Maduración in vitro, fertilización y cultivo de embriones preimplantacionales de ovocitos de ratón

Resumen

Este protocolo describe procedimientos para la maduración in vitro de ovocitos de ratón, la fertilización in vitro y el posterior cultivo embrionario hasta la etapa de blastocisto.

Resumen

La maduración in vitro de ovocitos de ratón, combinada con fertilización in vitro y posterior cultivo embrionario, permite la generación de embriones preimplantacionales bajo condiciones definidas. Estos procedimientos facilitan la investigación de las funciones biológicas y los mecanismos moleculares que subyacen a la maduración de los ovocitos, la fertilización y el desarrollo temprano del embrión. Sin embargo, la aplicación exitosa de este enfoque depende de un manejo cuidadoso de ovocitos y espermatozoides, condiciones de cultivo adecuadas y una evaluación precisa de la progresión del desarrollo en cada etapa. Aquí describimos métodos para aislar complejos cúmulo-ovocitos (COCs) inmaduros de ovarios de ratón, maduración in vitro de ovocitos, fertilización in vitro y cultivo in vitro de embriones hasta la etapa de blastocisto. Estos procedimientos incluyen preparar y equilibrar medios y platos de cultivo, aislar y seleccionar COCs tras la disección ovárica, recoger espermatozoides y capacitarlos, realizar inseminación bajo condiciones estandarizadas y, posteriormente, cultivar embriones para su evaluación del desarrollo. La progresión del desarrollo se evalúa utilizando criterios morfológicos, incluyendo la formación de pronúcleos masculinos y femeninos, la clivación hacia la etapa bicelular y la formación de blastocistos. Este protocolo puede integrarse en estudios sobre la maduración de los ovocitos y la función de los factores maternos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación básica en biología reproductiva de mamíferos.

Introducción

Comprender la calidad de los ovocitos y la competencia en el desarrollo es esencial para una fertilización exitosa y el posterior desarrollo^{embrionario 1,2}. La maduración de los ovocitos requiere no solo una segregación cromosómica precisa durante la maduración nuclear, sino también la maduración citoplasmática, incluyendo la redistribución de orgánulos y la acumulación de ARNm y proteínas^{maternas 3}. El desarrollo embrionario temprano depende de ARNm y proteínas proporcionados por la madre, y las reservas maternas en el ovocito sostienen el desarrollo preimplantacional. Sin embargo, las identidades y funciones de muchos reguladores maternos de la embriogénesis en mamíferos siguen siendo incompletamente^{comprendidas 4}. Por ello, se necesitan más estudios sistemáticos para esclarecer los mecanismos subyacentes a la maduración de los ovocitos, la fecundación y el desarrollo embrionario.

El ratón es un sistema modelo ampliamente utilizado para investigar el desarrollo embrionario preimplantacional. La maduración in vitro (IVM) se refiere a la recogida de ovocitos inmaduros del ovario y su maduración bajo condiciones de laboratorio^{controladas 5}. Posteriormente, la fertilización in vitro (FIV) permite que ovocitos maduros sean coincubados con espermatozoides capacitados para generar cigotos para estudios tempranos de desarrollo embrionario. Sin embargo, en comparación con la FIV convencional que utiliza ovocitos maduros in vivo, los ovocitos derivados de la MIV suelen mostrar tasas de maduración y fertilización más bajas y una competencia desarrollativa^{reducida 6}. Estas limitaciones se deben en gran medida a la asincronía entre la maduración nuclear y citoplasmática bajo condiciones de cultivo in vitro . Además, la estabilidad del huso meiótico en los ovocitos de ratón es sensible a los cambios de pH y temperatura durante la IVM, y la alteración del huso puede contribuir a la detención de la^{maduración 7}. En consecuencia, la menor competencia de los ovocitos derivados de la MIV sigue siendo una barrera importante, limitando la producción eficiente de embriones para estudios de desarrollo y mecanicistas.

