Un sistema microfluídico para modelar la disfunción endotelial bajo esfuerzo fisiológico combinado de cizalladura pulsátil e hiperglucemia oscilatoria

Summary

Aquí presentamos un protocolo para fabricar y operar un sistema microfluídico que expone a las células endoteliales a hiperglucemia oscilatoria sincronizada y a estrés de cizalladura pulsátil. Este enfoque proporciona un modelo in vitro fisiológicamente relevante para estudiar la disfunción endotelial diabética. Este protocolo permite la medición cuantitativa del estrés oxidativo y las respuestas de las células endoteliales.

Abstract

La disfunción endotelial en complicaciones vasculares diabéticas implica interacciones complejas entre alteraciones metabólicas, específicamente glucosa oscilatoria (OG) y estrés cortante pulsátil (PSS). Aunque estos factores se han investigado de forma aislada, los modelos convencionales siguen limitados a una glucosa alta estática o al flujo laminar simplificado, careciendo de la capacidad de imitar el acoplamiento espaciotemporal integrado que se encuentra en la vasculatura diabética. Al utilizar una plataforma microfluídica programable, este protocolo proporciona una valiosa plataforma para investigar los efectos integrados de la hiperglucemia oscilatoria sincronizada y el PSS fisiológico sobre las células endoteliales. Este protocolo tiene como objetivo modelar la disfunción endotelial bajo condiciones metabólicas y mecánicas acopladas fisiológicamente relevantes. El uso de un chip de polidimetilsiloxano (PDMS) combinado con un sistema de control basado en presión permite la modulación precisa e independiente de las formas de onda del flujo y los perfiles de concentración de glucosa. La fidelidad hemodinámica del sistema se valida mediante la Velocimetría de Imagen de Micropartículas (Micro-PIV), mientras que la respuesta celular se caracteriza cuantitativamente mediante el monitoreo de los niveles de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS) y la viabilidad celular. Los resultados representativos demuestran que el PSS fisiológico atenúa eficazmente el daño oxidativo inducido por el OG. Este efecto se demuestra mediante la reducción de los niveles intracelulares de ROS y la mejora de la viabilidad celular bajo condiciones de estimulación combinada. Dependiendo de la pregunta de investigación, se pueden ajustar parámetros como los patrones de esfuerzo cortante, las frecuencias de oscilación de glucosa y las geometrías de los canales. Este método sirve como una herramienta versátil para estudios mecanicistas de vías mecanobiológicas y cribado de fármacos para intervenciones terapéuticas en enfermedades vasculares diabéticas.

Introduction

La disfunción endotelial es un evento crítico temprano en el desarrollo de complicaciones vasculares diabéticas, impulsado tanto por alteraciones metabólicas como por fuerzas hemodinámicas^{anormales 1,2}. Los niveles de OG, más que la hiperglucemia sostenida por sí sola, se reconocen cada vez más como potentes inductores del estrés oxidativo y la señalización inflamatoria en las células endoteliales, lo que conduce a lesiones vasculares y homeostasis^{deteriorada 3,4,5}. Simultáneamente, el esfuerzo de cizallamiento hemodinámico es un determinante principal del fenotipo endotelial, ya que la PSS en condiciones de ejercicio fisiológico promueve la producción de óxido nítrico, la defensa antioxidante y la protección^{vascular 6,7,8}. Por lo tanto, comprender los efectos integrados de la hiperglucemia oscilatoria y la estimulación hemodinámica es esencial para dilucidar los mecanismos de la disfunción endotelial.

Los modelos in vitro convencionales, que a menudo se basan en condiciones estáticas de alta glucosa o en un flujo laminar simplificado, no logran replicar la compleja y dinámica interacción entre las señales metabólicas y mecánicas presentes in^{vivo 9,10,11}. Aunque los modelos animales capturan aspectos sistémicos de la diabetes, carecen de la resolución a nivel celular necesaria para diseccionar la señalización bajo condiciones microambientales^{controladas 12}. La tecnología microfluídica ofrece una alternativa eficaz, proporcionando un control espaciotemporal preciso de estímulos bioquímicos y biomecánicos en geometrías fisiológicamente^{relevantes 13}, y ha impulsado avances recientes significativos en diversas aplicaciones biomédicas^{innovadoras 14,15}. Por ejemplo, Chen et ^al.16 diseñaron un dispositivo microfluídico con esfuerzo cortante espacial y temporal de pared y señalización ATP para estudiar la dinámica intracelular de Ca²⁺ en células endoteliales. Yu et ^al.11 desarrollaron un sistema de chip microfluídico hemodinámico para detectar las respuestas celulares bajo diferentes combinaciones de PSS fisiológico y concentraciones altas de glucosa. Aunque estos sistemas se han utilizado para estudiar las respuestas endoteliales a la tensión cortante o a perturbaciones metabólicas de un solo factor, pocos han conseguido integrar con éxito tanto oscilaciones de glucosa como PSS en un solo sistema. Por lo tanto, sigue faltando un protocolo estandarizado y reproducible que sincronice ambos factores en un entorno microfluídico controlado.

Este método aborda esta brecha estableciendo un sistema microfluídico reproducible capaz de entregar OG y PSS acoplados. El objetivo principal de este enfoque es modelar el estrés oxidativo, la viabilidad celular deteriorada y las respuestas mecanobiológicas subyacentes a la disfunción endotelial de manera fisiológicamente relevante. A diferencia de las cámaras de cultivo estático o de perfusión convencionales, este enfoque mejora los modelos existentes al permitir la modulación simultánea y controlada tanto de estímulos metabólicos como mecánicos, aproximando más de cerca el microambiente vascular diabético. Además, el sistema es compatible con la imagen de células vivas, la monitorización en tiempo real y el análisis molecular, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios mecanicistas, modelización de enfermedades y cribado de fármacos para la función y lesiones endoteliales.

Protocol

Declaración ética:

NOTA: Todos los reactivos, dispositivos y software utilizados en este protocolo se listan en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de chips microfluídicos

1. Utilizar software de diseño asistido por ordenador (CAD) para diseñar la estructura del chip microfluídico (Ancho x Larg x Alto = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) y fabricar el molde maestro SU-8 a través de una empresa comercial.
2. Mezcla el agente de curado PDMS y el prepolímero en una proporción de 10:1 en peso en una taza limpia y remueve vigorosamente manualmente durante 5 minutos.
3. Coloque el recipiente en una cámara de vacío por debajo de -0,08 MPa durante un mínimo de 15 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas durante el proceso de mezcla.
   NOTA: Para acelerar la eliminación de burbujas y evitar desbordamientos, ventila temporalmente la cámara a presión atmosférica para reventar las burbujas grandes y luego vuelve a aplicar inmediatamente el vacío. Repite este ciclo de ventilación 2–3 veces hasta que la mezcla a granel se vuelve completamente transparente y libre de burbujas macroscópicas.
4. Vierte el PDMS sobre la oblea colocada en una placa de Petri de cristal.
5. Desgasificó el PDMS vertido sobre la oblea en un desecador durante 15 minutos adicionales para eliminar cualquier burbuja que pudiera haberse formado durante la fundición.
   NOTA: Si quedan microburbujas persistentes atrapadas cerca o dentro de las estructuras del molde maestro SU-8, sopla suavemente hasta el borde o revientalas usando un soplador manual de goma. La eliminación completa de las burbujas de aire es crucial para evitar defectos estructurales en los microcanales.
6. Coloca la placa de Petri que contiene moho y polímero en un horno caliente a 80 °C durante 2 horas.
   PRECAUCIÓN: Usa guantes resistentes al calor al manipular materiales calientes
7. Retira cuidadosamente la losa de polímero solidificada del molde maestro usando un bisturí.
8. Utiliza una herramienta perforadora de núcleo (por ejemplo, de 1,2 mm de diámetro) para crear los puertos de entrada y salida en los extremos designados del canal en la losa de polímero.
9. Limpia el tablero de cristal y la cara con patrón de la losa de polímero con cinta adhesiva.
   PUNTO DE PAUSA: Las placas de PDMS curadas y perforadas pueden almacenarse en un recipiente limpio (por ejemplo, una placa de Petri sellada) a temperatura ambiente durante varias semanas antes del tratamiento con plasma y la unión.
10. Trata tanto la losa de polímero como la capa de vidrio con un limpiador de plasma a 65W de potencia bajo aire ambiente durante 60 s.
11. Alinea inmediatamente la cara del canal polimérico con el lado tratado del cubrecubierta de vidrio.
12. Presiona suavemente para crear un canal microfluídico permanente y cerrado.

2. Preparación y siembra de células endoteliales

1. Coloca el chip microfluídico enlazado en una botella de vidrio boronizado llena de agua desionizada y esterilízala mediante autoclav a 121 °C y 15 psi durante 20 minutos.
   NOTA: Sumergir el chip en agua durante el autoclavado para igualar la presión y evitar la deformación de los microcanales PDMS. Esto también ayuda a eliminar burbujas de aire atrapadas y prepara los canales para la posterior introducción de fluidos.
   PUNTO DE PAUSA: Los chips microfluídicos esterilizados pueden almacenarse de forma segura en el frasco de cristal sellado a temperatura ambiente durante varias semanas hasta que sean necesarios para la siembra celular.
2. Coloca la astilla esterilizada en un molde de cultivo de 60 mm lleno con una mezcla 1:1 de suero tampón de fosfato (PBS) y el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco's bajo en glucosa.
3. Introduce 100 μg·^mL-1 de fibronectina en el canal usando una jeringuilla de 1 mL e incuba a 37 °C durante 4 horas.
   NOTA: Asegúrese de que el chip microfluídico esté colocado por debajo del nivel del líquido. Conecta la manguera adaptadora a la aguja de la jeringuilla, llena la manguera con líquido e insértala por debajo del nivel del líquido, conecta la entrada y luego inyecta para asegurarte de que no entren burbujas.
4. Añadir 24,5 mM de D-manitol a DMEM de glucosa baja (5,5 mM de glucosa) para aumentar la presión osmótica. Añadir 5 mM de D-glucosa a un DMEM alto de glucosa (25 mM de glucosa) a un nivel final de glucosa de 30 mM. Prepara un medio de cultivo normal de glucosa (NG) y un medio de cultivo de glucosa alta (HG) suplementados con suero bovino fetal (FBS) al 20% y 1% penicilina/estreptomicina (P/S), respectivamente.
5. Calientar 1× PBS, tripsina, NG y medios de cultivo de HG en un baño maria a 37 °C. Extrae las Células Endoteliales de la Vena Umbilical Humana (HUVECs) del plato de cultivo con confluencia del 90%. Desprende las células utilizando una solución de tripsina-EDTA al 0,25% e incuba a 37 °C durante 30 segundos. Cuenta las células extraídas y ajusta la concentración a 1 x 10⁶ células/mL en medio NG y medio HG, respectivamente.
6. Inyectar 100 μL de la suspensión de la celda en el puerto de entrada de un chip microfluídico usando una jeringuilla de 1 mL, utilizando medio NG para el grupo de control y medio HG para el grupo experimental. Coloque chips microfluídicos en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de_CO2 durante 48 horas.
   NOTA: Permite que las células se adhieran al menos 4 horas antes de continuar procesando. Alternar manualmente los dos medios de cultivo cada 2 horas para estimular la hiperglucemia oscilatoria durante la fase de cultivo estático. Mantén las células a 5,5 mM de glucosa durante la noche para imitar la situación in vivo (Figura 1B).

3. Configuración de estimulación dinámica

1. Llenar dos yacimientos de 100 mL con medios de cultivo NG y HG, respectivamente, y conéctalos a los canales correspondientes del sistema programable de control de presión.
2. Conecta los depósitos, la válvula magnética de dos posiciones y tres vías y el chip microfluídico usando tubería de silicona.
3. Utiliza conectores de acero inoxidable con ángulo de 90° de diámetro de 1,3 mm y ángulo para conectar los puertos de entrada y salida del chip PDMS al tubo.
   NOTA: Esteriliza previamente los depósitos de 100 mL, tubos de silicona y conectores de acero inoxidable en un autoclave de alta presión y alta temperatura.
4. Calcular el caudal (Q) necesario para alcanzar el PSS objetivo (τ). Utiliza la fórmula τ = (6μQ)/(wh²), donde μ la viscosidad, w es el ancho del canal y h es la altura del canal.
5. Establezca un PSS fisiológico objetivo (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz), que corresponde a un caudal calculado de 200 ± 40 μL·^min-1.
6. Programar la bomba de aire programable para generar una función de onda senoidal que mantenga el PSS. Programa el controlador de válvulas para que cambie de canal cada 5 minutos y así generar una oscilación de glucosa de onda cuadrada durante la estimulación dinámica.
7. Arranca el sistema de bombeo programable para entregar el OG y PSS combinados durante un total de 30 minutos.

4. Micro-PIV para verificación de campos de flujo

1. Preparar los medios NG y HG que contienen una concentración volumétrica del 0,05% de micropartículas fluorescentes (1 μm). Asegúrate de que las partículas estén distribuidas uniformemente y libres de agregación.
2. Coloca un chip microfluídico limpio y libre de células (idéntico al usado en los experimentos celulares) en el escenario del microscopio de fluorescencia invertida.
3. Conecta todos los componentes del sistema (Figura 1C).
   1. Conecta la fuente de presión al controlador de presión.
   2. Conecta el controlador de presión al controlador de válvulas, que está conectado al ordenador para el control automatizado de las formas de onda de presión.
   3. Conecta las salidas del controlador de presión a los depósitos HG y NG mediante tuberías separadas.
   4. Conecta ambos depósitos a la válvula de presión 3/2, que cambia entre medios de alta presión y nanogástrica según el protocolo oscilatorio de glucosa programado.
   5. Conecta la salida de la válvula de presión 3/2 a la entrada del chip microfluídico mediante tubos.
   6. Conecta la salida del chip microfluídico al depósito de residuos.
   7. Colocar el chip microfluídico en el escenario del microscopio para obtener imágenes de células vivas durante todo el experimento.
      NOTA: Asegúrate de que todas las conexiones de la tubería estén seguras y libres de fugas antes de iniciar el flujo.
4. Activa la cámara de alta velocidad (funcionando a 15 Hz en modo doble fotograma) una vez que el flujo sea estable para capturar pares secuenciales de imágenes de las micropartículas en movimiento. Ajusta el retardo preciso (Δt) entre los dos tramos de cada par a 80 μs.
5. Captura imágenes para la Región de Interés (ROI) dentro del canal. Seleccione el ROI en el centro de la sección recta del canal (Figura 2A), equidistante tanto de la entrada como de la salida, para evitar efectos finales y asegurar mediciones representativas de flujo.
6. Procesa los pares de imágenes adquiridos usando software de análisis PIV. Utilizar un algoritmo adaptativo de correlación cruzada multipasada, comenzando con un área de interrogación inicial de 64 × 64 píxeles y refinando hasta un área final de 16 × 16 píxeles con un tamaño de paso de cuadrícula de 8 × 8 píxeles, para determinar el vector de desplazamiento (Δx) de las partículas entre los dos fotogramas.
7. Calcula el vector de velocidad (v) para cada área de interrogatorio usando la fórmula v = Δx / Δt.

5. Adquisición de datos

NOTA: Cuantifique la viabilidad y función celular utilizando el kit de calceína-AM/yoduro de propidio (PI) y la sonda fluorescente de estrés oxidativo de células vivas para verificar el daño causado por las fluctuaciones de glucosa y evaluar el efecto de la coestimulación.

1. Viabilidad celular
   1. Prepare la solución de trabajo Calcein-AM/PI según las instrucciones del fabricante en el punto final experimental.
      PRECAUCIÓN: El PI es un mutágeno conocido y un posible carcinógeno que se intercala en el ADN. Maneja con extremo cuidado. Lleva guantes y maneja el mango dentro de un espacio de trabajo seguro designado.
   2. Enjuaga el canal una vez con PBS e introduce la solución de trabajo Calcein-AM/PI en el canal. Incuba el dispositivo a 37 °C con 5% de_CO2 durante 30 minutos en la oscuridad.
   3. Captura inmediatamente imágenes fluorescentes de las células teñidas usando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lente objetivo de 10×. Usa el filtro FITC (Verde) para Calcein-AM y el filtro TRITC o Rhodamine (Rojo) para PI.
2. Medir ROS intracelular
   1. Preparar la solución de trabajo de la sonda fluorescente de tensión oxidativa de célula viva (véase la Tabla de Materiales) a la concentración especificada por el fabricante (5 μM) en PBS.
      PRECAUCIÓN: Las sondas fluorescentes y sus disolventes comunes (como el DMSO) pueden ser tóxicos y facilitar la absorción de sustancias peligrosas a través de la piel. Lleva guantes y maneja el mango dentro de un espacio de trabajo seguro designado.
   2. Lavar el canal tres veces con PBS e introducir la solución fluorescente de estrés oxidativo de células vivas en el canal. Incuba el chip a 37 °C con un 5% de CO2 durante 30 minutos a oscuras.
   3. Lava el canal tres veces con PBS para retirar la sonda no atada. Captura inmediatamente imágenes fluorescentes usando el conjunto de filtros Far-Red (excitación 640 nm, emisión 665 nm) a través de una lente objetiva de 20×, manteniendo exactamente los mismos parámetros de exposición para todos los grupos.
      NOTA: El aumento de la intensidad de fluorescencia indica niveles más altos de ROS.

6. Análisis de datos

PUNTO DE PAUSA: Una vez que todas las imágenes fluorescentes en bruto y las imágenes de cámara de alta velocidad se han adquirido y guardado de forma segura en un disco duro, el procesamiento de imagen, el análisis cuantitativo y las comparaciones estadísticas posteriores pueden pausarse y realizarse en cualquier momento posterior.

1. Cuantificar la viabilidad celular
   1. Abre las imágenes adquiridas de Calcein-AM (verde) y PI (rojo) en ImageJ (véase Tabla de Materiales). Ajusta manualmente el umbral de cada canal para distinguir las señales fluorescentes del fondo. Utiliza la función contador de células para contar células fluorescentes, ajustando el tamaño mínimo de la célula según el tamaño observado, y cuenta el número de células vivas (N_vivas) y muertas (N_muertas) en múltiples campos de visión.
      NOTA: N_Live se refiere al número de células Calcein-AM-positivas (verdes), N_Dead se refiere al número de células PI-positivas (rojas).
   2. Calcula el porcentaje de células vivas (N_vivas / (N_vivas + N_muertas) x 100%) para cada condición experimental usando software de hoja de cálculo. Calcula la media y la desviación estándar en múltiples campos de visión utilizando software de análisis estadístico para la comparación entre grupos.
2. Cuantificar los ROS intracelulares
   1. Arrastrar la imagen que prefieras en ImageJ. Ajusta la escala calibrando el tamaño del píxel usando los metadatos del microscopio (o una cuadrícula de referencia conocida): Analizar | Escala establecida.
   2. Eliminar una señal de fondo uniforme no específica de toda la imagen usando la función de resta de fondo: Process | Resta el fondo.
   3. Ajusta manualmente el deslizador de umbral para segmentar y define la señal ROS intracelular: Imagen | Ajustar | Umbral. Una vez establecido el umbral, utiliza Analizar | Configura las medidas para elegir el valor de área y gris medio. Establezca el tamaño mínimo de la célula según el tamaño observado y mide la intensidad media de la señal segmentada dentro del ROI de la monocapa celular: Analizar | Analizar partículas.
   4. Informa del nivel ROS para cada condición experimental como la media de los valores medidos (por ejemplo, intensidad media) derivados de al menos tres campos de visión seleccionados aleatoriamente por chip.
3. Realización de comparaciones estadísticas
   1. Introduce los resultados cuantitativos (porcentaje de viabilidad e intensidad media ROS) en el software de análisis de datos y gráficos (véase Tabla de Materiales).
   2. Determinar la significación estadística comparando los grupos experimentales con el grupo control mediante el Análisis Bidireccional de la Varianza (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Tukey, con un nivel de significación p = 0,05. Utiliza el software para realizar el análisis y genera gráficos con barras de error que representen la desviación estándar (SD).

Results

Validación micro-PIV del campo de flujo dentro del canal microfluídico
La Figura 1D ofrece una visión general de la plataforma microfluídica utilizada para investigar las respuestas endoteliales a la estimulación metabólica y mecánica acoplada. El sistema integra un chip microfluídico PDMS de canal recto con un módulo de control de flujo impulsado por presión, lo que permite la aplicación de la condición OG junto con PSS fisiológica. Se ...

Discussion

El sistema microfluídico descrito aquí proporciona una plataforma robusta y fisiológicamente relevante para investigar los efectos integrados de la OG y la PSS en la función de las células endoteliales. La principal ventaja de este método radica en su capacidad para controlar y desacoplar con precisión estímulos mecánicos y bioquímicos dentro de un microentorno definido. A diferencia de los cultivos estáticos convencionales que carecen de fuerzas hemodinámicas o de modelos animales que a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Disociación celular
Jeringa de 1 mL	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Inyectar fluido
Placa de cultivo de 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Cultivo celular
Conector de acero inoxidable de 90°	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1.3 mm	Dispositivo de sellado de adaptador
Software AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software de diseño asistido por computadora
Botella de vidrio borado	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Doble paso 100mL	Reservorio
Kit de Calcein-AM/PI	Beyotime	byt-c2015	Tienda
Incubadora celular	ESCO	Esco CelMate	Cultivo celular
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Tienda
D-glucosa	Sigma Aldrich	47249	Glucosa
D-manitol	Macklin	M813423	Equilibrar la presión osmótica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software de análisis PIV
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	14190-094	Medio
Fibronectina	Sigma Aldrich	F-2006	Adhesión celular
Micropartículas fluorescentes	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Lámina de vidrio	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Chip microfluídico
DMEM de alta glucosa	Solarbio	12100	Medio
Cámara de alta velocidad	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software de procesamiento de imágenes
Microscopio de fluorescencia invertido	Olympus	IX73	Viabilidad celular
Microscopio de fluorescencia invertido	Olympus	IX83	Observación y adquisición
DMEM de baja glucosa	Solarbio	31600	Medio
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software de análisis de datos y gráficos
PDMS	Dow Inc.	184	Chip microfluídico
Penicilina/estreptomicina (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medio
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Cultivo celular
Limpiador de plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip microfluídico
Sistema de control de presión programable	Elvesys	OB1 MK4	Control de flujo
Tubo de silicona	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Matriz maestra SU-8	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Chip microfluídico
Controlador de válvula	Elvesys	MUX Wire V3	Control de flujo