Un algoritmo de análisis de formas cuantifica la morfología espacial y el contexto del cultivo celular 2D a 3D para una cuantificación novedosa de fenotipos

Summary

Este artículo explica cómo se pueden cuantificar nuevas características morfológicas en células y organoides utilizando la transformada de coordenadas polares comprimidas linealizadas (LCPC), un algoritmo espacial que captura propiedades que las métricas tradicionales, como el área, el volumen y la superficie superficial, no pueden. Se discuten las mejores prácticas para la orientación y alineación de las formas.

Abstract

Numerosos estudios han demostrado que el fenotipo morfológico de una célula u organoide se correlaciona con su susceptibilidad a agentes anticancerígenos. Sin embargo, los métodos tradicionales de medición del fenotipo se basan en métricas espaciales como el área, el volumen, el perímetro y la intensidad de la señal, que funcionan pero son limitadas. Estos enfoques no pueden medir muchas características cruciales del contexto espacial, como la quiralidad, una propiedad de la zurda y la derecha. El volumen no puede usarse para registrar la quiralidad porque los zapatos izquierdo y derecho tienen el mismo volumen. Aunque el contexto espacial en forma de quiralidad, dirección gravitatoria y eje de polaridad resulta intuitivo para los humanos, las métricas tradicionales utilizadas hasta la fecha por biólogos celulares, patólogos, radiólogos y profesionales del aprendizaje automático no pueden captar estas nociones fundamentales. La transformada de coordenadas polares comprimidas linealizadas (LCPC) es un algoritmo novedoso que puede capturar un contexto espacial como cualquier otra métrica. La transformada LCPC traduce un contorno bidimensional (2D) en una onda sinusoidal discreta superponiendo un sistema de cuadrícula que sigue los puntos de intersección entre el contorno y las líneas de la cuadrícula. Convierte el contorno en una secuencia de pares de coordenadas discretas, siendo la coordenada independiente (coordenada x) correspondiendo a posiciones consecutivas en el espacio 2D. Cada coordenada dependiente (coordenada y) consiste en la distancia entre una intersección entre la curva de nivel y la línea de cuadrícula hasta el origen o línea base del sistema de cuadra. En forma de una onda sinusoidal discreta, se aplica la Transformada de Fourier Rápida a los datos. De este modo, las formas de las células en cultivo celular 2D y 3D se representan de forma sistemática y multidimensional, permitiendo una estratificación cuantitativa robusta que revelará conocimientos sobre la resistencia al tratamiento.

Introduction

El cultivo de organoides tridimensionales (3D) ha demostrado ser superior al cultivo celular bidimensional (2D) en la imitación de la biología^{in vivo 1,2}. Los organoides se han vuelto indispensables en la investigación del cáncer para el cribado de tratamientos efectivos y para obtener conocimientos sobre la progresión de la^enfermedad 3,4,5,6. Aunque es bien sabido en biología del cáncer que las distinciones morfológicas se correlacionan con un comportamiento biológico distinto de células y tejidos, el campo se basa en métricas tradicionales de forma que son limitadas en alcance. Este estudio describe un novedoso algoritmo espacial que cuantifica objetivamente características morfológicas sutiles con una precisión sin precedentes, superando enfoques tradicionales como el área, el volumen y la superficie.

La transformada linealizada de coordenadas polares comprimidas (LCPC) fue inventada para describir objetiva y cuantitativamente morfologías complejas observadas en histopatología tisular, con el objetivo de mejorar la gradación de pólipos^{de colon 7}. El deseo de ampliar este enfoque para capturar características espaciales basadas en resonancia magnética macroscópica en patologías cerebrales, como el trastorno bipolar y la enfermedad de Alzheimer, llevó a aumentos que lo potenciaron aún más. Este estudio describe el protocolo paso a paso y las mejores prácticas para aplicar dos versiones de la transformada LCPC: el sistema de cuadrícula paralela y el sistema de cuadrícula radial, ambas con scripts de código abierto y vídeos tutoriales.

Además de los métodos geométricos tradicionales, existen múltiples abstracciones que han sido efectivas para medir las formas complejas de células y órganos. Estos incluyen medir la excentricidad, la asimetría, el contraste y la kurtosis, junto con momentos de Zernike para capturar circularidad, asimetría, irregularidad de bordes y estructura global^{de contornos 8,9,10}. El análisis fractal también ha sido útil para reducir contornos complejos a valores escalares, como la Dimensión Fractal, que mide cuán irregular es el contorno, y la lacunaridad, que mide lo heterogéneamente irregulares que aparecen los huecos en el^{contorno 11,12}. Para medir texturas, el método Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) es popular para medir contraste, energía, homogeneidad, correlación y^{entropía 13,14}. Aunque todos estos métodos son beneficiosos, ninguno fue diseñado para captar contexto espacial, como la dirección de la gravedad, la izquierda frente a la diestra, o la ubicación de la estructura central de soporte que influye en la dirección del cambio de forma. Además, muchos de ellos producen un único valor escalar o solo unos pocos valores escalares para representar información espacial, por lo que los estudios citados suelen usarlos en combinación para evaluar formas complejas.

La transformada LCPC fue diseñada para producir muchas características a partir de una sola medición y para permitir la adición de marcadores espaciales que codifican el contexto espacial en la forma, como la dirección de la gravedad. El método más cercano a la transformada^{LCPC 7} se publicó un año después del¹⁵, compartiendo la misma idea central como punto de partida: aplicar la transformada de Fourier a los contornos de las celdas para medir la forma en forma de un espectro de frecuencias. Sin embargo, la transformada LCPC se desarrolló de forma independiente para aplicarse mediante sistemas de cuadrícula distintos que estaban destinados a usarse junto con el conocimiento del contexto espacial fuera de la forma que se está midiendo. Además, el inventor de la transformada LCPC explica en este manuscrito que el espectro de frecuencias resultante contiene enormes cantidades de información espacial oculta. El Archivo Suplementario 1 contiene una extensa discusión sobre contextos espaciales en biología que a menudo se pasan por alto al usar los métodos citados y cómo la transformada LCPC puede aplicarse para capturar este contexto. Para los lectores cuyos datos de forma no muestran diferencia entre grupos control y experimentales, ya sea que sus ojos puedan ver diferencia en las formas, o cuyos datos de forma muestren muy poca diferencia, aunque sospechen que debería haber una diferencia mayor, deberían probar la transformada LCPC.

