Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.
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Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana
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Resumen
Resumen
La microscopía intravital permite la visualización directa de procesos celulares dinámicos dentro de tejidos intactos. Sin embargo, su aplicación a Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ha estado limitada por los requisitos de contención de Nivel de Bioseguridad 3 (BSL-3) y los desafíos técnicos de estabilizar el pulmón para la obtención de imágenes de alta resolución. Aquí presentamos un protocolo que combina la Ventana Torácica para la Imagen de Alta Resolución del Pulmón Murino (WHRIL) con mc2 7902,una cepa de MTB triple auxotrófica genéticamente definida y aprobada para su uso bajo condiciones BSL-2. También describimos la generación de mc2 8471, un derivado de expresión de tdtomate de mc27902, su preparación para infecciones intravenosas y su aplicación para imágenes intravitales en ratones reporteros. Este sistema permite la visualización en tiempo real de la dinámica temprana de la infección, incluyendo la rápida entrada bacilar en la vasculatura pulmonar, la agregación, la diseminación en el parénquima pulmonar y la captación de macrófagos en el mismo microambiente pulmonar durante los primeros 3 días tras la infección. Al permitir la imagen longitudinal de bacilos e interacciones huésped-patógeno a resolución unicelular, este enfoque supera limitaciones clave asociadas con los modelos convencionales de imagen y alta contención. Este protocolo proporciona una plataforma práctica compatible con BSL-2 para la obtención de imágenes intravitales en tiempo real de micobacterias atenuadas en el pulmón y sienta una base para estudios mecanicistas de fisiología bacteriana, reconocimiento de hospedadores y eliminación mediada por el sistema inmune.
Introducción
La microscopía intravital de alta resolución ha transformado el estudio del comportamiento celular dinámico dentro de tejidos intactos al permitir la visualización directa de la migración celular, las interacciones vasculares y la vigilancia inmunitaria a resolución unicelular 1,2,3,4. Aunque estos enfoques se utilizan ampliamente en la investigación delcáncer 3,5, su aplicación a infecciones pulmonares ha estado limitada por el movimiento respiratorio, la fragilidad tisular y las limitaciones de bioseguridad. Los avances recientes en plataformas de imagen torácica, incluyendo ventanas ópticas estabilizadas por vacío e implantadas permanentemente, han abordado muchos de estos desafíos técnicos proporcionando imágenes estables y libres de movimiento del microambiente pulmonar durante períodosprolongados 6,7,8,9,10 . Las ventanas implantables permanentemente, en particular, son herramientas poderosas, ya que permiten la visualización repetida del flujo vascular, la dinámica de las células inmunitarias y el comportamiento de células individuales durante horas o semanas, y han sido fundamentales para definir los mecanismos de la metástasis del cáncer, la permeabilidad vascular y la vigilanciainmunitaria 11,12.
A pesar de estos avances, la imagen intravital no se había aplicado previamente a la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en el pulmón in vivo de mamíferos con resolución unicelular. Los precedentes más cercanos provienen de la imagen intravital de infecciones micobacterianas en otros contextos. La imagen en tiempo real de la infección por Mycobacterium marinum en embriones de pezcebra 13 reveló interacciones tempranas de macrófagos e iniciación de granuloma, mientras que la imagen de dos fotones de granulomas inducidos por BCG en el hígado14,15 del ratón reveló la dinámica de macrófagos y células T durante el desarrollo del granuloma y demostró una presentación limitada de antígenos y función efectora de células T dentro de las lesiones granulomatosas. Estos estudios establecieron conocimientos fundamentales sobre las interacciones micobacteriano huésped-patógeno, pero no accedieron al pulmón intacto de losmamíferos 8,16.
También se han aplicado enfoques de imagen intravital al pulmón en otros contextos infecciosos y biológicos, incluyendo la imagen pulmonargeneral 8, estudios que revelan que patrullar macrófagos alveolares puede ocultar bacterias del sistemainmunitario 17 y caracterizan la respuesta mieloide inmediata a la infección por SARS-CoV-2 en el pulmónhumano 16. La imagen intravital se ha aplicado de forma similar a pulmones infectados con gripe, permitiendo la visualización directa del comportamiento dinámico de las células inmunitarias dentro del tejido pulmonarinfectado 18,19.
Los enfoques de imagen óptica de cuerpo entero utilizando la tecnología de excitación microendoscópicade fibra óptica 20 y fluorescencia de enzimasreporteras 21,22 han permitido la detección sensible de MTB en pulmones de ratón, pero no pueden detectar grupos individuales o pequeños de bacilos, rastrear la dinámica de agregación bacteriana ni visualizar interacciones directas entre micobacterias y células hospedadoras dentro del tejido pulmonar intacto. Se han implementado enfoques de imagen intravital de alta contención para pulmones infectados en entornos BSL-3, incluyendo la infecciónpor SARS-CoV-2 23 y las plataformas de imagen multifotónica centradas enMTB 24. Estos estudios demuestran la viabilidad de hacer imágenes de pulmones infectados bajo contención, pero estos sistemas siguen siendo técnicamente exigentes y no son ampliamente accesibles. El trabajo con MTB virulenta requiere contención de BSL-3, lo que plantea importantes desafíos de ingeniería y bioseguridad para la imagen intravital23,24. Como resultado, la mayoría de los estudios sobre la infección temprana por MTB se basan en ensayos estáticos que no pueden captar la dinámica espacial y temporal del comportamiento bacteriano dentro del pulmón.
El desarrollo de cepas de MTB triple auxotrófica definidas genéticamente y aprobadas por BSL-2 ofrece una oportunidad única para superar estas limitaciones. La cepa mc2 7902, un derivado de Mtb de H37Rv en un derivado de pantotenato-leucina-arginina, está completamente atenuada, no se replica en ratones inmunodeprimidos, conserva la tinción ácido-rápida clásica, presenta susceptibilidad normal a fagos y puede manipularse de forma segura fuera de las instalacionesBSL-3 25. Estas propiedades convierten almc2 7902 en un sustituto ideal para establecer enfoques de imagen intravital y sondear las interacciones tempranas huésped-patógeno bajo una reducción de contención de bioseguridad.
Aquí aplicamos la Ventana para Imágenes de Alta Resolución del Pulmón (WHRIL) con mc28471, un derivado fluorescente que expresa tdTomate de la cepa triple auxotrófica de Mtb mc27902, para visualizar la infección temprana de MTB en el pulmón murino intacto. Se realizaron experimentos enratones Rag2-/- inmunodeprimidos cruzados con ratonesMacBlue 27, en los que el promotor Csf1r impulsa la expresión de proteína fluorescente cian aumentada (ECFP) en monocitos, microglías y subconjuntos de células dendríticas y macrófagos. El transgen MacBlue permite una visualización clara de las poblaciones de fagocitos mononucleares durante la infección temprana por MTB. Optamos por utilizar ratones deficientes en Rag2 para centrar el sistema en las primeras interacciones innatas huésped-patógeno y para evitar la complejidad añadida de las respuestas inmunitarias adaptativas durante la corta ventana de imagen que se examina aquí. Es importante destacar que esta técnica no se limita a ratones deficientes en Rag2 y también puede realizarse en animales inmunocompetentes.
Al combinar una ventana pulmonar permanente con una cepa de MTB atenuada fluorescente compatible con BSL-2, esta plataforma permite la obtención de imágenes intravitales en serie de las interacciones bacili-célula huésped en el mismo microambiente pulmonar con resolución de célula única durante varios días. Aunque se ha demostrado aquí para la infección temprana, la plataforma en sí no está inherentemente restringida a puntos temporales tempranos y, en principio, podría aplicarse a etapas posteriores dependiendo del modelo experimental y el diseño del estudio. Dado que la aplicación exitosa de esta plataforma de imagen depende del uso de la preparación bacilar fluorescente específica descrita aquí, incluimos los pasos esenciales necesarios para generar y preparar ese reactivo como parte del protocolo completo. Esta plataforma proporciona imágenes directas y en tiempo real del comportamiento de las MTB in vivo y sienta una base para futuros estudios mecanicistas sobre fisiología bacteriana, reconocimiento del huésped y eliminación mediada por el sistema inmunológico.
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Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a las directrices institucionales de bioseguridad y cuidado animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Albert Einstein College of Medicine (IACUC). La cepa mc28471 es un transformador pYUB1169 de mc27902, una cepa Mtb triple auxotrófica aprobada para uso en BSL-2. Todo el trabajo relacionado con bacterias vivas se realizó utilizando las precauciones estándar para el manejo de las micobacterias.
1. Construcción de la cepa MTB tdTomato aprobada por la BSL-2 MC28471
- Generación de mc 2 8471 BSL-2 seguro para expresar tdtomatemediante transformación de plásmidos
- Transformar la cepa triple auxotrófica aprobada por BSL-2 mc27902 con el plásmido micobacteriano episómico pYUB1169, que contiene el gen tdTomato expresado del promotor G13, para generar el derivado fluorescente mc28471.
- Inocular 100 μL de mc2 7902(densidad óptica a 600 nm (OD600 nm) de 0,7-1,0) en 10 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado con enriquecimiento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato sódico (0,1 mM) y tiloxapol (0,05% (v/v)) en un frasco de tintero de 30 mL.
- Incubar el cultivo, agitando lentamente (100 rpm) a 37 °C hasta alcanzar un OD600 nm de 0,7-1,0.
- Transfiere las celdas a un tubo cónico de centrífuga de 15 mL y centrifuga durante 10 minutos a 3.000 x g a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender las células en 10 mL de glicerol estéril al 10% que contiene 0,05% (v/v) de tiloxapol (wash #1). Repito centrifugación y lavados dos veces. Resuspende el globo celular en 0,175 mL de glicerol al 10% que contiene 0,05% (v/v) de tyloxapol y añade 2 μL de ADN pYUB1169 (100-200 ng de ADN).
- Transfiere el mc27902 y el pYUB1169 a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Espera 10 minutos. Golpear la cubetas 2 a 3 veces para eliminar burbujas de aire y electroporar a 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, con una constante de tiempo de 20 ms, a temperatura ambiente.
- Añadir 1 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado con enriquecimiento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato sódico (0,1 mM) y tiloxapol (0,05% (v/v)) a la cubeta, y transfiere el contenido de la cubetas a un tubo cónico de centrífuga de 15 mL. Incuba el tubo mientras agitas a 37 °C durante la noche.
- Placa 0,1 mL de la mezcla de transformación sobre una placa de agar Middlebrook 7H10 complementada con enriquecimiento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sodio (0,1 mM) y kanamicina (20 mg/L). Centrifugar la mezcla de transformación restante, descartar 0,9 mL del sobrenadante y volver a suspender la pastilla celular en el sobrenadante residual. Coloca las células resuspendidas en una segunda placa de agar Middlebrook 7H10 que contenga los mismos suplementos y antibióticos. Incuba las placas a 37 °C durante 3–4 semanas. Las colonias rosas indican transformantes exitosos.
- Elige una colonia rosa aislada y cultivala a 37 °C, agitando lentamente, en 5 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado con enriquecimiento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sodio (0,1 mM), tiloxapol (0,05% (v/v)) y 20 mg/L de kanamicina en un frasco de tintero de 30 mL.
- Preparación del mc28471 para infección intravenosa
- Cultivar 10 mL de mc2 8471 a 37 °C, agitando lentamente, en Middlebrook 7H9 estéril suplementado con enriquecimiento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato sódico (0,1 mM), tiloxapol (0,05% (v/v)) y 20 mg/L de kanamicina en un frasco de tintero de 30 mL hasta la fase media logaritaria (OD600 nm debe estar entre 0,7 y 1,0).
- Transfiere las celdas a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga durante 10 minutos a 3.000 x g a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato que contenga 0,05% (v/v) de tyloxapol (PBS-T, lavado #1). Repito centrifugación y lavados dos veces. Resuspende el pellet de la célula en 4 mL de PBS-T y sonica las células a 100 W, 2x 1.000 J.
- Mide la densidad óptica del cultivo y dilúyela en PBS-T para una concentración final de 5 x 106 UFC por inyección, usando la conversión aproximada de que un OD600 nm de 1 corresponde a 1 x 108 UFC/mL. Debido a que esta relación puede variar según las condiciones de deformación y crecimiento, OD600 nm debe calibrarse empíricamente contra valores de CFU replacados para garantizar precisión y reproducibilidad.
2. Implantación permanente de ventana pulmonar en ratones para imagen intravital
- Prepara un ratón Rag2KO MacBlue para imágenes intravitales. En este estudio se utilizó un ratón macho de 10 semanas que pesaba 30 g. Sin embargo, ratones de ambos sexos, de entre 8 y 12 semanas de edad y dentro del rango de peso esperado para esa edad, son aptos para este procedimiento. Esta cepa expresa proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) en macrófagos sobre un fondo knockout Rag2 y fue generada cruzando ratones B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, Modelo RAGN12) con ratones Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J (Stock No. 026051).
- Implantar la Ventana para la Imagen de Alta Resolución del Pulmón (WHRIL) 24 horas antes de la infección bacteriana para proporcionar un acceso óptico estable al pulmón y permitir la recuperación antes de la imagen.
- Inducir anestesia con isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Confirma la profundidad adecuada de anestesia antes de comenzar cualquier procedimiento y vigila al animal durante la cirugía y la imagen para evitar dolor, malestar o compromisos respiratorios.
- Administrar analgesia preoperatoria: inyectar 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluida en 90 μL de PBS estéril por vía subcutánea.
- Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar el sequeo corneal durante la anestesia.
- Ata una sutura de seda 2-0 alrededor de la base de un catéter de 22G, dejando colas de ~2 pulgadas para asegurar el catéter.
- Intuba al ratón con el catéter atado con sutura. Visualiza la apertura traqueal mediante transiluminación y confirma la colocación usando un bulbo inflado (subida bilateral del pecho).
NOTA: Una intubación incorrecta puede causar traumatismo en las vías respiratorias o una ventilación inadecuada. Proceder solo después de confirmar la correcta colocación mediante la expansión bilateral del pecho. - Asegura el catéter de intubación atando la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico tras la intubación exitosa. Conecta el catéter al ventilador.
- Coloque al ratón en el decúbito lateral derecho sobre una plataforma quirúrgica calefactada para exponer el tórax izquierdo, y luego asegure las extremidades anteriores, traseras y la espalda con cinta adhesiva para mantener una posición estable durante todo el procedimiento.
- Reduce el isoflurano al 3% durante el resto de la cirugía. Elimina el vello del tórax superior izquierdo usando crema depilatoria.
- Prepara el campo quirúrgico con una solución antiséptica. Levanta la piel y realiza una incisión circular de 5-10 mm con un punzón de biopsia (33-35-SH) aproximadamente 7 mm a la izquierda del esternón y 7 mm por encima del margen subcostal, centrado sobre elespacio intercostal 6 a 7.
- Inspecciona el campo expuesto en busca de recipientes superficiales. Si es necesario dividirse un vaso visible, cauterizar ambos extremos para mantener la hemostasia. Retira el tejido blando que lo cubre para exponer claramente las costillas antes de entrar en la cavidad torácica.
- Agarra y eleva la sexta o séptima costilla con pinzas y perfora suavemente el músculo intercostal entre ellas usando tijeras microdiseccionadoras romas (lado redondeado mirando hacia el pulmón) para entrar en la cavidad torácica.
NOTA: Entra en la cavidad torácica de forma suave y con visualización directa para evitar lacerar el pulmón, los vasos intercostales o los tejidos circundantes. - Aplica breves y suaves ráfagas de aire comprimido en la abertura intercostal para desinflar transitoriamente la superficie pulmonar adyacente y separarla de la pared torácica antes de crear la abertura de la ventana.
- Coloca el punzón de biopsia sobre la herramienta de corte y guía la herramienta de corte a través de la abertura intercostal, manteniéndola paralela a la pared torácica. Haz un defecto circular de 5 mm en la caja torácica.
- Coloque una sutura de cordón de seda 5-0 ~1 mm del borde del defecto circular, pasando entre las costillas adyacentes para rodear la abertura.
- Coloca el marco de la ventana de modo que los bordes del defecto de la pared torácica encajen en la ranura del marco, luego aprieta y asegura la sutura de cordón para asegurar el marco en su sitio.
- Carga adhesivo de gel de cianoacrilato en una jeringuilla de 1 mL. Levanta suavemente el armazón para separarlo del pulmón y luego aplica una capa fina de adhesivo de cianoacrilato en la superficie inferior del armazón.
- Seca la superficie del pulmón usando un flujo continuo y suave de aire comprimido hasta que la superficie parezca mate.
NOTA: Utiliza solo un chorro de aire suave y evita el secado prolongado, ya que la fuerza excesiva o el secado excesivo pueden dañar la superficie pulmonar y afectar la adhesión de la ventana. - Utilizando presión espiratoria positiva (PEEP), infla el pulmón y luego pega la ventana al marco. Suelta el PEEP y mantén presión en el marco de la ventana durante 20-30 segundos.
NOTA: Un exceso de presión durante la inflación o la colocación del armazón puede dañar el pulmón o comprometer el sello. Aplica solo la presión mínima necesaria para lograr una aposición suave. - Coloque una segunda sutura de cordón de seda 5-0 a <1 mm del borde de la incisión cutánea. Mete la piel bajo el marco, asegúrate de que cualquier exceso de piel quede atrapada bajo el marco de la ventana o recortada, luego aprieta bien la sutura del cordón y átala con firmeza.
- Usando una pastilla al vacío, aplica una capa muy fina de adhesivo en la parte inferior del abrigo de 5 mm, raspando el exceso en el borde de un vidrio rectangular. De nuevo, seca la superficie pulmonar con un chorro continuo y suave de aire comprimido.
- Coloca el abrigo circular dentro del hueco del marco de la ventana en un ángulo poco profundo (~15°) sobre la superficie pulmonar. Aumenta brevemente la presión en las vías respiratorias para inflar el pulmón y luego gira el coverslip a una posición paralela para que la superficie pulmonar se oponga a la parte inferior del vidrio. Mantén una presión suave durante aproximadamente 25 segundos mientras el adhesivo se endurece, y luego desconecta la recogida de vacío del cubrecubre.
NOTA: Evita atrapar burbujas o aplicar exceso de adhesivo durante la colocación del coverslip, ya que cualquiera de las dos opciones puede reducir la calidad de imagen, alterar el sellado o dañar la superficie pulmonar. - Aplica una pequeña cantidad de cianoacrilato líquido en la interfaz entre el abrigo y el marco metálico para reforzar el sellado hermético.
- Coloca una aguja estéril en una jeringuilla de insulina de 1 mL. Inserta la aguja justo debajo del proceso xifoides y avanza hacia el hombro izquierdo a través del diafragma hacia la cavidad torácica. Aspira suavemente para eliminar el aire intratorácico residual.
NOTA: Avanza la aguja con cuidado para evitar perforar el pulmón, el corazón o los vasos principales. Aspira suavemente y solo hasta que se elimine el aire residual. - Apague el isoflurano y continúe ventilando con oxígeno al 100% hasta que una frecuencia respiratoria casi normal al despertar esté casi restablecida. No dejes al animal sin supervisión durante la recuperación. Si la respiración espontánea normal no se reanuda con rapidez, proporcionar cuidados de apoyo adecuados o eutanasiar según las directrices institucionales.
- Quita la sutura de sutura, extuba al ratón y colócalo en una jaula limpia y calentita para su recuperación. Vigila al animal hasta que esté completamente deambulado; Los ratones que no recuperan la respiración normal deben ser sacrificados según las directrices institucionales.
- Administrar analgesia postoperatoria: inyectar 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluida en 90 μL de PBS estéril por vía subcutánea.
3. Imagen intravital
- Permite que los ratones se recuperen tras la implantación de la ventana antes de la imagen. Realiza pruebas de imagen de 1 a 5 días después de la cirugía.
- Induce anestesia con isoflurano al 3% y luego mantente en 1,5% durante toda la imagen.
- Inserta el adaptador personalizado de placa de escenario y marco de ventana entre la piel y el borde exterior del marco de la ventana pulmonar y asegura una placa estándar de escenario para microscopio usando cinta adhesiva.
- Coloque el ratón con el adaptador personalizado de plato-ventana acoplado a la plataforma de traducción del microscopio. Mantener la temperatura corporal en ~37 °C usando una cámara de aire forzado con un circuito de retroalimentación del sensor de temperatura.
- Con el ratón en la placa del escenario, retira suavemente la piel alrededor del ojo en el lado de la inyección para exponer el canto medial e inyecta FITC-dextrán (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) retroorbitalmente para marcar la vasculatura.
- Obtener imágenes instantáneas, z-stack o time-lapse de la vasculatura pulmonar antes de la inyección bacteriana utilizando los siguientes parámetros.
- Para ajustes de microscopía confocal: Profundidad de bits: 12 bits, Tasa de fotogramas: 2 fps, Tamaño de imagen: 512 × 512 píxeles, Tamaño de píxel: 0,497 μm/píxel, 0,994 μm/píxel, Tamaño Z-step: 2 μm, Profundidad total Z: 50–70 μm, Promedia de fotogramas: 3, Velocidad de escaneo: 2 μs/píxel (977 líneas/s), Longitudes de onda de excitación láser: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Potencia láser en la muestra: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Filtros de detección: 430-470 nm (Azul), 505-540 nm (Verde), 575-675 nm (Rojo), Ganancias del detector: 800 V para Azul, 650 V Verde, 700 V Rojo, Diámetro estenopeica: 60 μm o 1 unidad Airy para 559 nm
- Para la microscopía multifotónica, se utilizan los mismos parámetros de imagen que los de la microscopía confocal, salvo que se utilizó un láser de excitación de 920 nm con una potencia láser de 25 mW en la muestra.
- Inyectar retroorbitalmente 5 x 106 UFC tdAtomo-expresando mc28471.
NOTA: Realizar inyecciones retro-orbitarias solo con el entrenamiento y la sujeción adecuados, ya que una técnica inadecuada puede causar lesiones oculares, sangrado o fallida administración del inóculo. - Adquirir imágenes instantáneas, z-stack y time-lapse de tuberculosis y células y vasculaturas marcadas con fluorescencia utilizando los parámetros de imagen en 3.6.1 y 3.6.2. Ajusta la ganancia de todos los detectores para maximizar la señal evitando la saturación del detector.
- Después de la imagen, apaga el isoflurano y retira el ratón del microscopio. Mantén al ratón caliente y vigila hasta que se recupere completamente.
- Repite las imágenes en los siguientes momentos tras la inyección de MC28471: 0-60 min, 6 horas y 3 días. En cada sesión de imagen, reinyecta FITC-dextrán (100 μL, retroorbitalmente) para visualizar la vasculatura y luego adquiere imágenes como se describe en los pasos 3.8-3.9.
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Resultados
Tras la electroporación y la selección de kanamicina, las colonias aisladasde mc2 8471 mostraron fluorescencia de un rojo brillante, confirmando una expresión estable de tdTomate. Los bacilos MC28471 se expandieron, se prepararon como una suspensión unicelular y se administraron por vía intravenosa a ratones portadores de WHRIL implantado quirúrgicamente. Se realizó una imagen intravital para visualizar la dinámica temprana de la infección por MTB en el microambient...
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Discusión
Esta plataforma aborda una verdadera brecha en la investigación de la tuberculosis al permitir la visualización directa de las interacciones entre bacilos y células huésped dentro del pulmón intacto de mamíferos bajo condiciones BSL-2. Las estrategias previas de imagen in vivo, incluyendo la detección óptica de cuerpo completo mediante excitación microendoscópicade fibra óptica 20, la imagen de fluorescencia con enzimareportera 21 ...
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Divulgaciones
Los autores declaran no existir intereses financieros en competencia ni otros conflictos de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: AI26170; La Fundación Familiar Evelyn-Lipper y el Centro Biofotónico Gruss Lipper. Agradecemos el apoyo del Centro de Imagen Analítica, apoyado por la subvención P30 del Centro de Cáncer del NCI CA013330.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Inyección de 10 μL de buprenorfina (solución madre de 0.3 mg/mL) diluida en 90 μL de PBS estéril (dosis final = 0.1 mg/kg) |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | Para agarrar y elevar la costilla durante el procedimiento de implantación de la ventana pulmonar |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | Para monitorear el volumen tidal del ratón mediante intubación durante la cirugía |
| Plasmid pYUB1169 | Plasmid hecho a medida | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | Plataforma quirúrgica multifuncional para ratones, con calentamiento |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
Referencias
- Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
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