Los embriones de preimplantación de ratón también pueden obtenerse recogiendo cigotos derivados in vivo y cultivándolos in vitro (IVC). Los cigotos derivados in vivo recogidos de los oviductos proporcionan un punto de partida relativamente sincronizado para experimentos centrados en eventos posteriores a^{la fertilización 8}. Sin embargo, la maduración de los ovocitos y la acumulación de factores maternos ocurren antes de la fertilización in vivo; por tanto, los cigotos derivados in vivo son menos susceptibles a la manipulación experimental de condiciones de maduración o reservas maternas para evaluar sus efectos en el desarrollo embrionario^{posterior 4}. Por ello, optimizar los protocolos de FIV y FIV y adoptar procedimientos operativos estandarizados con un riguroso control de calidad (por ejemplo, gestión estricta de temperatura, pH y prácticas de manipulación) son esenciales para minimizar la variabilidad relacionada con el procedimiento y proteger la competencia en el desarrollo de ovocitos y embriones.

Aquí describimos un protocolo IVM–IVF–IVC que detalla la preparación de medios, el aislamiento y selección de COC, los procedimientos de FIV y FIV, y el cultivo embrionario in vitro (Figura 1). El protocolo incorpora puntos de control prácticos específicos para cada etapa para el control rutinario de calidad, incluyendo la extrusión del primer cuerpo polar (PB1), la formación de pronúcleos masculinos y femeninos (2PN), la clivación en dos células y la formación de blastocistos. Este protocolo permite la generación reproducible y eficiente de embriones preimplantacionales bajo condiciones definidas, apoyando estudios mecanicistas, optimización de cultivos y aplicaciones posteriores en biología del desarrollo y reproductiva.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Northwest A&F, China (número de permiso: 20230503).

1. Mantenimiento animal

1. Adquiere hembras salvajes C57BL/6 y machos DBA/2 y mantenlas en condiciones específicas libres de patógenos (SPF), con un ciclo de 12 horas claro-oscuro a una temperatura de 20–22 °C y humedad del 55% ± 10%. Proporciona una dieta de cría y agua ad libitum. Los ratones machos de casa son solo (un macho por jaula).

2. Preparación de medios

1. Para preparar una solución de trabajo PMSG de 50 UI/mL, disuelva 5.000 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG) en 100 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: Alicuota la solución en porciones de un solo uso de 1 mL y guárdalas a –20 °C. Descongela cada alicuota a temperatura ambiente justo antes de usarla.
2. Para preparar el medio de cultivo IVM, añadir los ingredientes indicados en la Tabla 1 a 100 mL del medio base Medium 199 (M199). Ajusta el pH a 7,3–7,4, luego filtra el medio estéril a través de un filtro de 0,22 μm en botellas de medio estéril. Etiqueta el frasco como "IVM" con las iniciales, la fecha de fabricación y la fecha de caducidad, y guárdalo a 4 °C durante hasta 1 mes.
3. Para preparar una solución de hialuronidasa al 0,1% (p/v), disuelva 10 mg de hialuronidasa en 10 mL de medio M2.
   NOTA: Guarda en alicotas de un solo uso de 1 mL a –20 °C y calienta hasta 37 °C antes de su uso.

3. Preparación de platos (Figura 2)

NOTA: Ajustar el número de gotas de IVM, FIV y IVC según el número esperado de COCs y embriones, utilizando 20–30 COCs por gota de 100 μL para IVM y FIV y 20–30 embriones por gota de 100 μL para cultivo embrionario.