La transformada LCPC proporciona un nivel de precisión sin precedentes en la medición de información espacial porque representa formas en múltiples dimensiones. A diferencia de los métodos tradicionales, como el área y el volumen, que solo producen un valor escalar por forma (es decir, 25 cm²), los resultados de la transformada LCPC pueden dar lugar a múltiples índices, cada uno correlacionado con un aspecto morfológico diferente de una forma (es decir, redondez vs. nitidez de las esquinas, suavidad vs. dentada de los bordes). La transformada LCPC describe una forma 2D superponiendo una cuadrícula de líneas rectas que se intersectan con su contorno. Cada sistema de cuadrícula tiene un origen (Figura 1) o una línea base (Figura 2) desde la cual medir la distancia lineal. Consulte las Figuras 1B y 2B para diagramas de flujo simplificados que describen el algoritmo. Se detecta cada punto de intersección entre las líneas de la cuadrícula y el contorno de la forma. La distancia de cada intersección se calcula entonces en relación con una línea base u origen. De este modo, la transformada LCPC convierte las formas 2D en una serie de pares consecutivos de coordenadas x-y. La coordenada x representa la posición de la línea de cuadrícula desde cero hasta el infinito, mientras que la coordenada y representa la distancia de la intersección a la línea base u origen. En esta forma, que es una onda sinusoidal discreta, se aplica la transformada rápida de Fourier (FFT) para convertir los datos del "dominio de posición" al dominio de la frecuencia. Si la coordenada x representara el tiempo, entonces el "dominio de posición" sería equivalente al "dominio del tiempo" en las aplicaciones estándar de la FFT.

Mientras que el sistema de cuadrícula radial mide la distancia de cada intersección desde el origen de la cuadrícula radial (Figura 1A), el sistema de cuadrícula paralela siempre mide la distancia de las intersecciones con referencia a una línea imaginaria situada a la izquierda de la forma (Figura 2A). El script de código abierto determina la posición de esta línea imaginaria encontrando el píxel más a la izquierda del contorno y luego moviendo 10 píxeles hacia la izquierda de esta posición. Aquí, la coordenada x de esta posición se convierte en la línea de referencia desde la que se calculan todas las intersecciones. Esta regla de los 10 píxeles es arbitraria, pero por eso todos los contornos analizados por el script de código abierto para el sistema de cuadrícula paralela deben tener al menos 15 píxeles de espacio en blanco en los cuatro lados.

Para formas 2D con pliegues o múltiples capas, las líneas de cuadrícula pueden intersectar el contorno más de una vez. En este caso, las distancias de todas las intersecciones a lo largo de una línea de cuadrícula se suman a un solo valor. Así, cada línea de cuadrícula tiene solo una coordenada x y una coordenada y. Esta suma se representa con el término "comprimido" en el nombre de transformada LCPC. La representación de una forma 2D no lineal en una onda sinusoidal discreta se representa con el término "linealizada" en el nombre del algoritmo. Por último, el término "coordenadas polares" está en el nombre del algoritmo porque el primer sistema de cuadrícula conceptualizado fue una cuadrícula radial de 180 grados de coordenadas^{polares 7}. Incluso después de darse cuenta de que las coordenadas polares y cartesianas son intercambiables, el nombre del algoritmo se mantuvo tal cual. La sección de agradecimientos describe las razones personales que motivaron la invención y ampliación de la transformación LCPC.

El Protocolo 1 era la secuencia para obtener los datos mostrados en la Figura 3B, mientras que el Protocolo 2 era la secuencia para obtener los datos mostrados en la Figura 3C–D. Los pasos de estos protocolos están implementados en scripts Python individuales disponibles en el repositorio de GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. El Protocolo 1 es un ejemplo de los pasos de preprocesamiento para derivar la "forma pura" en preparación para la transformación LCPC. El Protocolo 2 es un ejemplo de pasos de preprocesamiento para medir formas "a escala", es decir, a sus escalas originales entre sí.

La segmentación puede realizarse manualmente en software de procesamiento de imágenes, como la Vista Previa de Mac o la Paint de Microsoft, o utilizando métodos basados en umbrales. Si se hace manualmente, se debe elegir uno de los siguientes cuatro colores: azul, verde, rosa/magenta o rojo. El repositorio de GitHub llamado "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ contiene una carpeta llamada "color extraction scripts". Esta carpeta contiene cuatro archivos Jupyter Notebook con código Python que extraen los cuatro colores mencionados y los convierten en máscaras azules sobre fondo blanco. Este proceso también puede realizarse umbralizando el color del contorno en un software de procesamiento de imágenes como Fiji/ImageJ. Para imágenes que contienen contornos con bordes en contacto o bordes superpuestos (por ejemplo, un diagrama de Venn), deberán separarse mediante software de procesamiento de imágenes, de modo que se conviertan en objetos independientes en la imagen compuesta de la máscara que contiene múltiples contornos organoides. Esto no se aplica a imágenes que contienen solo un organoide o varios organoides que no se tocan entre sí.

Protocol

Las células humanas primarias utilizadas en este estudio fueron obtenidas y cultivadas bajo aprobaciones éticas y procedimientos de consentimiento informado previamente^{reportados 17}. Las imágenes presentadas aquí se generaron a partir de esos cultivos celulares aprobados y se publican por primera vez. Se recogieron muestras de tejido en el Brigham and Women's Hospital y en la Universidad de California, San Francisco, bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB), de pacientes que proporcionaron su consentimiento informado para el uso en investigación de sus tejidos, como se describió^{anteriormente 17}. No se realizó ninguna recogida adicional de ejemplares humanos para este estudio.

1. Extraer la forma pura de los contornos organoides 2D para la transformada LCPC

1. Segmenta el borde exterior de cada organoide usando cualquier software de procesamiento de imágenes, como Paint de Microsoft, Preview de MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Extrae los contornos de los organoides como máscaras abiertas que son líneas azules sobre un fondo blanco.
3. Aísla cada contorno azul sobre su propio lienzo blanco.
   NOTA: Este paso solo es necesario si una imagen contiene más de un contorno.
4. Recorta cada contorno para que tenga un margen de un píxel en los cuatro lados del objeto azul.
5. Añade 100 píxeles de espacio en blanco en los cuatro lados para crear nuevos márgenes.
6. Gira los objetos de modo que la longitud interna más larga sea horizontal.
   NOTA: Este paso convierte la línea interna más larga dentro de cada objeto en el ancho del objeto. Existen dos guiones disponibles para este propósito. Para formas cerradas, utiliza el Cuaderno Jupyter llamado "Rotar el objeto CERRADO horizontal por el Length_v2.ipynb interno más largo". Para formas abiertas o con múltiples componentes, utiliza el Jupyter Notebook llamado "Rotate Green Line_v3.ipynb". La herramienta Rotar Línea Verde tiene un tutorial en vídeo que está enlazado en el archivo ReadMe contenido en la misma carpeta que el archivo .ipynb.
7. Recorta cada imagen para que tenga un margen de un píxel en los cuatro lados del objeto azul.
   NOTA: Esto es lo mismo que el Paso 1.4. El propósito de recortar esta vez, sin embargo, es que el siguiente paso de redimensionamiento redimensiona todo el lienzo, no solo el objeto azul que hay en él. Así, al hacer que el objeto azul tenga casi el mismo ancho y altura que el propio lienzo, redimensionar el lienzo a 400 píxeles también redimensiona el objeto a casi 400 píxeles de ancho. Existe un Jupyter Notebook llamado "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Redimensiona el ancho del lienzo de cada imagen a 400 píxeles mientras también limitas la relación de aspecto.
   NOTA: Este paso hace que cada objeto tenga el mismo ancho. Restringir la relación de aspecto evita que el objeto se deslice durante el redimensionamiento. Hay un Jupyter Notebook llamado "Redimensionar el ancho a 400 píxeles pero limitar la relación de aspecto.ipynb".
9. Añade 100 píxeles de espacio en blanco en los cuatro lados para crear nuevos márgenes.
10. Gira cada imagen 90 grados en sentido horario o antihorario para que la longitud interna más larga sea vertical, siendo coherente con la elección de todas las imágenes.
    NOTA: En la secuencia anterior, la forma pura se obtiene implementando secuencialmente los pasos 1.6, 1.7, 1.8 y 1.9. Añadir espacio de margen en el Paso 1.9 es necesario para evitar errores en los scripts de transformación LCPC que se harán a continuación, pero no implica extraer la forma pura. Los usuarios que deseen medir formas "a escala" no necesitan realizar los pasos 1.6, 1.7 y 1.8 en la secuencia anterior, aunque aún así deben preprocesar sus imágenes de máscara para lograr una orientación óptima antes de aplicar la transformada LCPC.
11. Realiza la transformación LCPC en cada curva de nivel. Utiliza scripts en Python proporcionados para el método de cuadrícula^{radial 18} o el método de cuadrícula^{paralela 19}.

