Artículo de método

Una plataforma microfluídica para investigar la precipitación microbiana de óxidos metálicos en medios porosos

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DOI:

10.3791/71047

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12 de junio de 2026

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un sistema microfluídico para estudiar la precipitación microbiana de minerales de óxido de manganeso. La formación de biominerales se mide in situ mediante microscopía óptica y análisis de imágenes. Este enfoque puede adaptarse para investigar la precipitación de otros minerales biogénicos de colores distintivos en ambientes porosos.

Resumen

Los microorganismos suelen precipitar nanopartículas de óxido metálico en suelos, sedimentos y otros medios porosos ambientalmente relevantes. Sin embargo, la formación y reactividad de óxidos de manganeso (Mn) y hierro (Fe) siguen siendo poco caracterizadas en entornos físicamente complejos. Aunque los sistemas de laboratorio pueden incorporar medios porosos como sustrato, requieren muestreo destructivo y no son fácilmente susceptibles de análisis a escala de poros. Por tanto, la naturaleza dinámica pero inaccesible de los medios porosos requiere la capacidad de resolver la precipitación mineral mediada por microbios in situ y en tiempo real. Para cerrar esta brecha, se desarrolla una plataforma microfluídica para evaluar la precipitación microbiana de óxidos metálicos en un espacio poroso modelo. Esta plataforma está validada con la bacteria oxidante de Mn Pseudomonas putida GB-1. El desarrollo de biofilm y la precipitación asociada de óxidos de Mn se visualizan bajo flujo continuo mediante microscopía de campo claro en color en time-lapse. A continuación, se combina un algoritmo de resta de imagen con mediciones de masa en el punto final para estimar la tasa de precipitación de óxidos de Mn. Este enfoque proporciona una herramienta para probar sistemáticamente cómo varía la precipitación microbiana de óxidos metálicos en respuesta a condiciones físicas y químicas cambiantes.

Introducción

Los minerales metálicos de óxido desempeñan un papel fundamental en el ciclobiogeoquímico 1. Los óxidos de manganeso (Mn) y hierro (Fe) están cargados negativamente a pH circunneutral y absorben fácilmente los metalescatónicos 2,3,4,5,6,7,8, regulando la disponibilidad de micronutrientes y la movilidad de contaminantes en la rizosfera y la zona hiporeica. Estos minerales influyen en la estabilidad y degradación de la materia orgánica 9,10,11,12, dictando la absorción de carbono por parte de las plantas y los microbios del suelo. En sistemas diseñados (por ejemplo, filtros de tratamiento de agua, humedales construidos), la precipitación de óxidos metálicos se aprovecha directamente para la eliminación de Mn o Fe y la remediación de contaminantesconcurrentes 13,14,15,16,17. Estos óxidos metálicos se identifican por sus colores característicos, que van desde ocre hasta marrón oscuro ynegro 18,19.

La precipitación de óxidos metálicos es comúnmente facilitada por microorganismos en un proceso conocido comobiomineralización 20,21,22. Numerosas bacterias y hongos oxidantes de Mn sintetizan oxidasas y peroxidasas multicobre que catalizan la transferencia electrónica de Mn(II) a Mn(III) y Mn(IV) bajo condiciones aeróbicas, resultando en la precipitación de minerales óxidos de Mn(III, IV) similares ala birnessita 2,23,24. Además, diversas bacterias oxidadoras de Fe oxidan enzimáticamente Fe(II) a Fe(III) en ambientes circunneutrales o ácidos con oxígeno limitado, produciendo óxidos de Fe(II, III) (oxihidr) (oxihidro), incluyendo ferrihidrita ymagnetita 25,26,27,28. Estos minerales biogénicos precipitan junto a las superficies celulares y se acumulan en polímeros extracelulares, vainas y otras estructuras celulares, formando conjuntos microbio-mineral 2,23,25,27,29,30.

A pesar de la ubicuidad de la biomineralización de Mn y Fe en entornos complejos, faltan conocimientos a escala porosa. Los espacios porosos son estructuralmente heterogéneos, mostrando un flujo preferencial de fluidos y un transporte de reactivos no uniforme que determinan la distribución de reaccionesbiogeoquímicas 31,32,33,34,35. Además, la actividad microbiana puede generar gradientes geoquímicos locales que promueven o limitan la biomineralización, mientras que las fluctuaciones en la química de los fluidos porosos (por ejemplo, pH, oxígeno disuelto, potencial redox) pueden potenciar la precipitación mineral o facilitar la disolución34,35. Los estudios de biomineralización de Mn y Fe suelen basarse en condiciones bien mezcladas delotes 30,36,37,38,39,40 o en lascolumnas 41,42,43,44 para cuantificar la cinética de oxidación o caracterizar precipitados biominerales. Sin embargo, los experimentos por lotes carecen de la heterogeneidad espacial inherente a los sistemas porosos. Las columnas que contienen medios granulares empaquetados proporcionan arquitectura física relevante, pero son limitadas en su utilidad porque requieren muestreo destructivo en puntos temporales estáticos, lo que detiene la progresión del experimento y evita observaciones a escala porosa sin perturbaciones. Por ello, se necesitan nuevos enfoques experimentales para investigar la precipitación microbiana de óxidos metálicos en medios porosos.

Los sistemas microfluídicos son una herramienta para estudiar reacciones biogeoquímicas in situ y en tiempo real. Los reactores microfluídicos pueden fabricarse rápidamente y a bajo coste con geometrías reproducibles y personalizables que simulan medios porosos naturales oidealizados 45. Los dispositivos resultantes son ópticamente transparentes, facilitando la visualización no destructiva y la cuantificación de procesos a escala de poros, incluyendo la formación de biofilm 46,47,48,49, el desarrollo de puntos calientes 50,51, la precipitación de metalesabióticos 52,53 y la biomineralización decalcita 34,54,55,56 . Además, los sistemas microfluídicos permiten a los usuarios controlar y variar sistemáticamente las condiciones de contorno, incluyendo la concentración de metales, la presencia o ausencia de oxígeno disuelto y el caudal del fluido. Finalmente, dependiendo del material del sustrato del reactor, se pueden obtener mediciones directas de las interacciones microbio-mineral-fluido mediante espectroscopía de rayos X, Raman oinfrarrojo 57. El desarrollo de una plataforma basada en microfluídica para estudiar la precipitación microbiana de óxidos metálicos ofrece así una vía para investigaciones novedosas sobre la formación y reactividad de fases minerales de Mn o Fe que impulsan el ciclo de carbono, nutrientes y contaminantes en ambientes porosos.