1. Preparar un número adecuado de recipientes para la recogida de ovocitos de 35 mm, cada uno con 2 mL de medio M2 suplementado con 0,2 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Usa un plato para la punción de ovario y la recogida de COC (uno por cada dos mujeres), y otro para lavar los COCs. Precalienta los platos a 37 °C antes de usarlos.
2. Prepara platos de IVM.
   1. En un plato de 60 mm, prepara cinco gotas de 100 μL de medio IVM para lavar (etiqueta el plato como "lavado IVM").
   2. En un recipiente separado de 60 mm, prepara varias gotas de 100 μL de medio IVM para la maduración (etiqueta el plato como "IVM").
   3. Añade cuidadosamente suficiente aceite mineral para cubrir las gotas y equilibra los platos a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5% durante al menos 2 horas antes de comenzar la recogida de ovocitos.
3. Prepara platos para FIV.
   1. En un plato de 60 mm, prepara una o dos gotas de 300 μL de medio de cultivo embrionario pre-equilibrado para liberar y capacitar el esperma (etiqueta el plato como "Capacitación espermática").
      NOTA: La segunda gota de capacitación se prepara como reserva para casos en los que la motilidad espermática en la primera gota es insuficiente, debe recogerse y capacitar una nueva muestra epididimal de esperma, o debe ajustarse la concentración de esperma antes de la inseminación.
   2. Prepara dos platos separados de 60 mm, cada uno con cinco gotas de 100 μL de medio de cultivo preequilibrado para lavar (etiqueta el plato como "lavado con FIV").
      NOTA: Utilice un plato de "lavado de FIV" para lavar los COCs maduros por FIV antes de la inseminación, y el otro plato de "lavado de FIV" para lavar cigotos presuntos tras la coincubación y así eliminar células cúmulo y espermatozoides residuales.
   3. En un recipiente separado de 60 mm, preparar varias gotas de 100 μL de medio de cultivo embrionario preequilibrado para la inseminación (etiqueta el plato como "FIV").
      NOTA: El medio de cultivo embrionario preequilibrado se utiliza tanto para la capacitación como para la inseminación espermática para mantener condiciones consistentes durante la preparación y fertilización del esperma.
   4. Añade cuidadosamente suficiente aceite mineral para cubrir las gotas y equilibra los platos a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5% durante al menos 12 horas antes de comenzar el procedimiento de capacitación espermática.
4. Prepara platos de IVC.
   1. En un plato de 60 mm, preparar cinco gotas de 100 μL de medio de cultivo embrionario preequilibrado para lavar embriones (etiqueta el plato como "lavado IVC").
   2. En un recipiente separado de 60 mm, preparar varias gotas de 100 μL de medio de cultivo embrionario preequilibrado para cultivo embrionario (etiquete el plato como "IVC").
   3. Añade cuidadosamente suficiente aceite mineral para cubrir las gotas y equilibra los platos a 37 °C en una incubadora con 5% de_CO2 durante al menos 12 horas antes de comenzar el cultivo del embrión.

4. Colección de ovarios

1. Administrar 10 UI de PMSG intraperitonealmente a ratones C57BL/6 hembras de 8–10 semanas.
2. A las 48 horas tras la inyección de PMSG, eutanasiar al ratón mediante una luxación cervical y colocarlo boca abajo. Rocía el abdomen con etanol al 70% para mojar el pelaje y evitar que entre en la cavidad abdominal.
3. Con tijeras finas de disección, haz una pequeña incisión en la parte baja de la piel abdominal y abre suavemente la piel con las manos enguantadas para exponer la membrana peritoneal.
4. Abre la membrana peritoneal y mueve suavemente los intestinos hacia un lado. Localiza el cuerno uterino y sigue el proceso hacia el ovario. Identifica el ovario cerca del riñón, normalmente rodeado por una almohadilla grasa.
5. Utiliza tijeras finas para diseccionar el ovario del cuerno uterino y elimina el exceso de tejido conectivo y grasa.
6. Transfiere inmediatamente los ovarios a un medio M2 precalentado suplementado con IBMX. Repite el procedimiento para recoger el ovario contralateral y transferirlo al mismo plato.
7. Coloca el plato bajo un estereomicroscopio y procede con la punción folicular y la recogida de COCs.