2. Extracción de formas a escala de contornos organoides 2D para la transformada LCPC

NOTA: El método paso a paso para extraer la forma a escala de los objetos es similar al que se realiza para extraer la forma pura en el Protocolo 1 anterior. Los pasos se nombran de forma idéntica en ambos protocolos para facilitar la coincidencia. Por favor, consulte las notas del Protocolo 1 para cada paso. La principal diferencia entre la forma pura y la forma a escala es que la forma a escala no requiere los pasos 1.6, 1.7 y 1.8, que son los pasos de redimensionamiento.

1. Segmenta el borde exterior de cada organoide. Utiliza un enfoque computacional o hazlo manualmente mediante un software básico de edición de imágenes, como Paint de Microsoft, Preview de MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Extraer los contornos de los organoides como máscaras abiertas que son líneas azules sobre un lienzo blanco. Usa Fiji/ImageJ para extraer máscaras o el script en Python^{proporcionado 16}.
3. Aísla cada contorno azul sobre su propio lienzo blanco. Usa Fiji/ImageJ para extraer máscaras o el script en Python^{proporcionado 16}.
4. Recorta cada contorno para que tenga un margen de un píxel en los cuatro lados del objeto azul. Usa Fiji/ImageJ o el script en Python^{proporcionado 16}.
5. Añade 100 píxeles de espacio en blanco en los cuatro lados para crear nuevos márgenes. Usa Fiji/ImageJ o el script en Python^{proporcionado 16}.
6. Gira cada contorno de modo que su línea interna más larga sea vertical. Usa Fiji/ImageJ o el script en Python^{proporcionado 16}.
7. Realiza la transformación LCPC en cada curva de nivel. Utiliza scripts en Python proporcionados para el método de cuadrícula^{radial 18} o el método de cuadrícula^{paralela 19}.

Results

La transformada LCPC de la rejilla radial aplicada a organoides de cáncer de mama

Los organoides y tumores 3D pueden adoptar una variedad de formas, algunas de las cuales son obviamente diferentes al ojo humano, aunque las métricas tradicionales arrojan diferencias estadísticamente insignificantes. Por otro lado, los organoides también pueden mostrar formas que parecen heterogéneas y, por tanto, insignificantes al ojo humano, enmascarando morfologías sutiles recurrentes que representan subtipos distintos. Se extrajeron organoides mamarios primarios humanos de pacientes y se cultivaron en 3D siguiendo un protocolo^{previamente publicado 17, 20 y 21}. La Figura 3A muestra tres categorías morfológicas accesibles basándose en la inspección visual: un fenotipo quístico, un fenotipo poliquístico y un fenotipo poliquístico denso. La Figura 3B muestra que los contornos exteriores de estos organoides se segmentaban manualmente y se extraía su forma pura, lo que elimina el efecto del tamaño en sus formas. Debido a que los contornos eran circulares, se aplicó la transformada LCPC de rejilla radial a las formas puras, seguida de PCA. Ten en cuenta que los contornos superpuestos en la Figura 3B se rotaron de modo que la línea interna más larga es vertical, lo que significa que sus orientaciones no son las mismas que en sus imágenes fuente. La Figura 3B muestra un gráfico de puntos de los dos primeros componentes principales (PCs), y el agrupamiento K-medias identificó tres grupos: 0, 1 y 2. Las puntuaciones de silueta (SS) confirmaron la probable existencia de dos clusters separados entre los Clústeres 0 vs. 1 (SS = 0,68) y los Clústeres 1 vs. 2 (SS = 0,69), indicando al tiempo que indican una débil separación entre Clústeres 0 vs 2 (SS = 0,27). A pesar de la débil puntuación de silueta entre los Clústeres 0 y 2, etiquetar los puntos de datos con la forma pura de cada uno justifica que el Clúster 2 representa el fenotipo más distintivo: contornos altamente asimétricos y no circulares (el grosor de los contornos no importa en este caso).

Aunque la forma pura elimina el efecto del tamaño sobre la forma, lo cual es imposible al medir área y volumen, medir los contornos organoides a escala también revela ideas interesantes. La Figura 3C muestra un gráfico de puntos 3D de los tres primeros PCs resultante de la transformación LCPC de la cuadrícula radial realizada en los contornos mientras se segmentaban de las imágenes sin ningún redimensionamiento. Este enfoque significa que la transformada LCPC mide simultáneamente tanto la forma como el tamaño de los organoides. La Figura 3C muestra que los organoides poliquísticos y densos están menos densamente empaquetados en comparación con los organoides quísticos. Para cuantificar esta expansión, la Figura 3D muestra la dispersión de cada fenotipo en su espacio compartido de PCA. La distancia media al Vecino más cercano (KNND) se calcula para cada fenotipo, lo que permite la evaluación visual de la densidad decreciente de los puntos que van desde organoides quísticos (KNND = 1,061) hasta organoides poliquísticos (KNND = 1,575) y organoides poliquísticos densos (KNND = 2,247); Esta disminución de la densidad de puntos también puede interpretarse como un aumento de la heterogeneidad morfológica de los contornos exteriores. Por último, para comparar la transformada LCPC con la métrica tradicional de área, la Figura 3E muestra que, aunque existe una significación estadística entre el área de organoides quísticos y organoides poliquísticos densos (p = 0,016, prueba de suma de rangos de Wilcoxon), no hay indicación, basada en el área, de que existan tres grupos morfológicos distintos a través de los fenotipos, identificados por agrupamiento K-means tras el análisis puro de forma LCPC (Figura 3B) o que existe una heterogeneidad morfológica creciente, como lo muestra el análisis LCPC a escala (Figura 3C–D). La Figura 3E muestra una dispersión decreciente de los puntos de datos que van de organoides quísticos a poliquísticos y luego densos, lo que es lo opuesto a lo observado por el análisis LCPC a escala (Figura 3C), destacando que la información espacial capturada por la transformada LCPC es diferente de la que captura el área.

