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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
En pacientes con lesión medular (LME), la regulación alcista de CASC11 se asocia con la gravedad de la lesión. In vitro, la regulación a la baja de CASC11 alivió la apoptosis y la inflamación, lo que sugiere una asociación con el eje miR-130b-5p/SPP1 . Estos resultados sugieren el posible papel de CASC11 como candidato a biomarcador en la patogénesis de la LME.
La lesión medular (LME) es un traumatismo grave del sistema nervioso central. Este estudio monocéntrico, observacional e in vitro , investigó el potencial diagnóstico de CASC11 y su posible mecanismo regulador en LME utilizando muestras clínicas de suero y modelos celulares estimulados con lipopolisacáridos. Los niveles de CASC11, miR-130b-5p y SPP1 se midieron mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR). Las funciones celulares y las relaciones de direccionamiento se evaluaron mediante el kit de recuento celular 8 (CCK-8), citometría de flujo, western blot, ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA), reportero dual-luciferasa y ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP). CASC11 se expresó fuertemente en LME y se asoció con inflamación como posible biomarcador diagnóstico. En células PC-12 tratadas con lipopolisacáridos (LPS), el silenciamiento de CASC11 alivió la actividad celular suprimida, la apoptosis y la inflamación, que fueron revertidas por el inhibidor de miR-130b-5p. Estos hallazgos sugieren que CASC11 está asociada con la gravedad de la LM, mientras que los datos in vitro indican su implicación en respuestas inflamatorias y apoptóticas a través del eje CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . Este estudio está limitado por su diseño de centro único y la falta de validación in vivo .
La lesión medular (LME) denota un trastorno sistémico temporal o permanente que surge de daño medular causado por fuerzas externas o enfermedades, que resulta en un deterioro de las funciones motoras, sensoriales, reflejas y del sistema nerviosoautónomo 1,2. Los pacientes frecuentemente se enfrentan a déficits y complicaciones funcionales físicas de por vida, lo que impone un sufrimiento y cargas considerables a individuos y familias. La etiología de la LME se clasifica ampliamente en orígenes traumáticos y notraumáticos 3. Las lesiones traumáticas, principalmente derivadas de fracturas de columna debido a fuerzas externas como accidentes de tráfico, caídas desde altura e incidentes deportivos, representan un desafío creciente en el manejo clínico de laLME 4. Mientras tanto, la cascada de lesiones secundarias iniciada tras la lesión primaria, especialmente la desregulación de la respuesta inflamatoria y la apoptosis neuronal, se consideran factores cruciales que contribuyen al deterioro continuo de la función neurológica. Estudios recientes han destacado el papel fundamental de la neuroinflamación, la regeneración y la recuperación funcional en la fisiopatología y reparación de laLME 5. Como respuesta secundaria central, la neuroinflamación desempeña un doble papel en el proceso de lesión y reparación tisular. Dada la limitada capacidad regenerativa de la médula espinal lesionada, se requiere un enfoque terapéutico sinérgico que combine tratamiento antiinflamatorio, trasplante celular, rehabilitación e intervencionesmoleculares 6. Aunque se han establecido diversas estrategias diagnósticas y terapéuticas para la LME, la práctica clínica actual depende predominantemente de exámenes de imagen. Sin embargo, estas técnicas están limitadas por sus altos requisitos de equipos avanzados, estrictos requisitos previos para los pacientes y gastos financierosconsiderables. Por ello, existe una necesidad urgente y no satisfecha de un biomarcador de laboratorio conveniente, preciso y no invasivo. La identificación de dicho marcador permitiría un diagnóstico temprano de la LME sin alterar los protocolos de tratamiento convencionales, facilitando así el desarrollo de intervenciones terapéuticas más oportunas y efectivas.
El ARN largo no codificante (lncRNA) representa una categoría principal de moléculas funcionales de ARN que, a pesar de carecer de potencial codificante proteico, son parte integral de una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la regulación de la inflamación y laapoptosis 9. Los LncRNA actúan como esponjas moleculares para los microARN (miARNs), impidiendo así que estos miARN se unan y silencien sus ARNmobjetivo 10. Por ejemplo, el ARN lncRNA MAGI2-AS3 media el miR-223-3p para acelerar la cicatrización defracturas 11. Dirigirse a la red de ARNlnc OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 presenta un enfoque terapéutico prometedor para mejorar la recuperación en la SCI12. CASC11, caracterizado por un transcrito de 872 pb situado en el cromosoma 8q24.21, es reconocido como una molécula con expresión desregulada en varios cánceres humanos13. CASC11 muestra expresión positiva en pacientes con osteoporosis posmenopáusica y tiene la capacidad de diferenciar a los pacientes afectados de los controlessanos 14. Además, CASC11 muestra un patrón de regulación al alza y potencial terapéutico similar en pacientes confracturas 15. Según estos informes, CASC11 podría regular las respuestas inflamatorias y la actividad celular. A pesar de estos datos, el patrón de expresión y el papel biológico de CASC11 en la LM siguen siendo completamente desconocidos. Dado que la hiperinflamación y la apoptosis son los principales factores de la LME secundaria, planteamos la hipótesis de que CASC11 podría ser un biomarcador candidato y factor regulador en la LME. Este estudio investigó la asociación clínica y el potencial biomarcador de CASC11 en LME analizando cohortes de pacientes y modelos celulares in vitro (Figura 1). Además, exploramos un posible mecanismo molecular de CASC11, incluyendo su posible papel en la modulación de la respuesta inflamatoria posterior a la LME.
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Matrícula de asignaturas
Los pacientes con traumatismo medular agudo (n = 300) tratados en el hospital entre enero de 2023 y mayo de 2025 fueron seleccionados y clasificados en el grupo de lesión medular completa (CSCI) (grado A, n = 98), grupo de lesión medular incompleta (ISCI) (grados B, C y D; n = 95) y grupo de función neurológica normal (NNF) (grado E, n = 107) según la Escala de Deterioro de la Asociación Americana de Lesiones Espinales (clasificación AIS). En pacientes del grupo NNF, la evidencia radiológica de LME, como edema, contusión o compresión, fue confirmada mediante resonancia magnética (IRM), pero no se demostraron déficits sensoriales ni motores. Otros 90 participantes sanos reclutados durante el mismo periodo fueron seleccionados como grupo control. Los criterios de inclusión fueron: (1) diagnóstico de LME confirmado por imagen (RM o TC), de acuerdo con las directrices de manejo clínicoestablecidas 16; (2) traumatismo sufrido en las 24 horas previas al ingreso hospitalario; y (3) participantes adultos con datos clínicos completos. Los criterios de exclusión fueron: (1) antecedentes de cirugía previa relacionada con fractura o LME; (2) enfermedad coronaria grave o enfermedad cardiopulmonar significativa; (3) lesión craneocerebral aguda y grave; y (4) tumores malignos, enfermedades cardiovasculares/cerebrovasculares o enfermedades inmunes. Se obtuvo la aprobación para este estudio del Comité de Ética del Cuarto Hospital Popular de Shenzhen, y se obtuvo el consentimiento informado de los sujetos. Los procedimientos utilizados en este estudio se ajustaron a los principios de la Declaración de Helsinki.
Colección de ejemplares
Se recogieron muestras de sangre venosa (5 mL) de los participantes al ingresar utilizando tubos separadores séricos dentro de las 24 horas posteriores a la lesión. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugó a 3.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El suero sobrenadante fue cuidadosamente separado, aliquotado en microtubos libres de RNasa y almacenado a -80 °C hasta un análisis posterior.
Cultivo celular e inducción de LPS
Se cultivaron células feocromocitomas de rata (PC-12) y microgliales murinas (BV-2) en el medio modificado Eagle de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero fetal bovino a 37 °C. Para establecer modelos de lesión inflamatoria in vitro , las células PC-12 y BV-2 se expusieron a lipopolisacáridos (LPS) en concentraciones de 0, 1, 5 y 10 μg/mL durante 12 horas17. Cada concentración se probó en tres réplicas biológicas independientes.
RT-qPCR
Se aisló ARN total de las muestras mediante un protocolo de extracción de fenol-cloroformo, seguido de precipitación con isopropanol. La pureza del ARN se evaluó mediante espectrofotometría, y se utilizaron muestras con una relación A260/280 nm dentro del rango de 1,8–2,1 para análisis posteriores. El ARN se transcribía inversamente en cDNA según el protocolo del kit de transcripción inversa, y el cDNA resultante se utilizaba como plantilla para las reacciones RT-qPCR con un premix SYBR Green en un instrumento PCR. La gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como gen de referencia para el ARNm CASC11 y SPP1 , y el ARN nuclear pequeño (U6) se utilizó como gen de referencia para miR-130b-5p. Para las muestras de suero, se inyectó cel-miR-39 sintético en el suero antes de la extracción de ARN para controlar las variaciones en la recuperación de ARN. Los cebadores eran los siguientes: CASC11 adelante 5'-ACCCTATGGAGAACCAGAC-3' y hacia atrás 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p hacia adelante 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' y hacia atrás 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; y SPP1 hacia adelante 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' y hacia atrás 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. La expresión se calculó usando el método 2-ΔΔCt . Cada reacción RT-qPCR se realizó en réplicas técnicas triplicadas con tres réplicas biológicas.
Transfección
El SIL11 (si-CASC11), el miMómic/inhibidor miR-130b-5p, el plásmido de sobreexpresión de SPP1 (ov-SPP1) y sus respectivos controles negativos (NC) fueron sintetizados y transfectados en células PC-12 y BV-2 utilizando un reactivo de transfección. La eficiencia de la transfección se evaluó 48 horas después de la transfección en réplicas biológicas triplicadas.
Ensayo de proliferación y apoptosis
Para el ensayo de viabilidad celular, las células se sembraron en placas de 96 pozos a 5 × 103 células por pozo y se cultivaron durante 24 horas para permitir su inserción. Tras esta incubación, se dispensaron 10 μL de reactivo CCK-8 en cada pozo, seguidos de una incubación de 2 horas a 37 °C. La densidad óptica se registró entonces a 450 nm con un lector de microplacas. Para la detección de apoptosis, se desprendieron células con tripsina, se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se suspendieron en un tampón de unión hasta una concentración final de 1 × 106 células por pozo. A continuación, se introdujeron 100 μL de la suspensión en un tubo de citometría de flujo de 5 mL, seguido de la adición de 5 μL de Annexin V-FITC y una solución de tinción de 5 μL con yoduro propidio (PI). Las muestras se mezclaron suavemente y se conservaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. A continuación, se añadió un tampón de unión a un volumen adicional final de 400 μL por tubo, y las células apoptóticas se cuantificaron mediante citometría de flujo. Todas las condiciones se analizaron utilizando tres réplicas técnicas en tres experimentos biológicos independientes.
Ensayo de actividad dual-luciferasa
Los objetivos posteriores de CASC11 y miR-130b-5p se predijeron a través de sitios web de bioinformática (lncRNASNP2 y TargetScan). Los fragmentos que contenían las secuencias complementarias de tipo salvaje (wt) o mutantes (mut) fueron sintetizados y clonados en un vector reportero dual-luciferasa para construir plásmidos reporteros wt y mut. Las células PC-12 se sembraron y co-transfectaron con miR-130b-5p imitador/inhibidor y los plásmidos wt/mut construidos utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos. Tras 48 horas, se cuantificó la actividad de la luciferasa para evaluar la interacción. Cada grupo consistía en tres réplicas técnicas y tres réplicas biológicas.
Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)
El DEP se realizó utilizando un kit de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARN. Las células se lisaron con tampón de lisis e incubaron con anticuerpos anti-Ago2 o anticuerpo IgG normal. Los complejos ARN-proteína se enriquecieron mediante perlas magnéticas. Tras el lavado, se retiraron las proteínas unidas y se aisló ARN inmunoprecipitado. Los niveles de enriquecimiento de CASC11 y miR-130b-5p fueron cuantificados por RT-qPCR. Cada grupo consistía en tres réplicas técnicas y tres réplicas biológicas.
Western blot
Se prepararon lisados proteicos a partir de células PC-12 y BV-2 utilizando tampón de lisis celular, y el contenido total de proteínas se midió mediante un ensayo BCA. Para cada muestra, se cargaban 30 μg de proteína en geles SDS-PAGE al 12% y se transferían a las membranas PVDF tras la separación electroforética. Las membranas se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente en leche desnatada al 5% diluida en TBST y luego incubadas durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Bcl-2, Bax, caspasa-3 escindida y GAPDH a una dilución de 1:1.000. Tras el lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales proteicas se analizaron mediante software de análisis de imágenes, y se emplearon densidades de bandas para evaluar la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis. Los experimentos con western blot incluyeron tres réplicas biológicas, con tres réplicas técnicas para cada grupo.
ELISA
Las concentraciones de citocinas inflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 en suero del paciente y en los supernadantes de células PC-12 y BV-2 se cuantificaron utilizando kits ELISA según las instrucciones del fabricante. Las muestras se incubaron en pozos prerecubiertos y se añadieron anticuerpos de detección para una incubación posterior. Se añadieron y incubaron conjugados enzimáticos. Tras el lavado, se añadieron sustratos para el desarrollo del color y las reacciones se terminaron. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas y se convirtió en concentraciones de factores inflamatorios según la curva estándar proporcionada. Cada ensayo ELISA se realizó en réplicas técnicas triplicadas a través de tres réplicas biológicas independientes.
Análisis estadístico
Las variables continuas se reportaron como la media ± desviación estándar (DS), y las variables categóricas se presentaron como números y porcentajes (n, %). Se realizaron comparaciones entre dos grupos utilizando la prueba t de Student. Para comparaciones que involucraron a más de dos grupos, se aplicó el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por la prueba post-hoc de Tukey. Se evaluó la capacidad de CASC11 para discriminar entre grupos clínicos mediante análisis de curvas de características operativas del receptor (ROC). Las asociaciones entre dos variables se examinaron mediante análisis de correlación de Pearson. Para experimentos basados en células, cada grupo contenía tres réplicas biológicas independientes, y cada medición se repetía en tres réplicas técnicas. La significación estadística se definió como P < 0,05.
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Datos básicos de los sujetos
Las características basales de los pacientes en los grupos Control, NNF, ISCI y CSCI se presentan en la Tabla 1. El análisis estadístico no reveló diferencias significativas entre grupos en variables, como sexo, edad, índice de masa corporal (IMC), etiología de la lesión y tiempo de la lesión (P > 0,05). Se observaron diferencias significativas entre los cuatro grupos en cuanto a la duraci...
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La LM es una condición devastadora del sistema nervioso central que con frecuencia provoca déficits significativos en la sensibilidad, el control motor y la función autónoma, disminuyendo sustancialmente la calidad de vida del paciente y su pronósticoa largo plazo 18. Los pacientes pueden presentar deterioro funcional y pérdida sensorial tras un traumatismo espinal, y se pueden emplear estudios de imagen (como la resonancia magnética) para evaluar la aparición de ...
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Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.
No es aplicable.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BCA protein assay kit | Yeasen, China | P0010 | |
| CCK-8 solution | Sigma-Aldrich, USA | 96992 | |
| Vector reporter dual-luciferasa | Promega, USA | E133A | vector pmirGLO |
| Medio de Eagle modificado de Dulbecco’s | ATCC, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Kit ELISA para IL-1β | R&D Systems, USA | DY401 | |
| Kit ELISA para IL-6 | R&D Systems, USA | HS600B | |
| Kit ELISA para TNF-α | R&D Systems, USA | DTA00C | |
| Suero fetal bovino | Gibco, Grand Island, NY, USA | 10099141 | |
| Flujómetro | BD FACSCalibur, USA | FACS101 | |
| Software de análisis de imágenes | NIH, Bethesda, MD, USA | versión 1.44p | software ImageJ |
| Isopropanol | Fábrica de Química de Beijing, China | 32064 | |
| Reactivo de transfección basado en lípidos | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| Lipopolisacárido | Sigma-Aldrich, USA | L2880 | |
| Tampon de lisis | Beyotime, China | P0013D | tampon de lisis RIPA |
| Lector de microplacas | Reagen, China | RNE90002 | |
| Células PC-12 y BV-2 | ATCC, Manassas, USA | ||
| Reactivo de fenol-cloroformo | Thermo, USA | 15596026 | reactivo Trizol |
| Kit de transcripción inversa | Takara, Japón | RR047A | Kit PrimeScript RT |
| Kit de inmunoprecipitación de proteínas que se unen al ARN | Millipore, USA | 17-700 | Kit Magna RIP |
| Microtubo libres de RNase | Axygen, Corning, NY, USA | MCT-150-C-S | |
| Tubos separadores de suero | Terumo, Tokyo, Japón | VP-AS109K60 | |
| Software de análisis estadístico | San Diego, USA | versión 9.0 | GraphPad Prism |
| Premezcla SYBR Green | Takara, Japón | RR420A | Premezcla SYBR Ex Taq |