5. Colección y cultura de los COCs

1. Bajo un estereomicroscopio, perfora suavemente los folículos antrales visibles con una aguja de jeringuilla estéril para liberar los COCs en el medio M2.
   NOTA: Al recoger ovocitos en estadio GV de ratón, prefiere puncionar los folículos antrales visiblemente grandes en la superficie ovárica, que suelen parecer abultados y semitranslúcidos con una cavidad antral clara.
2. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estirado finamente, recoge los COCs liberados y transfierelos a una bandeja limpia de 35 mm que contenga medio M2 precalentado y complementado con IBMX.
3. Lavar los COCs mediante transferencia en serie a una zona limpia del plato de 35 mm según sea necesario para eliminar células de granulosa desprendidas y restos de tejido, dejando residuos en cada transferencia (Figura 3).
   NOTA: Utilice solo COCs con tres o más capas compactas de células cúmulas y citoplasma uniformemente granulado sin espacios libres para los pasos^{siguientes 9,10}. Los ovocitos GV desnudados y los ovocitos GV parcialmente encerrados en cúmulo están excluidos de este protocolo. En nuestras condiciones experimentales, se obtuvieron una media de 26 COCs inmaduros por ratón hembra.
4. Tras la eliminación de restos, transfiere los COCs al recipiente de lavado IVM y lámbralos mediante transferencia secuencial a través de cinco gotas de 100 μL de medio de lavado IVM.
   NOTA: Durante las transferencias, minimiza el volumen de transferencia para evitar la contaminación cruzada entre gotas.
5. Transfiere los COCs lavados a gotas de 100 μL de medio IVM (20–30 COCs por gota) y cultiva a 37 °C en un 5% de_CO2 durante 14 horas.
   NOTA: Recoger, lavar y transferir los COCs a un medio IVM con un retraso mínimo para ayudar a mantener el potencial de desarrollo.
6. (Opcional) Después de la IVM, incubar brevemente los COCs con 1 mg/mL de hialuronidasa y pipetearlos suavemente repetidamente con una micropipeta hasta que las células cúmulo estén completamente eliminadas.
   NOTA: Limita la exposición a la hialuronidasa a un máximo de 3 minutos, ya que una exposición prolongada puede dañar los ovocitos.
7. (Opcional) Lava los ovocitos desnudados en medio M2 fresco sobre una plataforma calentada y luego evalúa la maduración de los ovocitos bajo un estereomicroscopio.
8. (Opcional) Los ovocitos con un primer cuerpo polar extruido se consideran maduros y en la etapa de metafase II (MII). Calcular la tasa de maduración como el número de ovocitos con un primer cuerpo polar extruido dividido por el número total de ovocitos cultivados.
   NOTA: Los pasos 5.6–5.8 se utilizan para evaluar la maduración de los ovocitos tras la MIV, desnudando una cohorte de evaluación designada antes de la puntuación de PB1. Estos pasos no son necesarios para los COC que pasan directamente a FIV.

6. Recogida y preparación del esperma

NOTA: Esta sección describe la recogida y capacitación de esperma fresco. Antes de la inseminación, los espermatozoides recién liberados deben incubarse en un medio de cultivo embrionario preequilibrado a 37 °C durante 1 hora para permitir la capacitación.

1. Eutanasiar a un ratón DBA/2 macho maduro (10–16 semanas de edad) y retirar sus epidídimos cauda, evitando la mayor cantidad posible de grasa, sangre y fluido tisular (Figura 4).
2. Para cada hombre, transfiere ambos epidídimidos de la cauda a una gota de 300 μL de medio G-IVF preequilibrado para liberación y capacitación del esperma.
3. Inmoviliza el epidídimo cauda usando un par de pinzas, realiza entre cinco y siete cortes en el epidídimo cauda con una aguja estéril y exprime suavemente el tejido para liberar esperma concentrado.
   NOTA: Evalúe la motilidad del esperma y procede solo cuando la mayoría de los espermatozoides muestren motilidad progresiva (PR), definida como movimiento activo hacia adelante, en lugar de motilidad no progresiva (NP) o inmotilidad¹¹.
4. Incuba el plato a 37 °C en un 5% de CO₂ durante 1 hora para permitir la capacidad del espermatozoide.