El mismo enfoque se aplica a formas 2D individuales en la Figura 3, y la Figura Suplementaria 1 también se aplica al contorno de las células en cultivos celulares 2D: células individuales (como los glóbulos rojos) o grupos de células (como en las citologías cervicales). Los estudios piloto para cada uno de estos casos se describen en vídeos: análisis de forma de organoides cerebrales que presentan distintos grados de plegamiento en su contorno externo²²; análisis de forma de alvéolos pulmonares in situ, los mismos principios pueden aplicarse al análisis de cultivos celulares^{2D 23}; análisis de forma del tejido cervical a partir de citologías en las que tanto el contorno del núcleo como de la membrana celular se cuantifican simultáneamente mediante la transformación 24 de la rejilla radial LCPC^; análisis de forma de glóbulos rojos infectados por malaria y células adyacentes a células infectadas pero que no están infectadas²⁵; análisis de forma de glóbulos rojos afectados por la enfermedad de células^{falciformes 26}.

El sistema de cuadrícula paralela para medir la densidad o textura como índice de información espacial

La información espacial implica más que las nociones habituales de forma, como cuadrado, redondez y curvatura, porque abarca conceptos como la textura y la densidad. Las redes tubulares complejas, como los vasos sanguíneos o las redes ramificadas, como los filamentos del citoesqueleto, no encajan en la noción de forma en el mismo sentido que nuestra intuición geométrica de las formas, como círculos y polígonos. Sin embargo, la densidad y la textura son nociones muy útiles de la información espacial para entender la estructura y función de células, organoides y tumores. Al tratar cómo cuantificar redes complejas en imagen de fluorescencia, los biólogos celulares miden características como la intensidad media de la señal dentro de una imagen o el porcentaje del área total de una imagen que contiene una señal. Estos enfoques reconocen que hay más en la información espacial que lo que se describe en términos de motivos geométricos.

El patrón de redes vasculares dentro de tejidos, tumores y órganos en un chip no se define fácilmente con motivos geométricos tradicionales, pero se beneficia de la interpretación como textura y densidad. La remodelación vascular en el desarrollo tumoral y la resistencia al tratamiento es una característica bien establecida del cáncer (revisada en²⁷). Se analizaron secciones histopatológicas de 458 tumores neuroblásticos^{primarios en 28}, caracterizando la densidad, tamaño y forma de los vasos sanguíneos y segmentos vasculares totales. Encontraron que los vasos sanguíneos eran más grandes, más abundantes y con formas más irregulares en los tumores de pacientes con factores pronósticos deficientes en comparación con los tumores de la cohorte favorable. Curiosamente, se acuñó un término llamado "vasos que encapsulaban grupos tumorales" (VETC)²⁹ para describir un patrón de vasos sanguíneos que rodean grupos de pequeños tumores dentro de un carcinoma hepatocelular más grande y que se asocian con tasas más altas de metástasis y recurrencia. El mismo grupo que acuñó el término descubrió posteriormente que el carcinoma hepatocelular positivo para VETC se correlacionaba con una respuesta positiva al tratamiento con el inhibidor de la quinasa^{Sorafenib 30}. Por tanto, la capacidad de cuantificar los patrones vasculares es crucial para el pronóstico y la comprensión de los mecanismos de resistencia.

Para cuantificar redes densas de tubos, islas y ramas, el sistema de cuadrícula paralela de la transformada LCPC es útil para medir lo que puede llamarse densidad de textura, en lugar de forma. Como ejemplo de cómo la transformada LCPC de rejilla paralela puede hacer esto, la Figura 4A muestra patrones de microvasculatura cardíaca de un estudio de la vasculatura^{cardíaca 31}: a simple vista, distinguir objetiva y cuantitativamente los patrones entre las áreas infartadas y las áreas en una región alejada del lugar de la lesión es muy difícil. Extrayendo la máscara de los vasos sanguíneos (Figura 4A Paso 1) y aplicando la transformada LCPC de rejilla paralela, se pueden observar diferencias cuantitativas. Primero, para mejorar la limpieza de los datos, cada imagen fue recortada con un círculo de diámetro uniforme, centrado en el centro de la imagen cuadrada (Figura 4A Paso 2), lo que garantiza que cada imagen tenga la misma altura y ancho independientemente de las rotaciones. A continuación, las imágenes recortadas se rotan de modo que el eje principal de los recipientes (flechas dobles rojas en la Figura 4A Paso 1) sea vertical (Figura 4A Paso 3). Luego, se aplica una línea azul a la circunferencia de la imagen para asegurar que incluso las imágenes con patrones vasculares dispersos tengan el mismo diámetro en términos de píxeles azules (Figura 4A Paso 4). Los pasos 3 y 4 se realizaron usando el software Fiji/ImageJ (v2.14.0). Por último, se aplica la transformada LCPC de rejilla paralela (Figura 4A Paso 5). Analizar los resultados mediante PCA y graficar las tres primeras PCs revela que las regiones infartadas se agrupan separadamente de las regiones remotas (Figura 4B). Los cálculos de la distancia biselada (CD) cuantifican los patrones visuales que muestran los gráficos. Un día después de la lesión, el sitio infarto presenta un patrón vascular más alejado de la condición basal (basal vs. 1Day_infarct: CD = 83,89) que el sitio no lesionado (Basal vs 1Day_remote: CD = 53,95). Un día después de la lesión, el sitio remoto no lesionado está más cerca del lugar lesionado (1Day_remote frente a 1Day_infarcxt: CD = 34,48) que de la condición basal. A los 3 días de la lesión, los patrones vasculares del sitio lesionado y del sitio remoto no lesionado asociado muestran una desviación drástica respecto a la condición basal y entre sí (Basal vs. 3Days_Infarct: CD = 240,63; Basal vs. 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote vs. 3Days_Infarct: CD = 168,35). Muy interesantemente, a los 7 días de la lesión, los patrones vasculares del sitio lesionado y del sitio remoto no lesionado ocupan un espacio 3D aproximadamente ortogonal a la condición basal, mientras que están alineados a una distancia más cercana que al día siguiente a la lesión (CD = 24,76 para el día 7 frente a 34,48 para el día 1). Los datos sugieren dos cosas: (1) a medida que avanza la cicatrización, el patrón vascular del sitio lesionado y del sitio remoto no lesionado adopta patrones distintos de la condición basal; (2) El programa de reconstrucción activado en el lugar dañado también provoca cambios morfológicos similares en sus sitios remotos no lesionados asociados.

Como referencia para la versatilidad de la transformada LCPC, se calcularon las métricas tradicionales de porcentaje de área (Figura 5A) y perímetro total (Figura 5B) de vasos sanguíneos. Aunque el área y el perímetro revelan cambios entre puntos en el curso temporal, no proporcionan una cuantificación coherente de disposiciones espaciales distintas de los buques. El área y el perímetro son abstracciones que pueden representar muchas disposiciones vasculares diferentes y, por tanto, no son informativas sobre cómo cambia la disposición espacial de los vasos a lo largo de las condiciones de tratamiento y el curso temporal. Con n = 3 para cada grupo, la prueba t y la prueba de Wilcoxon son poco fiables. El Delta de Cliff es no paramétrico y funciona bien para mostrar un cambio en el tamaño del efecto. La principal diferencia que se revela al medir el porcentaje de área de vasos sanguíneos es entre la condición basal y los puntos de tiempo de 7 días; Para el perímetro total de vasos sanguíneos, las diferencias son entre la condición basal frente a 1 día y la condición basal frente a 7 días. Sin embargo, el área y el perímetro no indican que existan diferencias entre los lugares del infarto y sus sitios remotos no heridos, lo cual resulta muy sorprendente dado que el lugar del infarto fue dañado intencionadamente. Aquí es donde surge la versatilidad de la transformada LCPC en comparación con las métricas tradicionales. Para cada muestra, los resultados de la FFT como parte de la transformada LCPC producen un conjunto de magnitudes asociadas a un conjunto de frecuencias. Las magnitudes de cada intervalo de frecuencia pueden promediarse y luego compararse entre los grupos de tratamiento (Figura suplementaria 1). Esto permite una evaluación sencilla de qué contenedores de frecuencia presentan las mayores diferencias entre los grupos de tratamiento. La Figura 5C muestra seis contenedores que muestran diferencias claras en el tamaño del efecto entre varios grupos de tratamiento, especialmente entre los sitios infartados y sus sitios remotos no lesionados asociados, cuyo área y perímetro indicaron que no había diferencias. Los valores independientes en estos seis contenedores proporcionan múltiples índices que muestran diferencias cuantitativas entre condiciones de tratamiento. Curiosamente, el patrón entre los grupos para el Bin 1 de los resultados de la transformada LCPC es similar al resultado obtenido al medir el perímetro total. Sin embargo, los otros índices revelan diferencias cuantitativas ocultas tanto en área como en perímetro. Índices únicos de la condición basal: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Índices únicos entre los grupos del Día 1: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Índices únicos de los grupos del Día 3: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Índices únicos de los grupos del Día 7: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Estos datos destacan la versatilidad y precisión de la transformación LCPC respecto a los enfoques tradicionales de área y perímetro.

Figura 1: Descripción del sistema de rejilla radial de la transformada LCPC. (A) Paso 1: La forma de interés se segmenta y extrae como una máscara azul. Paso 2: Se determina un cuadro delimitador (también conocido como el rectángulo más pequeño que encierra y toca el objeto por los cuatro lados) para la máscara. Un sistema de líneas de cuadrícula radial que parten del centro de la caja delimitadora se superpone a la máscara. La decisión de elegir el centro de la caja delimitadora en lugar del centroide del objeto como origen fue arbitraria. Paso 3: La distancia de cada intersección entre una línea de cuadrícula y la forma se calcula en relación con el origen. Las líneas de cuadrícula que tienen más de una intersección suman todas esas distancias de intersección en un solo valor para esa línea de cuadrícula. Paso 4: Se aplica la FFT para convertir los datos del Paso 3 en un gráfico de frecuencia, una representación multidimensional estática (Paso 5) de la forma del Paso 1. Paso 6: Se puede crear un valor escalar a partir del Paso 5 mediante un índice. Consulta la Figura 10 para una discusión sobre los tipos de índices a calcular. (B) Un diagrama de flujo que muestre una descripción simplificada de los pasos de la transformada LCPC para el sistema de cuadrícula radial. (C) Ejemplos de temas de formas para los que el sistema de cuadrícula radial es óptimo. Las formas se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Descripción del sistema de cuadrícula paralela de la transformada LCPC. (R) Paso 1: La forma de interés se segmenta manualmente y se extrae como una máscara binaria. Paso 2: Se superpone un sistema de cuadrícula paralela a la forma, que se rota de modo que la base quede horizontal. Paso 3: La distancia de cada intersección entre una línea de cuadrícula y la forma se calcula en relación con la línea base. Las líneas de cuadrícula que tienen más de una intersección suman todas esas distancias de intersección en un solo valor para esa línea de cuadrícula. Paso 4: La FFT se aplica para convertir los datos del Paso 3 en un gráfico de frecuencia, una representación multidimensional estática de la forma del Paso 1. Paso 6: Se puede crear un valor escalar a partir del Paso 5 mediante un índice. Consulta la Figura 10 para una discusión sobre los tipos de índices a calcular. (B) Un diagrama de flujo que proporciona una descripción simplificada de los pasos de transformación LCPC para el sistema de cuadrícula paralela. (C) Ejemplos de temas de forma para los cuales el sistema de cuadrícula paralela es óptimo. Las formas se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: La transformada LCPC identifica objetivamente subtipos morfológicos de organoides del cáncer de mama. (A) Los organoides mamarios humanos primarios se derivaron como se informó^previamente 17,20,21 y como se describe en el Archivo Suplementario 1. Se pudieron observar y clasificar tres fenotipos basándose en la inspección visual: quístico, poliquístico y poliquístico denso. Barra de escala = 50 μm. (B) Los contornos exteriores de los organoides se segmentaron manualmente (Figura suplementaria 2; criterios descritos en el Archivo Suplementario 1), y se obtuvo la forma pura de estos contornos. Obsérvese que los contornos en el diagrama están todos rotados de modo que la línea interna más larga sea vertical; por lo tanto, no coinciden con sus orientaciones originales. A continuación, se aplicó la transformada LCPC de rejilla radial y los resultados se analizaron mediante PCA. El agrupamiento K-means identificó tres grupos (0, 1 y 2), y se calcularon puntuaciones de silueta (SS) para confirmar su existencia. Cluster 0 vs 1, SS: 0,68; Cluster 0 vs 2, SS: 0,27; Cluster 1 vs 2, SS: 0,69. (C) Los contornos exteriores de los organoides también se midieron usando la transformada LCPC de cuadrícula radial sobre sus formas a escala, es decir, las formas tal como aparecen en las imágenes entre sí, sin ningún cambio de tamaño. El recuadro se agranda para mostrar el empaquetamiento más lajo de organoides poliquísticos y densos en comparación con los organoides quísticos. Para B y C: Verde = quístico, Morado = poliquístico, Amarillo = poliquístico denso. (D) Los tres primeros valores de PC se representan graficamente para cada fenotipo por separado, y la KNND media se calcula para mostrar que el fenotipo quístico es el más densamente empaquetado, mientras que los fenotipos poliquísticos y poliquísticos densos presentan menor densidad (es decir, mayor heterogeneidad). Aunque se representan por separado, los tres fenotipos comparten el mismo espacio de PCA. Para el fenotipo quístico, la KNND media se calculó a partir del recuadro porque los valores atípicos presentes solo en este fenotipo sesgan el cálculo. Cánceres de convivencia promedio (KNND): Quístico, 1,061; Poliquístico, 1,575; Poliquística densa, 2,247. (E) Los diagramas de caja del área de los organoides muestran una dispersión decreciente de los puntos de datos de organoides quísticos a poliquísticos y luego densos, lo que es lo opuesto a lo observado en el análisis LCPC a escala (Figura 3C), destacando que la información espacial capturada por la transformada LCPC difiere de la que captura el área. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Medición de la densidad de textura con la transformada LCPC de la rejilla paralela. (A) Fotomicrografías de microvasculatura en tejido cardíaco se obtuvieron previamente en otro^{estudio 31,32}. Las imágenes no se reproducen a partir de estos estudios como tales; más bien, representan nuevas vistas generadas a partir del mismo conjunto de datos original de imágenes^{3D reportado en el 31} y proporcionado por Gkontra. Aunque el conjunto de datos ya se ha publicado previamente, las imágenes específicas que se muestran aquí se publican por primera vez. No se muestran imágenes de los lugares remotos que no resultaron heridos en cada momento. Paso 1: Se genera una máscara 2D y se determina el eje general de alineación de los recipientes (flecha doble roja). Paso 2: Se obtiene una región circular centrada en el punto medio de la imagen para forzar que cada imagen tenga la misma altura después de que las imágenes se hayan rotado en distintos grados en el siguiente paso (rotar imágenes cuadradas en distintos grados alterará la altura de la imagen dependiendo del grado de rotación). Paso 3: Cada imagen se rota de modo que el eje general de alineación determinado en el Paso 1 sea vertical. Paso 4: Se aplica un borde azul uniforme alrededor de cada imagen para asegurar que cada imagen tenga el mismo diámetro, ya que las imágenes con densidades más dispersas pueden ser más cortas (ejemplo: véase "7 días tras el infarto de miocardio" en el paso 3). Paso 5: Se aplica la transformada LCPC de rejilla paralela. (B) Gráficos de puntos de los tres primeros PCs de la salida de la transformada LCPC de la cuadrícula paralela (Púrpura: condición basal, Verde: sitio infarto, Amarillo: sitio no lesionado remoto al sitio infarto). Consulte la sección de resultados para los cálculos de distancias biseladas en cada momento entre las tres condiciones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: La transformada LCPC mide características ocultas en el área y el perímetro. Para comparar con las métricas de forma tradicionales, se midieron (A) el porcentaje de área y (B) el perímetro total de las redes vasculares. (C) Para mostrar la precisión que se puede obtener del resultado de la transformada LCPC, se comparó el valor de los bines de frecuencia individuales resultantes de la FFT (Figura suplementaria 1). Se eligieron seis contenedores de frecuencia como índices para cuantificar objetivamente las diferencias entre los grupos de tratamiento. Para todos los paneles, debido al tamaño limitado de la muestra de cada grupo (n = 3), se calculó el Delta de Cliff no paramétrico para el tamaño del efecto en lugar de un valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: La importancia de orientar las formas de forma sistemática para extraer datos limpios. (A) Un ejemplo de formas idénticas que son imágenes especulares unas de otras, y cómo el sistema de cuadrícula paralela determina su orientación distinta, produciendo así resultados diferentes. (B) Un ejemplo de cómo voltear la Forma 2 horizontalmente, de modo que su orientación ahora coincida con la Forma 1 y se convierta en una comparación más justa con la Forma 1. En esta configuración, la transformada LCPC de cuadrícula paralela da los mismos resultados tanto para la Forma 1 como para la Forma 2. Esta alteración de orientación solo debe hacerse si no existe un contexto espacial que sugiera que la Forma 2 no deba modificarse. (C) Un ejemplo de cuatro variantes de objetos que se parecen al número "3", con algunos que miran en la dirección equivocada. (D) Un ejemplo de cómo orientar cada objeto para maximizar la limpieza de los datos que resultarán de la transformación LCPC de la cuadrícula paralela. (E) Un ejemplo de medir el abultamiento más ancho de los elementos del Panel C basado en las mismas reglas de orientación que para el Panel D. (F) Un ejemplo de medir las bombillas grandes de los elementos en el Panel C pero manteniendo su contexto de alineación como en el Panel D. La motivación de mantener las reglas de alineación en el Panel D es diseccionar la contribución de la información espacial en el abultamiento más amplio en relación con la contribución del abultamiento más estrecho dentro de estas reglas. Véase la Figura Complementaria 3 para los espectros FFT asociados a C–F. Las imágenes de A a B son iconos de Microsoft PowerPoint. Las formas en C-F se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: La incapacidad de las métricas tradicionales de forma para registrar un contexto evidente. (A) La serie de marcas de verificación tiene la misma forma pero aumenta de tamaño de izquierda a derecha. En esta serie, el área de cada marca de verificación es diferente mientras que el concepto de forma permanece igual: es decir, siguen siendo el mismo estilo de marcas. (B) Un cuadrado se gira alrededor de su centro 45 grados hasta que su concepto de forma se convierte en lo que los humanos llaman diamante. Aunque el concepto de forma de un cuadrado es muy distinto al de un diamante, las rotaciones intermedias se interpretan subjetivamente como "cuadrados inclinados" o "diamantes inclinados". La transformada LCPC puede medir objetivamente y con precisión la diferencia en cada paso de esta serie. Las formas se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Explicación de la forma pura vs. la forma a escala. Medir objetos "a escala" significa medir la forma de los objetos según su tamaño original en relación entre sí. "Forma pura", en cambio, significa medir la forma de diferentes objetos a una escala similar, lo que elimina el efecto del tamaño en la forma. Es importante encontrar una forma objetiva de redimensionar los objetos que se están comparando. La línea interna más larga suele ser la opción óptima (Paso 1). Ambos objetos se rotan de modo que la línea interna más larga sea horizontal (Paso 2). En este caso, los dos objetos también se rotan de modo que el lado hundido quede orientado hacia abajo. A continuación, el ancho de cada objeto, que ahora es la misma magnitud que la línea interna más larga de cada objeto, se redimensiona para ser de 400 píxeles de ancho, al mismo tiempo que se limita la relación de aspecto para evitar que los objetos se desvíen (Paso 3). Por último, es opcional girar los objetos redimensionados 90 grados (Paso 4) (en este caso, en sentido antihorario) antes de aplicar la transformada LCPC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Ejemplo de marcadores espaciales para la investigación del cáncer. (A) Un ejemplo hipotético de células migrando en cultivos 2D expandiendo sus lamelilipodos en la dirección de la migración. En el contexto de la morfología migratoria de las células epiteliales, orientar el contorno de cada celda de modo que la línea interna más larga que se alinea con el eje de migración sea vertical tiene más sentido para captar el contexto espacial. (B) Ejemplos hipotéticos de tumores o lesiones precancerosas que crecen dentro de una carcasa que no cambia de forma. La lesión crece a partir de un tallo, que es la estructura central de soporte. A medida que la lesión crece o se marchita, su contorno se desplaza hacia o alejándose de la pared interna de la carcasa. Las líneas punteadas representan una forma racional y objetiva de definir cuánto del recubrimiento debe trazarse (línea naranja), de modo que no se añada ni muy poca ni demasiada información adicional. (C) La opción 1 muestra la transformada LCPC de cuadrícula paralela aplicada al contorno de las lesiones sin contexto de dónde se encuentra el recubrimiento. La opción 2 muestra lo mismo, pero incluyendo el contexto espacial de dónde se encuentra el encapsulamiento. Por ejemplo, los puntos rojos representan intersecciones entre la línea de la cuadrícula (flecha negra, línea verde) y el contorno. La Opción 2 da como resultado que cada línea de cuadrícula forme una cuarta intersección que no existe en la Opción 1, lo que añade cuantitativamente un contexto espacial al resultado de la Opción 2 que está completamente ausente en la Opción 1. Las formas se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10: Resultados hipotéticos de la FFT e índices comunes que se pueden derivar de ellos. (A) Se muestra el gráfico de frecuencia resultante de la FFT de dos formas hipotéticas. Dado que las magnitudes en el Bin 3 y el Bin 4 muestran una tendencia opuesta, una relación entre estos dos bins será un buen índice que represente una diferencia entre estas dos formas. Las líneas punteadas roja y verde representan otros compartimentos de frecuencia que podrían usarse para obtener buenos índices. (B) Un histograma de dos formas hipotéticas cuyos perfiles FFT muestran una tendencia decreciente escalonada como representación de sus diferencias morfológicas. (C) Un histograma de dos formas hipotéticas cuyos perfiles FFT difieren más en la región central a lo largo del tramo de los bins de frecuencia. (D) Ejemplos de características morfológicas hipotéticas que pueden dar lugar a índices que se correlacionan con su presencia. Las formas se dibujaban en Microsoft PowerPoint. Estas imágenes son creadas por autores y no requieren ninguna licencia de publicación ni permisos de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Diagramas de bigote en caja que comparan las magnitudes de varios bins de frecuencia a través de los resultados de la transformada LCPC de redes vasculares. La transformada LCPC de las redes vasculares mostrada en las Figuras 4 y 5 da un conjunto de binas de frecuencia y sus magnitudes que representan cada imagen. Se utilizan gráficos de bigote caja de las magnitudes de cada contenedor para comparar todos los grupos de tratamiento, identificando cuál contenedor sirve mejor como índice para estratificar la densidad de textura medida mediante la transformada LCPC. Cada gráfico de caja y bigote consta de n = 3 imágenes independientes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Ejemplo de organoides segmentados de tumores mamarios. Los organoides eran segmentados manualmente por un experto que los cultivaba habitualmente y los observaba bajo microscopía. Esta figura muestra ejemplos de contornos organoides segmentados. La barra de escala para todas las imágenes microscópicas es de 50 μm. Las células humanas primarias utilizadas en este estudio se obtuvieron y cultivaron bajo aprobaciones éticas y procedimientos de consentimiento informado^{reportados 21}. Las imágenes presentadas aquí derivan de esos cultivos celulares aprobados y se publican por primera vez. No se realizó ninguna recogida adicional de especímenes humanos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 3 suplementaria: espectros FFT para formas en la Figura 6. Los resultados de las FFT para las formas de la Figura 6 se proporcionan aquí para que los lectores puedan entender el efecto de alterar la orientación de la forma en su información espacial. La columna izquierda de los grafos tiene ejes y sin alterar, mientras que la columna derecha tiene ejes truncados de modo que se pueden visualizar los valores de bin más pequeños. (A) Espectros de la transformada LCPC de la cuadrícula paralela de las cuatro formas de la Figura 6C tal como se muestran, lo que significa que no hay reorientación. (B) Espectros de la transformada LCPC de la cuadrícula paralela de las formas de la Figura 6D, que han sido reorientadas tal y como se describe en el texto. (C) Espectros de la transformada LCPC de la cuadrícula paralela de las formas en la Figura 6E. (D) Espectros de la transformada LCPC de la cuadrícula paralela de las formas en la Figura 6F para comparación con los de la Figura 6E. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Detalles extensos sobre las mejores prácticas para la transformación LCPC. Este archivo complementario ofrece una amplia discusión sobre las mejores prácticas y notas metodológicas adicionales. El esquema del documento es el siguiente: Sección 1 - Contexto espacial que el área, el volumen, el perímetro y la rugosidad no pueden capturar. Sección 2 - Mejores prácticas para utilizar la transformada LCPC e interpretar resultados. Sección 3 - Comprender la polaridad inherente de la naturaleza para maximizar la transformada LCPC. Sección 4 - Interpretación de espectros FFT resultantes de la transformada LCPC. Sección 5 - Cómo orientar las formas antes de medirlas con la transformada LCPC. Sección 6 - ¿Qué es "Forma pura" frente a "Forma a escala"? Sección 7 - Notas metodológicas sobre métodos estadísticos. Sección 8 - Notas metodológicas sobre cultivo celular y segmentación de organoides. Sección 9 - Parámetros de la FFT para quienes programan su propia transformación LCPC. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Como en cualquier herramienta computacional, la calidad de la salida depende de si las entradas cumplen con las reglas esperadas alrededor de las cuales fue diseñada la herramienta. Las siguientes reglas deben seguirse y usarse como controles de calidad al utilizar los scripts Python proporcionados. Primero, asegúrate de que las máscaras abiertas sean líneas azules sobre fondo blanco. El azul fue una decisión arbitraria y no tiene importancia, pero los scripts que realizan la transformación LCPC fueron escritos para buscar píxeles azules sobre un fondo blanco. Segundo, no ejecutes los scripts de transformación LCPC en imágenes que tengan menos de 10 píxeles de espacio en blanco en los cuatro lados. Consulta este vídeo para una explicación del porqué: "El parámetro de grosor de margen - Cómo preparar contornos de forma"³³. Tercero, este script asume que los contornos de tu objeto son píxeles azules sobre un fondo blanco. El grosor de la línea debe estar entre 5 y 10 píxeles. Consulta este vídeo para una explicación del porqué: "El parámetro de grosor de línea - Cómo preparar contornos de forma"³⁴. Cuarto, no ejecutes los scripts de transformación LCPC sobre imágenes en blanco. Esto causará un error en el script. Quinto, no ejecutes los scripts de transformación LCPC sobre imágenes que consisten solo en una mota de escombros. Esto causará un error porque el sistema de cuadrícula puede no detectar el punto y por tanto intentar analizar una imagen en blanco. En sexto lugar, no ejecutes los scripts de transformación LCPC sobre imágenes que contengan motas de escombros no deseados. Los escombros alterarán la altura y el ancho del objeto de la máscara abierta y, por tanto, provocarán resultados inexactos. Séptimo, mira este vídeo para entender por qué es importante comprender la escala de tus objetos antes de analizarlos con la transformada LCPC: "El Parámetro de Escala - Cómo Preparar Contornos de Forma^"35.

Uno de los aspectos más sorprendentes de la transformación LCPC es su capacidad para capturar el contexto espacial. La biología está llena de contexto espacial crucial para entender la naturaleza. Por ejemplo, las células epiteliales tienen polaridad^apical-basal 36,37,38,39. Además, la dirección de la gravedad, que se altera en condiciones de microgravedad, tiene efectos significativos tanto en la fisiología de los astronautas^40,41 como en la morfología de las células^cancerosas 42,43,44. Por último, la preneoplasia in situ y la neoplasia pueden crecer hasta convertirse en lumens a través de un tallo que actúa como estructura central de soporte, proporcionando acceso al suministro sanguíneo. Así, cuando estas lesiones regresan, retroceden tanto desde la cavidad luminal como hacia el tallo^45,46. Como fue diseñada para ello, la transformada LCPC es muy sensible al contexto espacial y, por tanto, puede introducir una heterogeneidad extra si el usuario no tiene cuidado. La Figura 6 describe cómo orientar sistemáticamente las formas antes de aplicar la transformada LCPC. La Figura 7 describe cómo la geometría tradicional no puede medir conceptos de forma que son evidentes para los humanos. La Figura 8 ofrece un diagrama que visualiza la diferencia entre medir la forma pura y la forma a escala. La Figura 9 describe que el contexto espacial a menudo se pasa por alto al cuantificar formas en cultura 2D, histología y cortes 2D a partir de imágenes 3D. Cabe señalar que, debido a limitaciones de espacio, el Archivo Suplementario 1 contiene una extensa discusión sobre la Figura 6 y la Figura 7 en la Sección 5, y la Figura 8 y la Figura 9 en la Sección 6.

Dado que la FFT produce datos espectrales multidimensionales, es importante que el usuario se sienta cómodo derivando índices a partir de patrones recurrentes en los espectros. Aunque este manuscrito se refiere a la transformada LCPC como el paso de aplicación de la FFT, la transformada LCPC real ocurre antes del paso FFT (Figura 1A–B Paso 4, Figura 2A–B Paso 3). Sin embargo, aplicar la FFT revela conocimientos objetivos y sistemáticos desde el dominio de la frecuencia de la salida de la transformada LCPC. Por tanto, la transformada LCPC no sería tan efectiva sin incluir la FFT como paso final. En la transformada LCPC, la FFT da lugar a una serie de bins y sus magnitudes, todos ellos una representación multidimensional estática de la entrada de contorno en el Paso 1. Una analogía de una representación multidimensional estática de la información es el número de teléfono de nueve dígitos que representa el canal de comunicación telefónica de una persona en Estados Unidos. Aunque son engorrosos en comparación con las representaciones escalares de formas (como 85 cm de longitud, 56 grados de ancho, etc.), los datos multidimensionales contienen mucha más información para extraer conocimientos. La Figura 10 muestra varios patrones espectrales que se han observado al aplicar la transformada LCPC y cómo derivar índices a partir de ellos. La Sección 4 del Archivo Suplementario 1 analiza la Figura 10 con mayor profundidad.

El dominio de la frecuencia de la transformada LCPC revela características objetivas y cuantitativas de una forma 2D que el ojo desnudo no puede percibir fácilmente. Diferencias muy sutiles en curvatura, irregularidad y tortuosidad pueden cuantificarse de forma robusta. Sin embargo, una vez identificados subtipos morfológicos mediante este método, se pueden observar temas visualmente distintos que se correlacionan con las diferencias cuantitativas. Esta característica hace que la transformada LCPC sea interpretable como un método para extraer información espacial para modelos de aprendizaje automático (ML) y hace que los propios modelos de aprendizaje automático resultantes sean más interpretables. Aunque las redes neuronales son un método potente de aprendizaje automático, sus resultados a menudo no son interpretables para humanos, lo que supone un problema importante para el campo de la inteligencia artificial médica (IA). Los médicos son reacios a emplear un modelo de aprendizaje automático para decisiones clínicas si no entienden por qué el modelo toma malas decisiones. Además, si ningún humano entiende por qué o cómo un modelo tomó una decisión sesgada, entonces corregir esto se vuelve intratable.

Vale la pena añadir a la discusión sobre la medición de la densidad de texturas (Figuras 4 y 5) que el ojo humano se confunde fácilmente por ilusiones ópticas o patrones desordenados. La disposición improvisada de patrones complejos suele interpretarse como aleatoria, no medible o que no merece la pena medir. La transformada LCPC puede medir diferencias objetivas y cuantitativas reproducibles en patrones aparentemente aleatorios. Sin embargo, a menos que el usuario esté entrenado para no dejarse engañar por patrones caóticos y desordenados que se disfrazan de aleatoriedad, no se intentará medir el trastorno para descubrir patrones predecibles. Los patrones predecibles son una clara indicación de que el sistema no es completamente aleatorio. La transformada LCPC fue inventada con el propósito de medir formas que son sutilmente diferentes o inconcebiblemente diferentes a simple vista. Dado que muchas morfologías en la naturaleza presentan diferencias menores que parecen más heterogeneidad caótica sin sentido que subtipos predecibles de desorden —cada uno correlacionado con funciones biológicas distintas—, se desarrolló el siguiente marco conceptual de los "Cuatro Pasos" para usarse junto con la transformada LCPC. Primero, resistir la idea de que un sistema de aspecto complicado sea aleatorio. Segundo, llamar a la heterogeneidad caótica "desorden" y luego encontrar un tipo de orden que pueda servir como condición de referencia racional. Hipotetiza que el trastorno se desvía de la referencia. Tercero, encontrar una forma objetiva de medir el patrón que es la referencia, como la transformada LCPC. Cuarto, aplicar este mismo método objetivo para medir lo que se considera el desorden en el sistema.

Materials

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook