del ictus dificultan la investigación de la interacción astrocito-neurona tras el ictus debido a tres principales cuellos de botella^técnicos: 17,18,19. La segregación entre modelado y registro es un inconveniente común de la mayoría de los protocolos actuales, causando un intervalo de tiempo entre el establecimiento del modelo y la grabación en tiempo^{real de la señal 20,21}. Sin embargo, minutos u horas después del ictus isquémico son un periodo esencial durante el cual tanto las neuronas como los astrocitos experimentan fluctuaciones^{drásticas 12,22}. Sin una monitorización concurrente de la interacción astrocito-neurona inmediatamente después del incidente isquémico, la investigación de una intervención temprana eficaz en el ictus isquémico se verá profundamente obstaculizada. Otra limitación de los protocolos actuales radica en el aislamiento de las modalidades de registro; La mayoría de las metodologías actuales están optimizadas para un solo tipo de señal. Por ejemplo, la electrofisiología multicanal ofrece la detección de disparos neuronales y potenciales de campo local (LFPs), pero es ciega a los estados de señalización de las células^{gliales 15,16}. Por el contrario, el monitoreo de la dinámica astrocítica mediante imágenes de calcio captura fluctuaciones astrocíticas pero carece de datos de disparo neuronal. El último cuello de botella de los protocolos actuales parece ser el estado de registro del animal; En la mayoría de los protocolos, el animal está anestesiado o en movimiento libre. Sin embargo, la disfunción motora se considera una de las secuelas más problemáticas del ictus; Comprender la relación entre ciertos comportamientos y los eventos astrocito-neurona es esencial. Por ello, existe una necesidad urgente de un método integrado capaz de realizar un modelo de ictus fototrombótico mientras captura simultáneamente señales de astrocitos y neuronales en ratones despiertos que realizan ciertas pruebas de comportamiento. Las metodologías existentes abordan solo un subconjunto de estos requisitos. La imagen de calcio con dos fotones proporciona una resolución espacial excepcional de la dinámica de microdominios astrocíticos en el cerebro intacto, pero requiere que los animales sean fijos en la cabeza o anestesiados, lo que impide una evaluación conductual naturalista, y no puede capturar simultáneamente datos de picos neuronales^{multicanal 13}. La fotometría de fibra independiente permite la monitorización astrocítica del calcio en animales que se comportan libremente, pero permanece ciega ante los patrones de disparo neuronal, sin ofrecer una lectura electrofisiológica de la función^{del circuito 16}. La electrofisiología extracelular multicanal resuelve la actividad de picos de las unidades neuronales y los potenciales de campo local con alta resolución temporal, pero no proporciona información sobre el estado de señalización de los^{astrocitos 15}. Sin embargo, ninguno de estos enfoques puede inducir simultáneamente un ictus fototrombótico localizado con precisión y realizar un registro multimodal desde el mismo sitio anatómico sin interrupción.

Para abordar las limitaciones técnicas existentes, proponemos este sistema integrado. Este sistema aborda las tres limitaciones dentro de un único dispositivo implantado crónicamente, permitiendo la inducción simultánea de fototrombosis, el registro astrocítico de calcio mediante fotometría de fibras y la electrofisiología neuronal multicanal en ratones despiertos y que se comportan libremente, desde el inicio del ictus hasta las fases crónicas del ictus. La viabilidad de este método se valida mediante la implantación crónica de un optrodo fabricado a medida en el cerebro de ratones que expresa un indicador de calcio específico para astrocitos y un vector viral optogenético. Mediante este método, los transitorios de calcio astrocítico y las actividades neuronales de disparo se registran y analizan simultáneamente durante las tareas conductuales y bajo modulaciones optogenéticas.

Protocolo

Este protocolo recibió la aprobación del Comité de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Medicina China de Guangzhou (00379474) y se llevó a cabo siguiendo las directrices y regulaciones diseñadas por la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Se implementaron todas las medidas posibles para minimizar el número de animales utilizados en este estudio.

1. Entrega de vectores virales

NOTA: Esta sección describe la inyección estereotáxica de vectores AAV específicos de astrocitos en la corteza motora (M1FL). El objetivo es lograr una expresión estable y específica para astrocitos tanto del indicador de calcio GCaMP6s como del constructo optogenético opto-vTRAP antes de la implantación del optrodo. Equipo principal requerido: marco estereotáxico, sistema digital vernier, micropipeta de vidrio y bomba de microinfusión.

1. Coloca el ratón en la cámara de inducción; Comienza la inducción de anestesia con isoflurano al 3%–4% y la concentración de isoflurano puede aumentarse hasta un máximo del 5% en el primer minuto hasta que el ratón no responda.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente anestésico volátil. Realiza todos los procedimientos bajo ventilación activa. Evita la exposición personal prolongada.
2. Transfiere el ratón al marco estereotáxico equipado con una mascarilla anestesiática y utilice isoflurano al 1–2% para mantener un plano anestésico profundo.
3. Comprueba la profundidad de la anestesia cada 10 minutos mediante el ritmo respiratorio, el reflejo palpebral y el pellizco en el dedo del pie. Mantén la temperatura corporal del ratón entre 36 y 37,5 °C con una almohadilla calefactante controlada por retroalimentación.
4. Aplica pomada oftálmica en los ojos para evitar daños en la córnea durante la cirugía.
5. Sujeta el ratón a un marco estereotáxico con barras para los oídos y una barra para la boca. Ajusta las barras para los oídos para asegurarte de que la cabeza del ratón está fijada simétricamente. Asegúrate de que la cabeza esté inmovilizada con un toque suave.
6. Elimina el vello a fondo con crema depilatoria y realiza una incisión en la línea media con tijeras quirúrgicas para exponer el cráneo. Limpia el periosteo usando suero fisiológico y hisopos de algodón para exponer el Bregma y el Lambda.
7. Baja la micropipeta de vidrio hasta tocar Bregma y Lambda sucesivamente; fíjate en la coordenada Z en el vernier digital. Ajusta la barra bucal para asegurarte de que la diferencia sea de <0,04 mm.
8. Baja la micropipeta de cristal para tocar Bregma y recoloca el vernier digital a cero. Mueve la micropipeta 2,3 mm hacia la izquierda y derecha del Bregma sucesivamente; fíjate en la coordenada Z en el vernier digital. Ajusta las barras para asegurar que las diferencias bilaterales sean de <0,04 mm.
9. Reinicia el vernier digital a cero en Bregma y marca la corteza motora (M1FL; AP: +1,5 mm, ML: +0,74 mm). Utiliza un microtaladro con brocas de 0,5 mm (punta redonda) para perforar un pequeño agujero de aproximadamente 0,5 mm de diámetro en la ubicación marcada. Taladrar con cuidado para evitar hemorragias y daños en el tejido cerebral; Deje caer solución fisiológica helada para compensar el calor generado durante el proceso de perforación.
10. Baja la micropipeta de cristal conectada a una bomba de microinfusión al sitio objetivo (DV: -0,94 mm desde la superficie cerebral). Antes de cargar, mezcla AAV9-GfaABC1D-GCaMP6 y AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP en volúmenes iguales para preparar una mezcla viral. Infundir 400 nL de la mezcla (200 nL de cada vector) a una tasa de 50 nL/min.
    NOTA: El cóctel viral contiene: 200 nL del indicador de calcio específico de astrocitos (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 10¹³ vg/mL) y 200 nL del vector viral optogenético específico de astrocitos (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). Se verificó la exitosa transducción específica de astrocitos en un subconjunto de animales mediante tinción por inmunofluorescencia para GFAP, confirmando la colocalización del reportero fluorescente con células positivas para GFAP y la ausencia de expresión en células negativas para GFAP.
    PRECAUCIÓN: Los vectores AAV son agentes biológicos recombinantes; gestionar todos los vectores virales y residuos bajo las directrices de bioseguridad de la institución.
11. Deja la pipeta en su sitio durante 10 minutos después de que termine la infusión para permitir una mejor difusión viral y evitar el reflujo de la infusión (reflujo de virus). Retira la pipeta lentamente, sutura el cuero cabelludo (4-0, 20 mm, 3/8 de círculo) y coloca el ratón sobre una almohadilla térmica hasta que se recupere completamente.
    NOTA: Se requiere un periodo de 3–4 semanas para una expresión viral óptima. La cronología detallada del protocolo se ilustra en la Figura 1A.