7. Fertilización in vitro

1. Tras 14 horas de MIV, lava los COCs mediante transferencia secuencial a través de cinco gotas de 100 μL de medio de lavado FIV, y luego transfiere los COCs lavados a las gotas de inseminación de FIV (20–30 COCs por gota de 100 μL).
2. Preincubar el plato de fertilización que contiene COCs a 37 °C en un 5% de CO₂ durante 30 minutos antes de la inseminación.
3. Tras la capacitación, determina la concentración de espermatozoides usando un hemocitómetro.
4. En función de la concentración de espermatozoides, calcular el volumen del inoculo requerido y añadir espermatozoides capacitados a cada gota de FIV para lograr una concentración final de 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ espermatozoides/mL.
   NOTA: Tras la adición de esperma, confirma que hay espermatozoides móviles presentes en cada gota de inseminación.
5. Incubar los platos de FIV que contienen COCs y esperma a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante 4–6 horas.

8. Cultivo de embriones

1. Tras 4–6 horas de incubación, se utiliza una pipeta Pasteur de vidrio estirado finamente con un diámetro interior ligeramente mayor que el ovocito para aspirar los cigotos presuntivos en volumen mínimo y transferirlos a las gotas de lavado de FIV.
2. Lava los cigotos presuntos mediante transferencia secuencial a través de cinco gotas de lavado de FIV, pipeteando suavemente dentro de cada gota para eliminar el exceso de esperma y restos (Figura 5).
3. Transfiere los cigotos presuntivos lavados a la bandeja de lavado de la VCI y lávalos por transferencia secuencial a través de cinco gotas de lavado de medio embrionario precalentado, minimizando la retención del medio de FIV.
4. Colocar los cigotos presuntos en gotas de cultivo en medio de cultivo embrionario y cultivar a 37 °C en 5% de CO₂ (20–30 embriones por gota de 100 μL).
5. A las 6–8 horas de la inseminación, evalúa la fertilización bajo un estereomicroscopio evaluando la presencia de pronúcleos masculinos y femeninos, y descarta los ovocitos que retienen solo un cuerpo polar y no muestran pronúcleos visibles.
6. A las 24 horas de la inseminación, se cuenta el número de embriones de dos células y se calcula la tasa de dos células como (embriones de dos células / ovocitos inseminados).
7. Tras el contar, retirar y descartar los embriones sin herden, y continuar cultivando los embriones separados restantes.
   NOTA: En esta etapa, los embriones pueden ser vitrificados, transferidos a las hembras receptoras o mantenidos en cultivo hasta la etapa de blastocisto.
8. Continúa cultivando los embriones bajo las mismas condiciones de incubación hasta 96 horas después de la inseminación (hpi). Evalúa la formación de blastocistos a 96 hpi según criterios morfológicos.
   NOTA: No se requiere más cambio de medio durante este periodo. Un blastocisto normal se identifica por la presencia de una cavidad blastocela visible, una masa celular interna distinta y una capa de trofectodermo intacta.

Resultados

Utilizando este protocolo, los COCs de ratón se procesaron secuencialmente mediante maduración in vitro , fertilización in vitro y posterior cultivo in vitro de embriones, resultando en generación reproducible de embriones preimplantacionales y desarrollo hasta la etapa de blastocisto bajo las condiciones descritas. Tras 14 horas de IVM, los COCs solían mostrar expansión de cúmulos y morfología intacta de los ovocitos. La maduración meiótica de los ovocitos se ...

Discusión

Este protocolo proporciona un procedimiento estandarizado para la maduración in vitro de ovocitos de ratón, fertilización in vitro y cultivo in vitro utilizando COCs inmaduros, permitiendo la generación y evaluación reproducible de embriones preimplantacionales a través de la etapa de blastocisto bajo condiciones in vitro definidas. En muchos estudios, los resultados de la MIV son sensibles a diferencias específicas del laboratorio en el medio de comun...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing, China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibrated) embryo culture medium
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X