Este trabajo utiliza la biomineralización de Mn como estudio de caso para cuantificar la precipitación microbiana de óxidos metálicos en un entorno poroso dinámico. El siguiente protocolo demuestra cómo fabricar e inocular un reactor microfluídico con Pseudomonas putida GB-1, una bacteria modelo conocida por oxidar Mn(II) a Mn(III, IV) en su fase estacionaria de crecimiento58,59. Utilizando un sistema de control de flujo basado en presión, se inyectan secuencialmente un medio de crecimiento rico en nutrientes y una solución mínima de sal para promover la formación de biofilm e inducir la precipitación de óxidos de Mn, respectivamente. Se recogen imágenes de campo brillante en color de alta resolución del espacio poroso microfluídico a intervalos de tiempo regulares, capturando el contraste de color entre las biopelículas GB-1 de P. putida y los óxidos de Mn acumulados. Al final de cada experimento, todos los óxidos de Mn contenidos en el reactor son digeridos y la masa total se mide mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). La tasa de precipitación de óxidos de Mn se estima en función del tiempo integrando estas mediciones de masa final con un algoritmo de resta de imagen. Este flujo de trabajo puede adaptarse fácilmente para investigar otros organismos o procesos de precipitación de óxidos metálicos bajo diversas condiciones ambientales.

Protocolo

NOTA: Este protocolo plantea varias suposiciones sobre el conocimiento previo de los usuarios y la instrumentación disponible. En primer lugar, los usuarios deberían tener acceso a una sala limpia y familiarizarse con los procedimientos de fotolitografía para fabricar un molde microfluídico o comprar un molde comercial. A continuación, los usuarios deben familiarizarse con métodos básicos de microbiología, como el uso de técnicas asépticas, la preparación de soluciones de stock y el estriado de placas. Los usuarios también necesitan acceso a un autoclave, microcentrífuga, incubadora de shakers y espectrómetro de masas. Por último, los usuarios deben ser competentes en microscopía óptica y análisis de imágenes.

1. Fabricación y ensamblaje de reactores microfluídicos

NOTA: Los reactores microfluídicos utilizados en este protocolo están diseñados en AutoCAD con una geometría de grano de arena adaptada de Wang et al.55. Cada molde produce seis canales replicados con un espacio poroso de 15 mm × 10 mm, porosidad de 0,41 y volumen de poros de 2,3 μL. Excepto para el tratamiento por plasma, los reactores se fabrican en un gabinete de flujo laminar para mantener un ambiente bajo en polvo.

  1. Fundir los canales microfluídicos en polidimetilsiloxano (PDMS) mediante litografía blanda.
    1. En un vaso de plástico, pesa la base de elastómero y el agente de curado en una proporción de 10:1 (aquí, 25 g y 2,5 g, respectivamente).
    2. Usando un cuchillo de plástico, mezcla bien la base de elastómero y el agente curador durante 10 minutos.
    3. Desgasifica el PDMS en la copa usando un desecador de vacío durante 1 hora para eliminar las burbujas de aire.
    4. Vierte el PDMS en el molde y desgasifica durante 30 minutos para eliminar cualquier aire residual.
    5. Coloca el molde sobre una placa caliente y cura durante 3 horas a 95 °C.
    6. Una vez curado y enfriado, usa un bisturí para cortar el PDMS y pelarlo del molde.
    7. Sobre una alfombrilla de corte, corta los seis canales microfluídicos con una cuchilla de afeitar, dejando 2–3 mm alrededor del borde de cada canal. Perfora los orificios de entrada y salida de cada canal con un punzón para biopsia.
    8. Cubrir ambos lados de cada canal microfluídico con una tira de cinta transparente para evitar la acumulación de polvo y almacenarlo en una placa de Petri de 100 mm.
  2. Un día antes del experimento, ensamblar el reactor microfluídico final con plasma de aire.
    1. Retira la cinta transparente de un canal microfluídico, luego enjuaga el PDMS y una capa de tapa de vidrio con etanol al 70% y seca con nitrógeno comprimido.
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable. Manipular y almacenar según la hoja de datos de seguridad.
    2. Coloca el canal microfluídico y la cubierta boca arriba en un limpiador de plasma. Evacua la cámara durante 1 minuto, luego aplica plasma durante 1 minuto (18 W y ~0,5 torr).
    3. Retira el canal microfluídico y la cubierta del limpiador de plasma y coloca la cubierta sobre el PDMS, golpeando suavemente para asegurar la unión. Almacena el reactor ensamblado en una placa de Petri de 100 mm durante la noche.

2. Sistema de control de flujo microfluídico

NOTA: Se utiliza un sistema modular de Elveflow para facilitar la inyección secuencial de fluidos con mínimas interrupciones en la presión y el caudal. Los componentes del sistema incluyen un compresor de aire, un controlador de caudal, una válvula de distribución, un sensor de caudal, una cremallera para depósitos de fluidos (para tubos cónicos de 15 mL) y el software Elveflow Smart Interface (ESI) (Figura 1). Otros sistemas de control de flujo, como las bombas de jeringuillas, pueden usarse tanto en modo de infusión como de extracción, con jeringuillas o depósitos dedicados para cada solución influyente y una válvula divisora de bajo volumen muerto para facilitar la inyección secuencial de fluidos a través de una sola línea de tubería. Sin embargo, se debe tener cuidado con las bombas de jeringuilla para minimizar las fluctuaciones de presión que puedan desalojar biofilmes.

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Figura 1: Sistema de control de flujo y geometría microfluídica del reactor. El sistema experimental consta de un controlador de flujo (1) conectado mediante tubería neumática, (2) a una cremallera de depósito de fluido, (3) una válvula de distribución para proporcionar inyección secuencial de medio de crecimiento (GMMn) y solución de sal (SSMn), (4) un sensor de flujo (5) conectado al controlador de flujo para proporcionar retroalimentación y ajuste en tiempo real (6) tubería PEEK con un diámetro interior pequeño para proporcionar resistencia fluídica (7) una trampa de burbujas (8) aguas arriba del reactor microfluídico (9). Esquema del sistema no a escala. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Configura y calibra todo el hardware según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La estantería del depósito de fluido, la válvula de distribución y el sensor de flujo están instalados dentro de una incubadora de microscopio diseñada a medida para mantener el experimento a 30 °C.
  2. Ajusta el regulador de presión del compresor de aire a 3 bar y conecta la salida del compresor de aire a la entrada del controlador de flujo con tubos neuáticos de poliuretano.
  3. Acopla un filtro hidrofóbico a la salida del controlador de flujo para evitar el reflujo de fluido, y luego conecta el controlador a dos puertos de entrada de la cremallera del depósito de fluido con tubería neumática de poliéter poliuretano usando un colector y adaptadores con púas.
  4. Conecta la cremallera del depósito de fluido, la válvula de distribución y el sensor de caudal con la tubería de la siguiente manera, usando conexiones sin brida para tubería exterior de 1/16 pulgada de diámetro, salvo que se indique lo contrario.
    1. Conecte dos salidas de la cremallera del depósito de fluido a los dos primeros puertos de entrada de la válvula de distribución con 80 cm de tubo interior de politetrafluoroetileno (PTFE) de diámetro interior (ID).
    2. Conecta el puerto de salida de la válvula de distribución al puerto de entrada del sensor de caudal con 15 cm de tubo PTFE de 500 μm diadema interior y un adaptador adaptador.
    3. Acopla 60 cm de tubo de polieter cetona (PEEK) de 63,5 μm diámetro interior al puerto de salida del sensor de flujo usando un adaptador de conexión.
      NOTA: Para experimentos que requieren diferentes caudales, ajusta la longitud del tubo PEEK según sea necesario para proporcionar suficiente resistencia fluídica para la estabilidad del flujo.
    4. Conecta el tubo PEEK a 10 cm de tubo PTFE de 500 μm diámetro interior usando un conector unionista.
    5. Conecta el tubo de PTFE al puerto de entrada de una trampa microfluídica de burbujas equipada con un filtro de membrana de PTFE (tamaño de poro ~10 μm).
    6. Acopla 75 cm de tubo PTFE de 200 μm diámetro interior al orificio de salida de la trampa de burbujas para crear contrapresión y permitir una eliminación eficaz de las burbujas. Este tubo se conectará al orificio de entrada del microfluídico del reactor.
  5. Antes de cada experimento, esteriliza el sistema de control de flujo con todos los tubos y el hardware conectados enjuagando una solución de lejía al 1% durante tres veces el volumen del sistema (~4 h por línea de tubería a 7,0 μL·min-1), seguida de agua ultrapura estéril durante el mismo periodo.
  6. Entre experimentos, limpia el sistema de control de flujo de la siguiente manera.
    1. Enjuaga la válvula de distribución y el sensor de flujo enjuagando 100% de isopropanol y agua ultrapura estéril para evitar la acumulación de residuos o precipitados.
      PRECAUCIÓN: El isopropanol es inflamable. Manipular y almacenar según la hoja de datos de seguridad.
    2. Autoclave de la trampa de burbujas.
    3. Sustituye el filtro de membrana de la trampa de burbujas y el tubo de PTFE de 200 μm diapositiva interior después de cada experimento para evitar obstrucciones (filtro de membrana) o colonización bacteriana (tubería).

3. Medios y soluciones experimentales

  1. Prepara el medio líquido de Caldo Luria (LB, formulación de Miller) autoclavando polvo a 2,5% LB en agua ultrapura a 121 °C durante 20 minutos. Para placas de agar LB, autoclave 2,5% LB en polvo y 1,5% de agar en agua ultrapura a 121 °C durante 20 minutos, luego vierte en placas de Petri de 100 mm (~20 mL por plato) y deja que se enfríe hasta que esté sólido.
  2. A partir de soluciones de material esterilizadas con filtro, preparadas con la American Chemical Society (ACS) o reactivos de grado bacteriológico en agua ultrapura, se obtienen 30 mL de cada uno de los siguientes. La composición de la solución salina y el medio de crecimiento están adaptados de Gehin et al.59.
    1. Preparar la solución de sal sin Mn(II) (SS0): 0,4 mM CaCl2,2H 2O, 0,25 mM MgSO4,7H 2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mMKH 2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O y 40 μM EDTA ajustados a pH 6,5 con 1M NaOH), 10 mM de tampón HEPES (ajustado a pH 7,0 con 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4, y metales traza (40 nM CuSO 4,5H2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2,6H 2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) en agua ultrapura estéril.
    2. Preparar la solución de sal con Mn(II) (SSMn): Igual que la SS0 añadiendo 50 μMde MnCl 2,4H 2O.
    3. Preparar el medio de crecimiento sin Mn(II) (GM0): Igual que SS0 con 1,5 g· extracto de levadura L-1 y 1,5 g· L-1 ácido casamino añadido.
    4. Preparar el medio de cultivo con Mn(II) (GMMn): Igual que GM0 con 50 μM MnCl2,4H 2O añadido.
      PRECAUCIÓN: Las soluciones salinas y los medios de cultivo contienen metales con riesgos tanto para la salud como para el medio ambiente. Manipula y almacena según las hojas de datos de seguridad.
  3. Prepara una solución ácida que contenga 40 mM de ácido oxálico dihidratado y 2% de ácido nítrico en agua ultrapura para la digestión de los óxidos de Mn dentro del reactor microfluídico.
    PRECAUCIÓN: El ácido oxálico dihidratado y el ácido nítrico son corrosivos, y el ácido nítrico es un oxidante fuerte. Manipula y almacena según las hojas de datos de seguridad.
  4. Preparar una solución de ácido nítrico al 1% en agua ultrapura para diluir muestras de ICP-MS.

4. Cultivo bacteriano

NOTA: El cultivo bacteriano se realiza con técnica aséptica en la superficie de mesa utilizando un mechero Bunsen. Los materiales son estériles salvo que se indique lo contrario. Las duraciones de incubación son específicas de P. putida GB-1 y pueden necesitar ajustarse para otros microorganismos.

  1. De una culata a -80 °C, se traza P. putida GB-1 sobre una placa de agar LB. Incubar la placa durante aproximadamente 20 horas a 30 °C para permitir el crecimiento de colonias bacterianas.
  2. La noche antes del experimento, añade 10 mL de medio LB a un tubo cónico de 50 mL e inocúla con una colonia de placas. Incubar la precultura de LB en una incubadora shaker a 30 °C y 180 rpm durante 16 horas para alcanzar la fase estacionaria.
  3. Tras 16 horas de incubación, se aplica 1 mL de precultivo LB en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y centrifuga durante 1 minuto a 8.000 x g para pelletar las bacterias.
  4. Lava la alicuota tres veces para eliminar el medio LB gastado descartando el sobrenadante, volviendo a suspender la pastilla de celda en 1 mL de SS0 y centrifugando durante 1 minuto a 8.000 x g. Resuspende la última pellet en 1 mL de SS0.
  5. Mide la densidad óptica (OD600) de la suspensión celular lavada en una cubetas no estéril con un densímetro celular. El ODesperado 600 para P. putida GB-1 es de 3,6–3,8 en este paso, por lo que se requiere al menos una dilución de 5 veces en SS0 .
  6. Inocular 20 mL de GM0 con suspensión de células lavadas a un ODinicial de 600 de 0,01 en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. Incubar a 30 °C y 180 rpm durante 6 horas para alcanzar la fase media-exponencial.

5. Experimento de biomineralización

  1. La mañana del experimento, activa el sistema de control de flujo.
    1. Precalienta la incubadora del microscopio a 30 °C.
    2. Vierte 10 mL de GMMn y SSMn en dos tubos cónicos de 15 mL y conecta los tubos a la cremallera del depósito de fluido. Enjuague el SSMn aproximadamente tres veces el volumen del sistema (~4 h a 7,0 μL·min-1), seguido de GMMn durante el mismo periodo.
  2. Saturar el reactor microfluídico preparado 5 horas después de inocular el cultivo de exponencia media.
    NOTA: La saturación y la inoculación del reactor se realizan con técnica aséptica en la mesa de mesa usando un mechero Bunsen. Los materiales son estériles salvo que se indique lo contrario.
    1. Desgasifica el reactor en un desecador de vacío durante 20 minutos.
    2. Mientras el reactor está desgasificando, extrae 1–2 mL de SS0 en una jeringuilla plástica de 3 mL, luego coloca una aguja de punta roma y 20 cm de tubo Tygon de 0,02 pulgadas de diámetro interior. Presiona el émbolo de la jeringuilla hasta que el tubo esté completamente saturado.
    3. Retira el reactor del desecador, luego conecta el tubo al orificio de salida del reactor con pinzas inclinadas y satura manualmente el reactor con la jeringuilla hasta que se forme una gota en el orificio de entrada del reactor.
    4. Fije 20 cm de tubo Tygon de 0,02 pulgadas de diámetro interior al orificio de entrada del reactor. Continúe dispensando SSMn en el reactor hasta que se eliminen todas las burbujas de aire (200–300 μL).
  3. Prepara el inóculo del reactor e inocúla el reactor microfluídico.
    1. Retirar el cultivo de media exponencia del incubador shaker 6 horas después de la inoculación y medir el OD600. El ODesperado 600 es de 1,6–1,8 en este paso, por lo que se recomienda una dilución de 4 veces en SS0 .
    2. Diluir el cultivo de exponencia media en 2 mL de SSMn hasta obtener un ODinicial de 600 de 0,005 en un tubo microcentrífuga de 2 mL. Invierte el tubo varias veces para mezclar.
    3. Coloque el tubo de entrada del reactor en el tubo de la microcentrífuga, asegurándose de que una gota de líquido toque el inóculo para evitar la introducción de aire en el tubo. Cierra parcialmente el tubo de la microcentrífuga y asegura la tapa con cinta adhesiva para evitar contaminaciones.
    4. Extrae 4–5 mL de SSMn en una jeringuilla hermética de 5 mL para humedecer el cañón, y luego dispensa hasta que queden 0,5 mL en la jeringuilla. Carga la jeringuilla en una bomba de jeringuilla.
    5. Retira la aguja de la jeringuilla de plástico y colócala a la jeringuilla de cristal, teniendo cuidado de no atrapar aire en el cubo de la aguja.
    6. Inocular el reactor con la bomba de jeringuilla retirando el inóculo dentro del reactor durante 20 minutos a un caudal de 8,33 μL·min-1 (~70 volúmenes de poros).
    7. Tras la inoculación, apaga la bomba de jeringuilla y deja que las bacterias se asienten y se adhieran durante 1 hora sin flujo.
    8. Después de 1 hora, retira la jeringuilla de la bomba pero déjala conectada al tubo de salida.
  4. Conecta el reactor microfluídico inoculado al sistema de control de flujo.
    1. Mueve el reactor y la jeringuilla del laboratorio al incubador del microscopio.
    2. En el escenario del microscopio, retira el tubo de entrada del reactor.
    3. Presiona suavemente el émbolo de la jeringuilla para crear una gota en el orificio de entrada del reactor.
    4. Dobla manualmente la tubería de PTFE desde el sistema de control de flujo en ángulo recto (~1 cm desde el extremo de la tubería) para que se interponga perpendicularmente a la superficie del PDMS, minimizando las fuerzas laterales y la intrusión de aire en el orificio de entrada del reactor.
    5. Sumerge el extremo del tubo de PTFE en una solución de diacrilato de polietileno glicol al 1% (PEG-DA) para humedecer el exterior hidrofóbico del tubo. Asegura una gota de GMMn al final del tubo de PTFE y fija el tubo al orificio de entrada del reactor.
    6. Desconecte la jeringuilla y coloque el tubo de salida en un tubo de microcentrífuga no estéril de 5 mL para recoger el efluente del reactor.
    7. Ajusta el caudal a 1,33 μL·min-1 en el software del sistema de control de flujo. Estableció un programa para suministrarMn GM durante 15 h (~500 volúmenes de poros) para promover la formación de biofilm, seguido de SSMn durante 28,5 h (~1.000 volúmenes de poros) para inducir la biomineralización de Mn.
  5. Montar el reactor microfluídico en el inserto de la etapa del microscopio.
    NOTA: Se utiliza un sistema de irradiación ultravioleta-C (UVC) personalizado, acoplado al inserto de la etapa del microscopio, para mitigar el crecimiento bacteriano no deseado y la precipitación mineral fuera del espacio poroso microfluídico (Figura 2). Este diseño está adaptado de Ramos et al.60 y puede controlarse mediante un programa automatizado. Véase Fadely et al.61 para más detalles.
    1. Coloca un marco de muestra debajo del reactor para mayor estabilidad, luego monta rígidamente el marco y el reactor en el inserto de la etapa, asegurando que estén completamente inmovilizados.
    2. Fija el tubo de PTFE al inserto del escenario con un trozo de cinta para evitar que el tubo se desprenda del orificio de entrada del reactor.
    3. Alinea los brazos UVC a una distancia de 3 mm desde el borde del espacio poroso en el lado de entrada y 2 mm en el lado de salida para minimizar la dispersión de la luz ultravioleta y el daño a la biopelícula dentro del espacio poroso.
      NOTA: Una alineación adecuada del UVC resultará en poca o ninguna acumulación de biomasa en la región de entrada del reactor (Figura 3A). Una alineación de los brazos UVC demasiado lejos del borde de entrada del espacio poroso (Figura 3B) o la ausencia de irradiación (Figura 3C) resulta en precipitación mineral aguas arriba del espacio poroso.
    4. Establece un programa para la irradiación de reactores. Tratar las regiones de entrada y salida del reactor durante 5 minutos a t = 0 h para inactivar las bacterias depositadas durante la inoculación, y luego tratar la zona de salida solo durante 5 minutos a t = 17,5 h para inactivar los biofilms restantes.

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Figura 2: Sistema de irradiación ultravioleta-C (UVC) personalizado para reactores microfluídicos. (A). Vista superior del sistema montado en el inserto del escenario del microscopio que muestra brazos articulados (azules) con matrices de diodos emisores de luz UVC (LED) adjuntos (rectángulos amarillos) y un reactor microfluídico montado en un marco de muestra (pequeño rectángulo gris). (B). Vista inferior del sistema mostrando LEDs UVC (cuadrados beige) incrustados en los brazos articulados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Efecto de la irradiación UVC en la región de entrada del microfluídico reactor. (A). Región de entrada del reactor con un tratamiento UVC de 5 minutos en t = 0 h mostrando una alineación adecuada para la eliminación completa de biopelículas no deseadas. (B). Región de entrada del reactor con una matriz UVC mal alineada, que dejaba biopelículas residuales en el orificio de entrada y fuera del espacio poroso, permitiendo que los óxidos de Mn precipitaran aguas arriba. (C). Región de entrada del reactor sin tratamiento UVC, lo que provoca un crecimiento extenso de biofilm y precipitación mineral. Un sombreado gris delimita el espacio poroso. La barra de escala es de 2 mm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Microscopía óptica de lapso de tiempo

NOTA: Se utiliza un microscopio de epifluorescencia invertida Nikon Ti2 Eclipse equipado con una cámara digital (2304 x 2304 píxeles por campo de visión), motor de luz blanca, objetivo 4x (1,62 μm·píxeles-1) y software NIS Elements para imágenes en campo claro en color. Otros microscopios ópticos capaces de realizar imágenes en color también son adecuados. El uso de imágenes en color mejora la sensibilidad a la baja masa de óxido de Mn. Si la automatización en lapsos de tiempo no es una opción, los usuarios pueden recopilar imágenes manualmente y posprocesarlas como una serie temporal.

  1. Para imágenes de alta calidad, realiza los siguientes pasos de alineación y corrección:
    1. Para asegurar una iluminación uniforme, ajusta manualmente la alineación de Köhler siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Optimiza la iluminación del campo brillante para evitar la subsaturación o sobresaturación de la imagen (Fusion Pad > Color > Auto Brightness y Fusion Pad > Color > Auto White).
      NOTA: Es mejor optimizar la iluminación del campo brillante solo una vez en un reactor que ya contenga biopelículas y óxidos de Mn, y luego aplicar el mismo tiempo de exposición y equilibrio de color a todos los experimentos posteriores para lograr una iluminación consistente. Aquí se utiliza una iluminación de 5 ms con rojo al 97,58%, verde al 44,76% y azul al 100%.
    3. Para evitar artefactos de acolchado al adquirir imágenes cosidas del espacio poroso microfluídico, aplica una corrección de sombreado (Adquirir > Panel de Corrección de Sombra).
  2. Establece la coordenada central de la imagen unida (Adquisición ND > XY).
  3. Configura el área de escaneo de imagen unida (aquí, 5 x 4 campos de visión) y aplica un solapamiento del 1% (Adquisición ND > Imagen Grande).
  4. Configurar la adquisición de imágenes en campo claro en color con el objetivo 4x (adquisición ND > λ).
  5. Configurar la frecuencia de imagen con intervalos de 1 h para 15 h (fase de crecimiento) y 0,5 h para 28,5 h (fase de mineralización) (Adquisición > tiempo de ND), y luego ejecutar el programa en time-lapse.
    NOTA: La duración de las fases de crecimiento y mineralización es específica de P. putida GB-1 y puede ajustarse según sea necesario para otros microorganismos.
  6. Cuando el experimento esté completo, exporta las imágenes como Formato de Archivo de Imagen Etiquetado (TIFF) (Panel Macro > Exportar Imágenes a TIFF).

7. Digestión ácida y medición de masa de Mn

NOTA: Un ICP-MS se utiliza para medir la masa de Mn retenida en el reactor microfluídico, pero otros instrumentos, como espectrómetros de emisión óptica (ICP-OES), también son aceptables. Si no hay instrumentación analítica disponible, las muestras digeridas con ácido pueden enviarse a un laboratorio comercial.

  1. Al final del experimento, retirar el reactor del inserto de la etapa del microscopio y desconectar la tubería de entrada y salida.
  2. Extrae 1,5 mL de solución ácida en una jeringuilla hermética de 5 mL de vidrio (separada de la jeringuilla de inoculación). Coloca una aguja de punta roma y 20 cm de tubo de PTFE de 1/32 pulgada de diámetro interior a la jeringuilla y dispensa ácido manualmente hasta que se forme una gota al final del tubo.
  3. En la superficie, carga la jeringuilla en una bomba de jeringuilla y conecta el tubo al orificio de entrada del reactor, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire, ya que podrían impedir que la solución ácida penetre en todos los poros. Conecta 30 cm de tubo PTFE de diámetro interior de 1/32 pulgada al orificio de salida del reactor y coloca el extremo del tubo de salida en un tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  4. Inyectar solución ácida en el reactor durante 10 minutos a un caudal de 100 μL·min-1.
  5. Tras la inyección de solución ácida, desconecta la aguja de punta roma de la jeringuilla de vidrio. Llena una jeringuilla de plástico de 10 mL con aire y conéctala a la aguja de punta roma, luego dispensa manualmente todo el aire de la jeringuilla para drenar el ácido restante del reactor y el tubo hacia el tubo de microcentrífuga de 2 mL.
    NOTA: Aunque un pequeño volumen de solución ácida puede quedar atrapado en el espacio poroso tras la inyección de aire, es insignificante en relación con el volumen total inyectado. Los usuarios que trabajan con geometrías de menor porosidad pueden considerar enjuaguar volúmenes adicionales de aire para eliminar películas fluidas y ácido residual de poros mal conectados.
  6. Diluir la muestra digerida en ácido nítrico al 1% según el rango de calibración ICP-MS. Aquí, prepara una dilución de 100 veces (5 mL de volumen total) en un tubo cónico de 15 mL.
  7. Mide la concentración de Mn en la muestra diluida con ICP-MS. Corrige la concentración medida con el factor de dilución y el volumen total de la muestra para determinar la masa de Mn retenida en el reactor.

8. Análisis de imágenes

NOTA: MATLAB se recomienda por sus funciones integradas para el análisis de imágenes, que se incluyen en el texto. Sin embargo, otras herramientas como ImageJ o las bibliotecas de análisis de imágenes de Python también pueden usarse para realizar análisis comparables. Los pasos clave del análisis de imágenes se muestran en la Figura 4. Todos los scripts de análisis de imágenes se proporcionan como archivos suplementarios (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).

figure-protocol-4
Figura 4: Flujo de trabajo de resta de imágenes para aislar precipitados de óxidos de Mn. A partir de imágenes de campo claro en color en lapso de tiempo, se identificó una imagen de referencia (tref) (1) para eliminar la intensidad de las biopelículas de fase estacionaria subyacentes de todas las imágenes de puntos temporales posteriores (tn) (2) se generaron máscaras binarias de todos los tn (3) y se multiplicaron tanto por tref (4) como por el tn correspondiente (5) para capturar la extensión biofilm-biomineral. Finalmente, los enmascarados se restaron del tref enmascarado (6). Las matrices corregidas por intensidad resultantes cuantifican la disminución de intensidad (u.a.) debida a la acumulación de óxido de Mn en cada píxel. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Carga un TIFF de alta resolución de la geometría del espacio poroso microfluídico (exportado desde AutoCAD) en el espacio de trabajo para usarlo como máscara de grano (imread).
  2. Endereza y registra las imágenes en color de campo claro para aplicar eficazmente la máscara de grano.
    1. Genera un binario de registro de la primera imagen de punto temporal (t = 0 h).
      1. Carga el TIFF de campo claro en color en el espacio de trabajo (imread).
      2. Recorta la imagen un poco más grande que el tamaño del espacio poroso (recorte).
      3. Enfoca la imagen para mejorar la resolución de los límites de grano (enfocar el grano).
      4. Binariza la imagen usando un umbral adaptativo que priorice los rasgos oscuros (rgb2gray, adaptthresh con polaridad en primer plano = "oscuro" y ajuste de sensibilidad según sea necesario, imbinarizar, imcomplementar).
      5. Rellenar los granos del binario de registro resultante para crear características sólidas (relleno con "agujeros" especificados). Ten en cuenta que no todos los granos pueden estar rellenos.
      6. Erosionar el binario de registro según sea necesario para eliminar el ruido de fondo, luego dilatar para reemplazar los píxeles perdidos en los bordes del grano (imerodar, imdilatar).
    2. Utilizar un algoritmo de registro de transformada de características invariante a escala (SIFT) para calcular la matriz de transformación necesaria para alinear el binario de registro con la máscara de grano (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d con tipo de transformación = "afín").
    3. Aplica esta matriz de transformación al binario de registro y a la primera imagen de punto temporal, luego superpone la máscara de grano para evaluar el ajuste (imwarp, imshowpair).
    4. Si persiste un mal alineamiento tras el registro SIFT, solicita el registro local según sea necesario (cpselect, fitgeotform2d con tipo de transformación = "lwm", imwarp).
    5. Recorta la imagen registrada y la máscara de grano según sea necesario para eliminar artefactos de registro en los bordes de la matriz, luego redimensiona a las dimensiones del espacio poroso (15 mm x 10 mm) (recortar, recortar).
    6. Haz un bucle entre todas las imágenes en color de campo claro para aplicar el mismo registro (imwarp).
  3. Identifica visualmente una imagen de referencia (referencia t, Panel 1 en la Figura 4) cuando los biofilms entran por primera vez en fase estacionaria, determinada como falta de movimiento o crecimiento continuo (aquí, t = 18,5 h).
  4. Binarizar cada imagen en un punto temporal (tn, Panel 2 en la Figura 4) (rgb2gray, adaptthresh con polaridad del primer plano = "oscuro" y ajuste de sensibilidad según sea necesario, imbinarizar, imcomplementar) de modo que los conjuntos biofilm-biomineral = 1 y los granos y poros vacíos = 0. Multiplica cada máscara de punto temporal por la máscara de grano invertido (imcomplemento) para eliminar los límites residuales de grano.
  5. Multiplica tn por su correspondiente máscara de puntos temporales (Panel 3 en la Figura 4) para aislar la región biofilm-biomineral de interés (Panel 5 en la Figura 4), luego multiplica tref por cada máscara de punto temporal para aislar la misma región (Panel 4 en la Figura 4).
  6. Resta todo el tn enmascarado de lareferencia t enmascarada para cuantificar la disminución de la intensidad del píxel asociada a la acumulación de óxido de Mn en cada momento (imsubstra), y luego convierta a matrices compuestas corregidas por intensidad (rgb2gray, Panel 6 en la Figura 4).
  7. Para evaluar la distribución espacial de minerales a lo largo del espacio poroso (u.a.), suma a lo largo de las columnas (suma con dimensión = 1) de cada matriz corregida por intensidad.
  8. Para estimar la tasa de precipitación de óxidos de Mn a lo largo del tiempo (μg·h-1):
    1. Suma cada matriz corregida por intensidad (suma con dimensión = "todo") para cuantificar la intensidad total corregida en cada punto temporal.
    2. Divide la intensidad total corregida en cada momento por la intensidad total corregida en el último momento de modo que el último punto = 1 y todos los valores anteriores sean fraccionarios. Reescala a μg multiplicando por la masa Mn medida con ICP-MS.
    3. Tomemos la derivada respecto al tiempo dividiendo el aumento de masa (μg) entre puntos temporales secuenciales (diff) por el intervalo de tiempo entre imágenes (0,5 h).

Resultados

Este protocolo proporciona una plataforma experimental para la imagen espaciotemporalmente resuelta de la formación de biofilm y la biomineralización de Mn. Las imágenes en color de campo claro demostraron que los biofilms GB-1 de P. putida estaban distribuidos uniformemente por todo el espacio poroso microfluídico a t = 18,5 h antes del inicio de la precipitación de óxidos de Mn (Figura 5A). Posteriormente, los óxidos de Mn se acumularon preferentemente en el lado de entrada del espacio poroso más cercano a la fuente influyente de Mn(II) (Figura 5B). La diferencia entre la imagen de referencia y los puntos temporales posteriores reveló la contribución aislada de los precipitados de óxido de Mn a la intensidad total de la imagen (Figura 5C) y permitió cuantificar el gradiente observado a escala de reactor en la acumulación de minerales (Figura 5D). A escala de biopelícula, este enfoque de sustracción de imágenes capturó la precipitación gradual de óxidos de Mn en superficies de biofilm y la acumulación de minerales en los bordes de las biopelículas en contacto con el fluido de poros (Figura 6).

El protocolo además proporciona un flujo de trabajo para estimar la cinética de la precipitación de óxidos de Mn a partir de la resta de imágenes y mediciones de ICP-MS. Los reactores microfluídicos triplicados contenían 4,29 ± 0,22 μg Mn en el momento experimental final. La digestión ácida del contenido del reactor fue validada previamente mediante mediciones basadas en sincrotrón de la masa de óxido de Mn y se encontró que resultaba en un error61 inferior al 18%. Por lo tanto, las matrices corregidas por intensidad se reescalaron a esta masa final. La tasa estimada resultante de precipitación de óxidos de Mn fue no monótona, aumentando bruscamente entre t = 19,5 h y t = 21 h, antes de alcanzar un máximo de 0,29 ± 0,04 μg·h-1 y desacelerar gradualmente hasta t = 43,5 h (Figura 7). Cabe señalar que este cálculo de tasas no tiene en cuenta ningún óxido de nanopartículas de Mn por debajo de la resolución del microscopio óptico ni la pérdida de masa de óxido debido al transporte durante la duración del experimento, que se espera sea mínima. Este enfoque aprovecha por tanto técnicas de microscopía accesibles para evaluar de forma semicuantitativa las tendencias temporales en la cinética de biomineralización.

figure-results-1
Figura 5: Distribución a escala de reactor de biofilms y óxidos de Mn. (A). Imagen en campo claro en color de biopelículas GB-1 de P. putida dentro del espacio poroso microfluídico al inicio de la fase estacionaria (t = 18,5 h,t ref). (B). Imagen en campo claro en color de óxidos de Mn precipita sobre y alrededor de las biopelículas GB-1 de P. putida en el último momento experimental (t = 43,5 h). (C). Matriz de acumulación mineral corregida por intensidad en el momento experimental final (t = 43,5 h), con granos en gris y poros en blanco. La barra de escala mide 1 mm (D). Distribución espacial unidimensional de la intensidad total corregida desde la entrada (izquierda) hasta el lado de salida (derecho) del espacio poroso (t = 43,5 h). La línea sólida representa una media móvil de 1 mm a lo largo del espacio poroso desde la entrada hasta la salida promediada en experimentos triplicados, y el sombreado representa la desviación estándar. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Acumulación de óxidos de Mn a escala de biofilm. (A). Seleccionar imágenes en campo claro en color de biofilms representativos de P. putida GB-1. Los óxidos de manganeso se detectaron primero como un cambio de color de gris a marrón en superficies de biofilm (mostrado en t = 20 h y t = 21 h) y más tarde como acumulación de precipitados marrón oscuro en los bordes de la biopelícula (mostrado en t = 33 h y t = 43 h). (B). Matrices de acumulación mineral corregidas por intensidad con granos en gris oscuro, poros en blanco y biopelículas subyacentes en gris claro. La barra de escala es de 150 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7: Estimación de la tasa de precipitación de óxidos de Mn a lo largo del tiempo. La tasa (μg·h-1) se cuantificó reescalando la intensidad total corregida en cada punto temporal hasta la masa final de Mn medida con ICP-MS, y luego tomando la derivada respecto al tiempo. Los marcadores representan la media de los experimentos triplicados, y el sombreado representa la desviación estándar. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Step1_ImageRegistration.m.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Step2_ImageSubtraction.m.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Step3_Figures.m.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Esta plataforma experimental ofrece oportunidades únicas para investigar la dinámica espaciotemporal de procesos biogeoquímicos en ambientes porosos libres de artefactos que impiden la adquisición de datos de alta fidelidad. Este enfoque es especialmente adecuado para la biomineralización de Mn y Fe, que producen precipitados minerales con tonos característicos de ocre, marrón y negro que pueden segmentarse fácilmente mediante microscopía óptica y análisis de imágenes. Utilizando la biomineralización de Mn como estudio de caso, es posible evaluar patrones y tasas de precipitación mineral in situ con alta resolución espacial y temporal.

Varios aspectos de este protocolo permitieron la recopilación de mediciones reproducibles de transformaciones biogeoquímicas. Primero, el uso de una válvula de inyección secuencial con bajo volumen muerto facilitó experimentos con múltiples fluidos sin perturbar las biopelículas dentro del espacio poroso microfluídico. Esta configuración preservaba la distribución espacial inicial de la biopelícula al evitar picos de presión que pueden provocar desprendimiento o desplazamiento de biopelículas al cambiar fluidos inyectados, lo que puede ocurrir con otros instrumentos como bombas de jeringuillas. Este componente ofrece además al usuario la flexibilidad para personalizar las condiciones geoquímicas impuestas a los microorganismos residentes. Finalmente, al preservar la distribución inicial de biopelículas, esta configuración permite al usuario probar sistemáticamente cómo diferentes morfologías de biofilm o cantidades de biomasa influyen en la distribución y tasa de precipitación de óxidos de Mn.

En segundo lugar, mitigar la formación e intrusión de burbujas en el espacio poroso microfluídico permitió realizar experimentos de varios días que capturaron las escalas temporales ambientalmente relevantes de la biomineralización de Mn. Las burbujas, un problema común y a menudo inevitable en experimentos largos por encima de la temperaturaambiente 62,63, pueden fragmentar y bloquear poros individuales, desviar el flujo de fluidos e interrumpir el progreso de la reacción. Para evitar que las burbujas atraparan en el espacio poroso, el reactor estaba completamente saturado antes de la inoculación. Para minimizar la introducción de burbujas a través del sistema de control de flujo, la incubadora del microscopio se ajustó a 30 °C con mucha antelación del experimento, y se limpiaron varios volúmenes de solución influyente antes de acoplar el reactor inoculado. Este paso eliminó el aire atrapado de los tubos y los accesorios, y minimizó el riesgo de desgasificación de fluidos durante el experimento. También se integró una trampa de burbujas en el sistema de control de flujo para capturar cualquier burbuja residual, con una longitud de tubo de PTFE de 200 μm diámetro interno unida a la salida del sifón para aumentar la resistencia y mejorar la eficiencia en la eliminación de burbujas. Finalmente, para evitar que el aire atrapara o se filtre en la interfaz entre el tubo influyente y el orificio de entrada del reactor, todas las conexiones se realizaron con gotas de fluido en ambos extremos del tubo y el orificio perforado, el tubo hidrofóbico de PTFE se recubrió con PEG-DA al 1%, y el extremo del tubo insertado se mantuvo perpendicular a la superficie del PDMS durante todo el experimento.

En tercer lugar, incorporar un sistema de irradiación UVC personalizado en la plataforma experimental mantuvo una condición geoquímica de frontera definida y una biomineralización de Mn reproducible dentro del espacio poroso microfluídico. Los experimentos piloto demostraron que biopelículas extrañas en la región de entrada del reactor precipitaban óxidos de Mn aguas arriba del espacio poroso, restringiendo la disponibilidad posterior de Mn(II). Irradiar brevemente las regiones de entrada y salida del reactor con una alineación adecuada tras el periodo de sedimentación sin flujo evitó el desarrollo de biopelículas de cualquier bacteria depositada inicialmente. El flujo continuo unidireccional de fluidos impidió la recolonización de la región de entrada del reactor tras este tratamiento inicial con UVC. Irradiar la región de salida del reactor en t = 17,5 h antes del inicio de la fase estacionaria y la precipitación visible de óxidos de Mn minimizó la cantidad de acumulación mineral aguas abajo del espacio poroso. Esto facilitó la comparación directa de datos de imágenes en campo claro en color con masa de Mn digerida y medida con ICP-MS.

La combinación de la resta de imagen y las mediciones de masa final proporcionó un método semicuantitativo para evaluar la cinética de la precipitación de óxidos de Mn in situ. Sin embargo, es importante señalar que la intensidad de los píxeles deja de ser directamente proporcional a la masa de óxido de Mn a densidad mineral muy alta debido a la sensibilidad limitada de la cámara a los coloresoscuros 61. La evaluación de este comportamiento no lineal podría mejorarse digiriendo ácidos muestras en puntos temporales definidos y comparando la masa digerida con la masa original escalada por el momento experimental final. Si se requiere cuantificación exacta de la masa mineral, los usuarios pueden desarrollar una curva de calibración utilizando muestras minerales de intensidad y masa conocidas, lo cual ya se ha demostrado previamente en Fadely et al.61, o realizar mediciones directas con fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón.

La plataforma microfluídica presentada aquí puede aplicarse para investigar procesos de biomineralización bajo una amplia gama de condiciones ambientales. Aunque los experimentos representativos estaban optimizados para P. putida GB-1, este sistema puede utilizarse para probar sistemáticamente una variedad de químicas de solución influyente (por ejemplo, concentración de Mn o Fe, fuente de carbono, presencia de metales concurrentes), caudales, temperaturas o la presencia de un consorcio microbiano. Condiciones ácidas o suboxicas específicas, como las favorables a bacterias oxidadoras de Fe, pueden simularse disminuyendo el pH influyente o recubriendo el PDMS con un polímero impermeable al oxígeno. Se pueden obtener conocimientos sobre los controles microbianos de la biomineralización implementando cepas de fusión génica reportera y siguiendo la fluorescencia ópticaresultante 59,64. Los reactores microfluídicos pueden rediseñarse para simular una variedad de ambientes porosos cambiando la distribución del tamaño de las partículas, la forma o la porosidad, o funcionalizando el PDMS para imitar la carga superficial de partículas de arcilla o materia orgánica natural. Con modificaciones adicionales (por ejemplo, reemplazar el sustrato del reactor de vidrio por plástico), los reactores pueden soportar mediciones espectroscópicas directas del estado de oxidación del metal, mineralogía, asociaciones organo-minerales o la sorción o co-precipitación de metales secundarios. Finalmente, esta plataforma experimental puede ampliarse para investigar la precipitación de otros biominerales metálicos (por ejemplo, fosfatos, carbonatos, sulfuros), siempre que sus propiedades ópticas sean lo suficientemente distintas como para permitir la segmentación de imagen. Por tanto, este protocolo ofrece un marco para investigar de forma exhaustiva la biomineralización y las interacciones microbio-mineral-fluido en ambientes porosos relevantes.

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por el Centro de Geotecnia Biomediada e Inspirada en la Biociencia de EE. UU. (ERC-1449501), la Fundación Nacional Suiza de Ciencia (200021_188546) y la Fundación Nacional de Ciencia de EE. UU. (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Parte de este estudio se llevó a cabo en el Centro de Nano y Microfabricación de la UC Davis (CNM2). Agradecemos a Steven Lucero y a la fundición UC Davis Tech por el diseño y fabricación del incubador de microscopios y el sistema de irradiación UVC. También agradecemos al Dr. Yuze Wang y al Dr. Jason DeJong por proporcionar la geometría del medio poroso utilizada para la fabricación de reactores microfluídicos, así como a la Dra. Arunima Bhattacharjee, el Dr. Noah Goshi, el Dr. Gregory Girardi y el Dr. Hyehyun Kim por sus útiles discusiones y/o por proporcionar formación en fotolitografía y litografía blanda. Por último, agradecemos al Dr. Gaitan Gehin, la Dra. Tonya Kuhl, el Dr. Filippo Miele y el Dr. Charles Graddy por valiosas discusiones sobre diseño experimental y análisis de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Utilizado para la interfaz entre el sensor de flujo y los accesorios sin brida.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Utilizado para verter placas para la estría de existencias congeladas.
Air compressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110Utilizado para presurizar el controlador de flujo.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Utilizado para medios experimentales y soluciones.
Angled tweezersTDI International7-SAUtilizado para conectar la tubería al reactor microfluídico.
AutoCAD softwareAutodesk --Utilizado para diseñar la geometría del reactor microfluídico.
AutoclaveSteris--Utilizado para esterilizar materiales y líquidos. 
BalanceMettler ToledoME2002TUtilizado para pesar la base de elastómero PDMS y el agente de curado.
Barbed adapter (1/4-28 swivel to 3/32-in barbed)ElveflowKFI-06Utilizado para conectar la tubería de poliéter poliuretano al colector y al bastidor del reservorio de fluido.
Biopsy punch (Rapid-Core, 1.2-mm diameter)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Utilizado para perforar orificios de entrada/salida en los canales microfluídicos de PDMS. 
Bleach (Chlorox)ULINES-19719Utilizado para esterilizar el sistema de control de flujo. Diluir al 1% en agua ultrapura.
Blunt-tip needle (Jensen Global, 21-gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Utilizado para conectar la tubería a las jeringas. Esterilizado por autoclavado durante 30 min.
Bunsen burnerHumboldtH-5970Utilizado para mantener un espacio de trabajo experimental estéril.
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Utilizado para medios experimentales y soluciones.
Casamino acid (Fisher BioReagents, acid casein peptone)Fisher ScientificBP1424Utilizado para medios experimentales.
Cell density meter (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Utilizado para medir la OD600 de cultivos bacterianos. 
Clear tape (Scotch Magic)ULINES-10223Utilizado para evitar que el polvo se adhiera a los canales microfluídicos de PDMS.
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Utilizado para medios experimentales y soluciones.
Compressed nitrogenAirgasNIUHP300Utilizado para secar los componentes del reactor microfluídico.
Conical tube (Falcon, 15-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-959-49BUtilizado para soluciones de entrada y muestras ICP-MS. Pre-esterilizado.
Conical tube (Falcon, 50-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-432-22Utilizado para pre-cultivo LB. Pre-esterilizado.
Copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Utilizado para medios experimentales y soluciones.
Cutting matULINES-18543Utilizado para cortar los canales microfluídicos de PDMS y perforar orificios de entrada/salida.
Cuvette (Fisherbrand, 1.5-mL volume, polystyrene)Fisher Scientific 14-955-127Utilizado para medir la OD600 de cultivos bacterianos. 
Digital camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Utilizado para imágenes de campo brillante de lapso de tiempo de experimentos microfluídicos.
Distribution valve (MUX)ElveflowMUX-D-12Utilizado para inyectar secuencialmente múltiples fluidos.
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow --Utilizado para controlar la velocidad de flujo/retroalimentación de presión entre el controlador de flujo y el sensor de flujo y realizar el cambio de válvula de distribución.
Erlenmeyer flask (Fisherbrand, 50-mL volume)Fisher ScientificFB50050Utilizado para cultivo en fase exponencial media. Esterilizado por autoclavado durante 30 min.
Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% purity, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Utilizado para limpiar PDMS y portaobjetos para la fabricación del reactor. Diluido al 70% en agua ultrapura.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSUtilizado para medios experimentales y soluciones.
Flangeless fitting (1/4-28 for 1/16-in OD tubing)ElveflowKFI-17Utilizado para conectar la tubería a los componentes de hardware de Elveflow. El kit incluye ferrules y tuercas roscadas.
Flow controller (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Utilizado para proporcionar retroalimentación de velocidad de flujo/presión para la inyección de fluidos controlada.
Flow sensor (MFS2)ElveflowMFS-D-2Utilizado para mantener un flujo estable para experimentos microfluídicos utilizando la retroalimentación de presión del controlador de flujo.
Fluid reservoir rack ElveflowKPT-4SUtilizado para presurizar los fluidos de entrada. Compatible con tubos cónicos Falcon de 15 mL.
Glass cover slip (1.42-in x 2.36-in, #1 thickness)Ted Pella260460-100Enlazado por plasma al canal PDMS como sustrato para reactores microfluídicos. 
Glass gas-tight syringe (5-mL volume, Luer-Lock)Hamilton81520Utilizado para la inoculación del reactor y la digestión ácida (jeringas separadas). La jeringa de inoculación se esteriliza mediante autoclavado durante 30 min.
HEPES buffer (CAS: 7365-45-9)

Referencias

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