2. Inspección de Optrode y verificación funcional

NOTA: Antes de la implantación, el optrode fabricado a medida debe ser inspeccionado físicamente y probado ópticamente para confirmar que es capaz de suministrar luz en los tres modos funcionales (fototrombosis, estimulación optogenética y fotometría de fibras). Equipo principal requerido: microscopio, medidor de potencia óptica y fuentes láser a 532 nm, 488 nm, 470 nm y 405 nm.

1. Inspección física del optrode:
   1. Colocar el optrode fabricado bajo un microscopio para inspeccionar la disposición de los sitios de registro.
   2. Asegúrate de que los 16 microhilos de tungsteno estén agrupados uniformemente y rodeen la fibra óptica central. Revisa si hay cables doblados o cruzados que puedan causar cortocircuitos eléctricos.
   3. Confirma que la punta de la fibra óptica es más corta que la de los microhilos de tungsteno (Figura 1B).
      NOTA: La punta de la fibra óptica debe estar hundida entre 100 y 200 μm respecto a las puntas^{del electrodo 23}. Este desplazamiento, adoptado de Lee et ^al.22, asegura que el cono de luz cubra suficientemente el área de grabación mientras previene un ruido fotoeléctrico excesivo. Se anima a los investigadores a verificar empíricamente el desplazamiento adecuado bajo su propio optrode.
2. Conecta la fibra óptica a la fuente de modelado láser y a la fuente de grabación. Utilice un medidor de potencia óptica para medir la salida en la punta de la fibra para los siguientes tres modos funcionales (Figura 1B):
   1. Modo de modelado fototrombótico: Verificar que el sistema puede suministrar luz de onda continua (CW) de alta intensidad (532 nm).
      NOTA: En este experimento se utiliza fibra con NA 0,22. El diámetro estimado del punto iluminado entre 100 y 200 μm por debajo de la punta de la fibra es aproximadamente de 200 a 400 μm. Asegúrese de que la potencia en la punta alcance los >20 mW para garantizar la activación y formación exitosa del Rose Bengal.
   2. Modo de manipulación optogenética: Prueba la salida del láser pulsado (por ejemplo, 488 nm para opto-vTrap).
      NOTA: Calibrar la potencia a 10 mW en la punta; esto está optimizado para la activación opto-vTRAP a una profundidad de grabación de 0,94 mm en la corteza motora. Para otras regiones cerebrales, se recomienda la verificación conductual o electrofisiológica.
   3. Fotometría de fibra (registro de calcio): Prueba la luz de excitación de baja potencia (por ejemplo, 470 nm y 405 nm).
      NOTA: Asegúrese de que la salida sea estable y se mantenga en un nivel muy bajo (<50 μW) para minimizar la fototoxicidad y el fotoblanqueamiento del indicador de calcio (por ejemplo, GCaMP6s) durante el registro a largo plazo.

3. Implantación crónica de optrode

NOTA: Esta sección trata sobre el procedimiento quirúrgico para implantar crónicamente el optrode en el lugar de la inyección viral. La ubicación precisa de las coordenadas de inyección es fundamental para asegurar que los electrodos de registro y la fibra óptica muestreen la región de expresión de GCaMP6 y opto-vTRAP. Equipo principal requerido: marco estereotaxico, microtaladro, pinzas, tornillos para craneoplastia, gel de agarosa y cemento dental.

1. Para anestesia, fijación estereotáxica, preparación del cráneo y equilibrio, sigue el mismo procedimiento descrito en la sección 1, salvo que durante la incisión en el cuero cabelludo, retira 1,5 cm × 1,5 cm del cuero cabelludo asegurándose de que permanezca suficiente piel alrededor de los ojos.
2. Limpia el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina al 0,9%. Identifica Bregma y reinicia el vernier digital a cero.
3. Utiliza el taladro (0,8 mm, punta redonda) para enrugar ligeramente la superficie del cráneo y así permitir una mejor adherencia del cemento dental.
4. Marca la corteza motora con un marcador (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), luego úsalo como punto central para dibujar un cuadrado de 5 mm × 5 mm (Figura 1C).
   1. Usa un microtaladro a una velocidad adecuada (alrededor de 10.000 rpm) y traza el cuadrado. Deja caer solución fisiológica helada constantemente sobre la trayectoria de la perforación durante la perforación para compensar el calor producido por la perforación a alta velocidad y evitar daños en el tejido cerebral. Para inmediatamente si el colgajo óseo se afloja (Figura 1C).
5. Perfora tres pequeños agujeros (0,5 mm de diámetro) sobre el hemisferio contralateral y el cerebelo, e implanta tornillos de craneoplastia en los orificios. Asegúrate de que cada tornillo llegue a la duramadre madre, pero evita que penetre más y daños adicionales al tejido cerebral (Figura 1C).
6. Usa pinzas para quitar el colgajo óseo que se había aflojado antes. Evita cualquier fuerza adicional hacia abajo durante la extracción para evitar daños en el tejido cerebral y mantener intacta la duramadre.
   NOTA: Si ocurre algún sangrado, se puede usar una esponja hemostática para detener rápidamente el sangrado.
7. Utiliza pinzas con punta ultrafina (<0,03 mm × 0,01 mm) para eliminar la duramadre en la ventana craneal. Evita que la punta de las pinzas pellizque directamente cualquier tejido cerebral durante este proceso.
   NOTA: Después de extraer el hueso, es muy importante mantener el tejido cerebral húmedo. Se recomienda usar bolas de algodón estériles empapadas en solución salina para cubrir la ventana cuando no se realiza ningún procedimiento, con el fin de evitar inflamación y daños neuronales por sequedad.
8. Fija el optrode al brazo micromanipulador del marco estereotáxico y muévelo por encima de la ventana craneal. Entrelaza firmemente los cables de tierra plateada y de referencia del optrode a los tres tornillos de craneoplastia (Figura 1C).
9. Limpia la superficie craneal de la ventana con solución fisiológica estéril para asegurarte de que no haya sangrado ni coágulos que dificulten la inserción de electrodos. Baja lentamente el optrodo hasta la profundidad deseada (DV: -0,94 mm) a una velocidad de 1 μm/s.
   NOTA: El tejido cortical expuesto debe humedecer con solución salina estéril durante la implantación.
10. Aplicar una capa de agarosa sobre la ventana craneal tras la implantación para proteger el tejido cortical del cemento dental.
11. Aplica 3 o 4 capas de cemento dental para cubrir el cráneo expuesto, asegurando que todo el optrode esté anclado. Retirar el ratón del marco estereotáxico una vez que el cemento dental se ponga rígido (Figura 1C).
12. Administra analgesia durante 3–5 días y deja que el ratón se recupere durante 1–2 semanas antes de registrar y modelar.

4. Modelado fototrombótico y registro simultáneo

NOTA: Esta sección describe la habituación conductual, el registro basal, la inducción del ictus por fototrombosis y los procedimientos de registro longitudinal post-ictus. La fototrombosis se administra a través del optrodo implantado, mientras que se mantiene la electrofisiología simultánea y el registro de fotometría de fibras. Equipo principal requerido: aparato rotatorio, medidor de fuerza de agarre, sistema de fotometría de fibra, sistema de grabación neural multicanal, tinte Rose Bengal y fuente láser a 530 nm.

1. Haz que el ratón reciba entrenamiento conductual antes de modelar.
   NOTA: Todos los animales fueron alojados y analizados bajo condiciones de laboratorio estandarizadas. Condiciones de la vivienda: temperatura ambiente 20–25 °C, humedad relativa 50%–60%, en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad (luces encendidas a las 07:00). Los animales tuvieron acceso libre a comida y agua durante todo el estudio. Todas las pruebas y procedimientos quirúrgicos se realizaron durante la fase ligera. Durante la fase de luz, se realizaron sesiones de registro conductual a una hora constante cada día para minimizar la variación circadiana en la actividad neuronal y la dinámica del calcio astrocítico. El recinto de grabación también se mantenía a una temperatura ambiente de 20–25 °C.
   1. Para la prueba rotatoria, haz que el ratón trabaje continuamente sobre la varilla giratoria durante 5 minutos en 3 pruebas consecutivas, acelerando de 4 a 40 RPM en 5 minutos.
   2. Para la prueba de fuerza de agarre, haz que el ratón aprenda a tirar de la barra de prueba con las patas delanteras y complete tres ensayos consecutivos con resultados que fluctuen por debajo del 10%.
2. Establece los parámetros de adquisición de datos para la fotometría de fibra.
   1. Utiliza un sistema de fotometría de fibra de doble o triple longitud de onda para excitar el indicador de calcio (por ejemplo, GCaMP6s). Para GCaMP6, ajusta el canal de señal a 470 nm y el canal de control a 405 nm para corregir artefactos de movimiento y autofluorescencia.
      NOTA: Es muy importante volver a probar la potencia del láser de grabación para asegurar que la salida en la punta de la fibra esté entre 20 y 40 μW para evitar el blanqueamiento y la fototoxicidad.
   2. Establezca la tasa de muestreo de adquisición de datos entre 60 y 100 Hz, lo que será suficiente para capturar transitorios de calcio astrocíticos.
3. Establece los parámetros de adquisición de datos para la electrofisiología multicanal.
   1. Asegúrate de que todos los componentes del sistema de grabación (incluido el dispositivo para la prueba de fuerza de agarre y la jaula) estén correctamente conectados a tierra para reducir el ruido. Utiliza una referencia mediana común (CMR) durante la grabación para eliminar artefactos globales.
      NOTA: Es muy importante comprobar la vista del espectrograma de señal en el sistema de grabación para asegurarse de que no existe interferencia en la línea eléctrica y que el ruido causado por artefactos de movimiento se minimice. Artefactos de movimiento grandes pueden indicar fallo de los tornillos y la fijación del cable de tierra durante la cirugía de implantación.
   2. Asegúrate de que las señales de banda ancha y LFP estén seleccionadas en el software de grabación y monitoriza cualquier ruido que ocurra durante la sesión.
4. Realiza la grabación de base.
   1. Anestesiar brevemente con isoflurano (en un plazo de 60 s); Conecta el Optrode a la línea de grabación mediante un adaptador.
   2. Coloca al ratón en un entorno tipo jaula para grabar y deja que se aclimate durante 10 minutos tras despertar.
   3. Realiza la grabación simultáneamente con la prueba de fuerza de agarre, el ratón debe tirar de la barra de prueba una vez cada minuto durante 5 minutos.
   4. Asegurarse de que las pruebas de comportamiento estén con marca temporal precisa tanto en sistemas de fotometría multicanal como de fibra para permitir la alineación de datos (Figura 1D).
5. Establece un modelo fototrombótico.
   1. Administra una solución de colorante de Rose Bengal al 1,5% intraperitonealmente (i.p.) con una dosis de 10–20 mg/kg, y espera 5 minutos a que el contraste circule por la vasculatura cortical.
      PRECAUCIÓN: Rose Bengal es un tinte fotosensibilizante. Protege el reactivo de la luz ambiental brillante. Usa guantes y protección ocular al manipularlo.
   2. Anestesiar al ratón con isoflurano siguiendo los mismos parámetros de inducción y mantenimiento descritos anteriormente.
   3. Cuando el ratón está en un plano anestésico profundo y se mantiene con una mascarilla anestesia, conecta la sonda óptica del optrode a la fuente láser.
   4. Induce isquemia focal entregando un haz láser de 530 nm a 15 mW a través del optrodo implantado durante 5–8 minutos.
      PRECAUCIÓN: El láser de 530 nm a 15 mW es peligroso. Todos los investigadores deben llevar protección ocular de seguridad láser. Nunca mires directamente a la punta de la fibra durante la fototrombosis.
6. Realiza la grabación después del ictus.
   1. Coloca el ratón sobre una almohadilla calentante para recuperarte. Una vez que el ratón esté completamente despierto (normalmente en menos de 10 minutos), inicia la primera grabación aguda post-ictus.
   2. Repite el registro diario para monitorizar de cerca el progreso de la enfermedad.
7. Realizar manipulación optogenética.
   1. Además del registro de señales de calcio y la emisión del haz láser para inducción isquémica, el optrodo también es capaz de proporcionar estimulación optogenética, como se muestra en los resultados representativos (Figura 4).
   2. Conecta el optrode a un estimulador láser optogenético con la longitud de onda y potencia adecuadas (en este caso, es de 488 nm, 10 mW, 5 min para opto-vTrap), y enciende el estimulador para realizar la manipulación optogenética.

5. Pipeline de análisis de datos multimodal

NOTA: Esta sección describe el flujo de trabajo de análisis para procesar los datos de electrofisiología multicanal (clasificación por picos), señales de calcio astrocíticas (cálculo ΔF/F) y la alineación intermodal de los dos flujos de datos. Se requiere software: Plexon Offline Sorter (software de clasificación de picos offline), NeuroExplorer (software de análisis de datos neuronales) y software de análisis RWD OFRs (fotometría de fibra).

1. Clasificación de picos neuronales (Sistema plexón):
   1. Importa los archivos .pl2 en bruto al software offline de ordenación de picos. Aplica un filtro digital pasa banda alta (<300 Hz) para aislar la actividad de picos de alta frecuencia.
   2. Establece un umbral de tensión (normalmente -5 desviaciones estándar del ruido) para detectar picos de potencial.
   3. Tras el cribado manual y la invalidación de las formas de onda de ruido, se utiliza la función de escaneo en el software offline de clasificación de picos para realizar análisis de componentes principales (PCA) y agrupar las formas de onda y escanear diferentes cúmulos^{neuronales 24}.
   4. Inspecciona los histogramas de intervalos entre picos (ISI). Asegúrese de que cada "Unidad Única" tenga una tasa de violación de ISI del <1% (reflejando el periodo refractario). La tasa de violaciones del ISI se muestra en la esquina superior izquierda de cada unidad en el software de ordenación de picos fuera de línea.
   5. Exporta las marcas de tiempo ordenadas al software de análisis de datos neuronales. Utiliza el histograma de tasa y la función de perievento frente a tiempo en el software de análisis de datos neuronales para generar histogramas de tasa y histogramas de tiempo peri-estímulo (PSTH).
   6. Saca la longitud media de la forma de onda y la tasa media de disparo de cada unidad desde la sección estadística en el software de análisis de datos neuronales para un análisis más detallado.
2. Procesamiento de señales de calcio astrocítico (software de análisis de fotometría de fibras)
   1. Abre los datos de fluorescencia en bruto (canal de 470 nm para señal y canal de 410 nm para control de movimiento) en el software de análisis.
   2. En la sección de preprocesamiento del sistema de fotometría de fibra, realiza 410 nm como control para la corrección de movimiento, establece el coeficiente de suavizado en 8 y elige PLS Fit como corrección base.
   3. Calcula el cambio en la fluorescencia (ΔF/F) usando la fórmula²⁵:
      
   4. Realizar análisis de señales de calcio de astrocitos basándose en marcas temporales de eventos, extraer datos peri-eventos para visualización (por ejemplo, mapas de calor y trazas de medias) y calcular el área bajo la curva (AUC).
3. Correlación sincronizada astrocito-neurona
   1. Alinea los picos neuronales y las señales de calcio de los astrocitos usando la marca temporal del evento conductual compartido como tiempo cero.
   2. Tras extraer los datos peri-evento, alinea los dos flujos de datos a este tiempo compartido cero y visualiza la correlación astrocito-neurona (Figura 3).

Resultados

Cronología experimental

La Figura 1 resume la cronología experimental y los principales hitos quirúrgicos. Un intervalo de tres semanas entre la inyección viral y la implantación de optrodo es fundamental para lograr una expresión adecuada de GCaMP6s, y las señales robustas de calcio astrocítico deben confirmarse examinando las trazas de fotometría de fibras durante el periodo de registro inicial antes de la induc...

Discusión

El protocolo integrado descrito aquí presenta un avance significativo en el estudio de las interacciones astrocito-neuronas durante la progresión del ictus isquémico. Al combinar inducción fototrombótica con monitorización optoelectrofisiológica en tiempo real y manipulación optogenética, esta metodología conecta eficazmente el inicio del ictus y la observación de la reorganización a nivel de circuito de neuronas y astrocitos. Trabajos recientes de Boyce et al. demostraron la viabilidad ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice