Un sistema microfluídico para modelar la disfunción endotelial bajo esfuerzo fisiológico combinado de cizalladura pulsátil e hiperglucemia oscilatoria

Summary

Aquí presentamos un protocolo para fabricar y operar un sistema microfluídico que expone a las células endoteliales a hiperglucemia oscilatoria sincronizada y a estrés de cizalladura pulsátil. Este enfoque proporciona un modelo in vitro fisiológicamente relevante para estudiar la disfunción endotelial diabética. Este protocolo permite la medición cuantitativa del estrés oxidativo y las respuestas de las células endoteliales.

Abstract

La disfunción endotelial en complicaciones vasculares diabéticas implica interacciones complejas entre alteraciones metabólicas, específicamente glucosa oscilatoria (OG) y estrés cortante pulsátil (PSS). Aunque estos factores se han investigado de forma aislada, los modelos convencionales siguen limitados a una glucosa alta estática o al flujo laminar simplificado, careciendo de la capacidad de imitar el acoplamiento espaciotemporal integrado que se encuentra en la vasculatura diabética. Al utilizar una plataforma microfluídica programable, este protocolo proporciona una valiosa plataforma para investigar los efectos integrados de la hiperglucemia oscilatoria sincronizada y el PSS fisiológico sobre las células endoteliales. Este protocolo tiene como objetivo modelar la disfunción endotelial bajo condiciones metabólicas y mecánicas acopladas fisiológicamente relevantes. El uso de un chip de polidimetilsiloxano (PDMS) combinado con un sistema de control basado en presión permite la modulación precisa e independiente de las formas de onda del flujo y los perfiles de concentración de glucosa. La fidelidad hemodinámica del sistema se valida mediante la Velocimetría de Imagen de Micropartículas (Micro-PIV), mientras que la respuesta celular se caracteriza cuantitativamente mediante el monitoreo de los niveles de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS) y la viabilidad celular. Los resultados representativos demuestran que el PSS fisiológico atenúa eficazmente el daño oxidativo inducido por el OG. Este efecto se demuestra mediante la reducción de los niveles intracelulares de ROS y la mejora de la viabilidad celular bajo condiciones de estimulación combinada. Dependiendo de la pregunta de investigación, se pueden ajustar parámetros como los patrones de esfuerzo cortante, las frecuencias de oscilación de glucosa y las geometrías de los canales. Este método sirve como una herramienta versátil para estudios mecanicistas de vías mecanobiológicas y cribado de fármacos para intervenciones terapéuticas en enfermedades vasculares diabéticas.

Introduction

La disfunción endotelial es un evento crítico temprano en el desarrollo de complicaciones vasculares diabéticas, impulsado tanto por alteraciones metabólicas como por fuerzas hemodinámicas^{anormales 1,2}. Los niveles de OG, más que la hiperglucemia sostenida por sí sola, se reconocen cada vez más como potentes inductores del estrés oxidativo y la señalización inflamatoria en las células endoteliales, lo que conduce a lesiones vasculares y homeostasis^{deteriorada 3,4,5}. Simultáneamente, e....

Protocol

Declaración ética:

NOTA: Todos los reactivos, dispositivos y software utilizados en este protocolo se listan en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de chips microfluídicos

1. Utilizar software de diseño asistido por ordenador (CAD) para diseñar la estructura del chip microfluídico (Ancho x Larg x Alto = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) y fabricar el molde maestro SU-8 a través de una empresa comercial.
2. Mezcla el agente de curado PDMS y el prepolímero en una proporción de 10:1 en peso en una taz....

Results

Validación micro-PIV del campo de flujo dentro del canal microfluídico
La Figura 1D ofrece una visión general de la plataforma microfluídica utilizada para investigar las respuestas endoteliales a la estimulación metabólica y mecánica acoplada. El sistema integra un chip microfluídico PDMS de canal recto con un módulo de control de flujo impulsado por presión, lo que permite la aplicación de la condición OG junto con PSS fisiológica. Se .......

Discussion

El sistema microfluídico descrito aquí proporciona una plataforma robusta y fisiológicamente relevante para investigar los efectos integrados de la OG y la PSS en la función de las células endoteliales. La principal ventaja de este método radica en su capacidad para controlar y desacoplar con precisión estímulos mecánicos y bioquímicos dentro de un microentorno definido. A diferencia de los cultivos estáticos convencionales que carecen de fuerzas hemodinámicas o de modelos animales que a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% de tripsina-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Disociación celular
Jeringuilla de 1 mL	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1 mL	Inyectar fluido
Plato de cultivo de 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Cultivo celular
90 y grados Conector de acero inoxidable en ángulo	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1,3 mm	Dispositivo de sellado de adaptador
Software AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software de diseño asistido por ordenador
Botella de vidrio boronizado	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Doble paso 100 mL	Embalse
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	BYT-C2015	Tinción
Incubadora celular	ESCO	Esco CelMate	Cultivo celular
CellROX Rojo Profundo	Invitrogen	C10422	Tinción
D-glucosa	Sigma Aldrich	47249	Glucosa
D-mannitol	Macklin	M813423	Equilibrar la presión osmótica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software de análisis PIV
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	14190-094	Medio
Fibronectina	Sigma Aldrich	F-2006	Adhesión celular
Micropartículas fluorescentes	Termo Científica	G0100	Micro-PIV
Cubierta de vidrio	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Chip microfluídico
DMEM con glucosa alta	Solarbio	12100	Medio
Cámara de alta velocidad	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software de procesamiento de imágenes
Microscopio de fluorescencia invertida	Olimpo	IX73	Viabilidad celular
Microscopio de fluorescencia invertida	Olimpo	IX83	Observación y adquisición
DMEM bajo en glucosa	Solarbio	31600	Medio
Origen	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software de análisis de datos y gráficos
PDMS	Dow Inc.	184	Chip microfluídico
Penicilina/estreptomicina (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medio
Suero tampón de fosfato (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Cultivo celular
Limpiador de plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip microfluídico
Sistema de control de presión programable	Elvesys	OB1 MK4	Control de flujo
Tubo de silicona	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Molde maestro SU-8	Grupo Boao Biology Co. Ltd.	N/A	Chip microfluídico
Controlador de válvulas	Elvesys	MUX Wire V3	Control de flujo