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Artículo de método

Un ensayo in vitro para la degradación de LpxC por la proteasa FtsH unida a membranas y el adaptador LapB de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71092

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22 de junio de 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Escherichia coli regula la biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS) principalmente controlando la degradación de LpxC, la desacetilasa que cataliza el primer paso comprometido de la síntesis de LPS. El objetivo de este protocolo es establecer un ensayo sensible y cuantitativo de degradación in vitro para LpxC, utilizando la proteasa AAA+ reconstituida FtsH y el adaptador LapB en proteolisomas.

Resumen

Este protocolo presenta un ensayo sensible y cuantitativo de degradación in vitro de LpxC utilizando la proteasa FtsH reconstituida AAA+ (ATPasa asociada a diversas actividades celulares) y el adaptador LapB en proteolisomas. Las proteasas AAA+ son máquinas moleculares dependientes de ATP que mantienen la homeostasis de las proteínas y regulan diversos procesos celulares en el citoplasma o en las membranas celulares. En comparación con sus contrapartes citoplasmáticas, las proteasas AAA+ vinculadas a membranas siguen estando mal caracterizadas debido a desafíos técnicos en la reconstitución y medición de su actividad in vitro. Aquí, utilizamos el sistema FtsH–LapB–LpxC como modelo para desarrollar un ensayo de degradación basado en fluorescencia en proteolipósomas. FtsH y LapB se reconstituyen en proteoliliposomas para imitar el entorno de membrana nativo, y LpxC se marca covalentemente con el colorante fluorescente Atto488. La degradación se inicia combinando proteoliliposomas con LpxC y ATP marcados y termina con ácido tricloroacético (TCA). Un ensayo exitoso se define por un aumento dependiente del tiempo en la fluorescencia en la fracción sobrenadante soluble tras la precipitación de TCA, correspondiente a la liberación de fragmentos de péptidos fluorescentes generados por la proteólisis de LpxC. Esta señal permite la cuantificación directa de las tasas iniciales de degradación bajo condiciones definidas. En comparación con los ensayos tradicionales basados en electroforesis en gel de dodecilo sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), este método proporciona una sensibilidad sustancialmente mejorada y permite el análisis cinético cuantitativo. Además, el sistema de proteoliposomas permite una investigación sistemática de cómo los componentes proteicos, como adaptadores y antiadaptadores, así como la composición lipídica, influyen en la degradación de LpxC. Aunque se desarrolló para el sistema FtsH–LapB–LpxC, este ensayo es fácilmente adaptable a otras proteasas y sustratos AAA+ unidos a membranas, proporcionando una base general para estudiar la proteólisis asociada a membranas in vitro.

Introducción

Las proteasas AAA+ son máquinas moleculares conservadas y dependientes de ATP que desempeñan un papel central en el control de calidad de proteínas y en la proteólisisreguladora 1,2. Estas máquinas contienen un anillo hexamérico de dominio AAA+ ATPases, que hidrolizan ATP, reconocen, despliegan y translocan los sustratos al dominio proteasa compartimental para ladegradación 1. Mientras que las proteasas AAA+ citoplasmáticas como ClpXP3 y Lon4 han sido ampliamente caracterizadas mediante ensayos in vitro bien establecidos, las proteasas AAA+ unidas a membranas siguen siendo relativamente poco comprendidas. Esta brecha refleja en gran medida los desafíos técnicos asociados a reconstituir proteínas de membrana en ambientes lipídicos definidos y a medir cuantitativamente su actividad proteolítica in vitro. El objetivo general de este método es establecer ensayos sensibles y cuantitativos para investigar la actividad proteolítica de proteasas unidas a membranas.

FtsH es la única proteasa AAA+ esencial en Escherichia coli y actúa como una proteasa AAA+ prototípica unida amembranas 5,6,7. Anclada a la membrana interna por hélices transmembranaras N-terminales, FtsH degrada un conjunto diverso de sustratos citoplasmáticos y asociados a membrana, regulando así el control de calidad de las proteínas de membrana, las respuestas al estrés y la homeostasislipídica 8,9,10,11. Uno de sus sustratos mejor caracterizados es LpxC, una desacetilasa soluble que cataliza el primer paso comprometido en la biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS) 12,13. La degradación eficiente de LpxC por FtsH requiere la proteína de membrana LapB, que actúa como un adaptador para reconocer específicamente LpxC y entregarla a laproteasa 14,15,16,17,18.

A pesar de su importancia fisiológica, el análisis cuantitativo de la proteólisis in vitro mediada por FtsH ha sido limitado, especialmente para sustratos citoplasmáticos como LpxC. Los ensayos tradicionales de degradación in vitro utilizan FtsH purificado en micelasdetergentes 13,19, que no proporcionan el entorno de membrana para la proteasa anclada en membrana. Además, los ensayos de degradación suelen depender de la detección basada en SDS–PAGE de la desaparición delsustrato 13, que puede ser laboriosa, de bajo rendimiento y insuficientemente sensible para análisis cinéticos. Más recientemente, FtsH reconstituida en bicelas se ha utilizado para estudiar la degradación de sustratos de membrana, como lo impulsó el grupo20 de Heedeok Hong; sin embargo, sigue faltando un sistema comparable para analizar sustratos citoplasmáticos. Aquí, adaptamos la reconstitución de la bicela de Heedeok Hong a la reconstitución de proteoliposomas para imitar el entorno de membrana. Además, el sustrato soluble en agua LpxC está marcado con fluorescencia, lo que permite una medición sensible y cuantitativa de la cinética de la degradación dependiente de FtsH/LapB de LpxC in vitro.

Este método debe emplearse cuando los investigadores necesiten medir cuantitativamente la proteólisis mediada por FtsH de sustratos solubles en agua. Ofrece varias ventajas respecto a los enfoques existentes. En primer lugar, la detección basada en fluorescencia de productos proteolíticos, en lugar de la desaparición del sustrato, mejora sustancialmente la sensibilidad y el rango dinámico, facilitando comparaciones cuantitativas de la actividad proteolítica. En segundo lugar, el uso de proteoliliposomas preserva el contexto de membrana necesario para el funcionamiento de FtsH, permitiendo un control preciso sobre la composición de proteínas ylípidos 18. Por último, aunque se desarrolló utilizando el sistema FtsH–LapB–LpxC, este protocolo es fácilmente adaptable a otras proteasas AAA+ unidas a membranas y sus sustratos citoplasmáticos que requieren maquinaria de degradación asociada a membranas.

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Protocolo

1. Etiquetado de LpxC con Atto488

  1. Preparación de LpxC
    1. Expresa y purifica la proteína LpxC según se informóanteriormente, 18. Intercambiar el tampón de LpxC purificado de Tris por un tampón fosfato de 50 mM, pH 7,6 (6 mMNaH 2PO4, 44 mM Na2HPO 4, 150 mM NaCl) mediante filtración en gel mediante una columna de filtración en gel de alta resolución (por ejemplo, columna Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Concentra LpxC usando una columna de ultrafiltración hasta una concentración final de al menos 5 mg/mL a 4 °C.
  2. Etiquetado de LpxC con Atto488
    1. Diluir 0,5 mg de LpxC en 50 mM de tampón de fosfato, pH 7,6, hasta un volumen final de 225 μL. Añadir 25 μL de 1 M bicarbonato sódico para ajustar el pH a aproximadamente 8,3.
    2. Disolver 0,24 mg de colorante reactivo Atto488 en 20 μL de 0,1 M de tampón de bicarbonato de sodio para preparar una solución de stock (0,012 mg/μL). Preparar una solución de trabajo diluyendo 2 μL de la solución original con 18 μL de tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M, obteniendo una concentración final de 0,0012 mg/μL.
    3. Añadir inmediatamente 4 μL de la solución de trabajo Atto488 a la solución proteica (correspondiente a una proporción molar de LpxC: Atto488 de 3:1). Envuelve el tubo con papel de aluminio y incuba a 4 °C durante 2 horas con una agitación suave (18 rpm).
      NOTA: Tanto la culata como las soluciones de trabajo de Atto488 pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C.
  3. Separación de LpxC–Atto488 del tinte libre
    1. Equilibrar una columna de desalación PD-10 con 10 mL de agua ultrapura, seguida de 15 mL de tampón fosfato de 50 mM, pH 7,6.
    2. Aplica la mezcla de reacción de etiquetado a la columna y deja que entre completamente en la resina.
    3. Elute con 5 mL de tampón fosfato de 50 mM, pH 7,6. Deben hacerse visibles dos bandas distintas correspondientes a LpxC–Atto488 (primera banda) y el tinte libre Atto488 (segunda banda). Recoge fracciones de la primera banda en ~0,5 mL de alicotas.
    4. Analizar fracciones eluídas mediante SDS-PAGE. Visualiza la fluorescencia bajo iluminación UV antes de la tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. Agrupar fracciones que contienen LpxC–Atto488 y concentrar la proteína marcada en aproximadamente 2 mg/mL.
    6. Estima la eficiencia del marcado midiendo la concentración de proteínas y la concentración de Atto488 usando un espectrofotómetro de microvolumen.
      NOTA: Una proporción de concentración de Atto488 (en pmol/μL) a concentración de LpxC (en mg/mL) en el rango de 2–5 indica un nivel de marcado adecuado. Esto corresponde a una proporción molar de Atto488 a LpxC que varía de 1:15 a 1:6 tras el marcado.
    7. Alocuota de LpxC–Atto488 en tubos microcentrífugas de 1,5 mL, se congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. En este punto, el protocolo puede pausar hasta 3 meses.
      PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es extremadamente frío; Manejarlo con el equipo de protección adecuado (guantes criogénicos, protección ocular).

2. Reconstitución de FtsH/LapB en proteoliliposomas

  1. Preparación de liposomas
    1. Transfiera 100 mg de 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) en cloroformo a un tubo de ensayo de cristal. Evapora el disolvente bajo un suave chorro de N₂, seguido de un secado nocturno al vacío.
      NOTA: El POPC tiene una temperatura de transición de fase de ~-2 °C y es ampliamente utilizado en biofísica de membranas, formulaciones de liposomas y sistemas modelo celular.
      PRECAUCIÓN: El cloroformo puede dañar los ojos, la piel, el hígado, los riñones y el sistema nervioso. Se requiere el equipo de protección adecuado (guantes, protección ocular, mascarilla) durante el manejo. Maneja la capa con una jeringuilla de cristal.
    2. Añade 1.315 μL de buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) a la película seca de POPC. Resuspende los lípidos alternando 1 minuto de sonicación en baño de maria con 1 minuto de vórtice a máxima velocidad durante un total de ~15 minutos, o hasta que estén completamente dispersados. (concentración final de lípidos: 100 mM).
      NOTA: Para mejorar la resuspensión lipídica, ajusta la profundidad de inmersión del tubo de ensayo de vidrio en el sonicador de baño de agua para maximizar la agitación. Los lípidos resuspendidos pueden almacenarse a -20 °C. En este punto, el protocolo puede pausar hasta un mes.
    3. Alicuota la suspensión del liposoma en porciones de 200 μL y almacenarla a -20 °C.
  2. Extrusión de liposomas
    1. Descongelar una alicuota de liposoma de 200 μL en un baño maría a temperatura ambiente y diluir con 800 μL de tampón A hasta un volumen final de 1 mL.
    2. Someter a los liposomas a tres ciclos de congelación y descongelación alternando entre nitrógeno líquido y un baño maria a temperatura ambiente.
    3. Enjuaga jeringuillas, dos soportes filtrantes y una membrana de policarbonato de 200 nm con buffer A. Monta el mini-extrusor y extruye los liposomas 20 veces.
      NOTA: La suspensión del liposoma debe parecer transparente tras la extrusión.
    4. Dividir la suspensión de liposomas extruidos de 1 mL en tres tubos (330 μL por tubo) y diluir cada uno con 600 μL de buffer A.
  3. Titulación por hinchazón del Triton X-100
    NOTA: El Triton X-100 es un detergente de baja concentración crítica de micelas (CMC), y ha demostrado ser el más exitoso en muchoscasos 21
    PRECAUCIÓN: El Triton X-100 es un químico peligroso, que causa principalmente daños oculares graves, irritación cutánea y efectos nocivos si se ingiere. Durante el manejo se requiere equipo de protección adecuado (guantes, protección ocular).
    1. Prepara el 10% (v/v) del Triton X-100 mezclando 100 μL de Triton X-100 con 900 μL de agua ultrapura, e incubándolo en un shaker para disolver completamente el Triton X-100.
    2. Mide la absorbancia de liposomas a 540 nm (A₅₄₀) usando un espectrofotómetro.
    3. Añadir 5 μL de alicotas de 10% de Triton X-100 secuencialmente, mezclando suavemente tras cada adición, y medir A₅₄₀. Sigue añadiendo Triton X-100 hasta que A₅₄₀ alcance un máximo, luego añade Triton X-100 4–5 veces más hasta que la absorbancia disminuya hasta aproximadamente el 60% del valor máximo.
    4. Según la curva de titulación, se hinchan los liposomas añadiendo 35 μL de Triton X-100 al 10% e incuban a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave.
  4. Reconstitución de FtsH/LapB en liposomas
    1. Expresa y purifica las proteínas FtsH y LapB como se describióanteriormente 18.
    2. Lavar ~2 g de un adsorbente de poliestireno no polar (por ejemplo, Bio-Beads SM-2) una vez con 10 volúmenes de metanol, otra con 10 volúmenes de etanol y diez veces con 10 volúmenes de agua ultrapura. Guarda el adsorbente lavado en el buffer A a 4 °C.
    3. Para cada tubo de liposomas Triton X-100–inflamados, añade 3 μL de 500 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 22,5 μg de FtsH y 22,5 μg de LapB. Ajusta el volumen total a 1 mL con el buffer A e incuba en RT durante 1 hora con una agitación suave.
      NOTA: Durante la reconstitución de proteolisomas 21 se usaron habitualmente proporciones proteína-lípidos de 1:20 a 1:200 (peso/peso). Aquí se utiliza una proporción de 1:100.
    4. Retira el detergente por incubación secuencial con adsorbente de poliestireno no polar: 40 mg en RT durante 0,5 h, seguido de 40 mg en RT durante 1 h, luego 40 mg a 4 °C durante la noche y finalmente 40 mg a 4 °C durante 1 h.
    5. Centrifugar brevemente para pelletar el adsorbente de poliestireno no polar a 4 °C (400 × g durante 3 segundos). Transfiere el sobrenadante a tubos ultracentrífugas. Lava el adsorbente de poliestireno no polar con 1 mL de buffer A y combina el lavado con el sobrenadante. Añadir buffer adicional A a un volumen final de ~6 mL.
      NOTA: Por seguridad, los tubos de ultracentrífuga deben contener al menos 6 mL de líquido.
    6. Equilibrar los tubos y la ultracentrífuga a 250.000 × g a 4 °C durante 45 minutos en un rotor de ángulo fijo (por ejemplo, MLA-80) para pellets de proteolisomas.
    7. Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet de proteoliosomas en 70 μL de buffer A suplementado con 1 mM de TCEP.
      NOTA: El volumen final del proteoliosoma es aproximadamente 100 μL.
    8. Congela rápidamente los proteoliliposomas en nitrógeno líquido y almacena a -80 °C.
      NOTA: En este punto, el protocolo puede pausar hasta 1 mes.
  5. Análisis SDS-PAGE de proteoliliposomas
    1. Mezclar bien los proteoliliposomas y combinar 5 μL de la muestra con 5 μL de 2× tampón de carga SDS (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5% SDS, 20% glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 200 mM DTT).
    2. Carga muestras de proteoliliposomas junto a 525 ng de FtsH (correspondiente a 0,06 μM de hexámero FtsH en 20 μL) sobre un gel SDS-PAGE al 4–20%.
    3. Tiñe el gel con CBB.
    4. Escanea el gel y cuantifica la intensidad de la banda de FtsH para cada muestra. Calcular el volumen de suspensión de proteoliliposomas equivalente a 525 ng de FtsH.

3. Degradación in vitro de LpxC–Atto488

  1. Realizar ensayos de degradación in vitro en una reacción de 20 μL que contenga proteoliliposomas FtsH/LapB (correspondientes a 0,06 μM FtsH) y 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 en tampón de degradación (50 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM Mg-acetato, 5 mM ATP, 25 μM Zn-acetato, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-mercaptoetanol).
  2. Para la medición de cada concentración de sustrato, se prepara una reacción de 70 μL.
    1. Toma una fracción de 20 μL y templízala mezclándola inmediatamente con 48 μL de ácido tricloroacético (TCA) al 5% en tubos microcentrífugas de 1,5 mL (0 min). Toma la segunda y la tercera fracciones y apáralas a 10 y 20 minutos, respectivamente.
    2. Paralelamente, preparar reacciones de control correspondientes que carecen de proteoliliposomas para la resta de fondo.
      NOTA: Se recomiendan tres mediciones replicadas para obtener resultados fiables.
      Minimiza la exposición a la luz al manipular LpxC–Atto488.
      PRECAUCIÓN: El TCA es un químico altamente corrosivo que causa quemaduras graves en la piel, daños oculares permanentes e irritación respiratoria intensa al inhalarla. Maneja la situación con el equipo de protección adecuado (guantes, protección ocular, mascarilla).
  3. Incubar muestras a 37 °C durante 30 minutos para precipitar proteínas, luego centrifugar a 18.800 × g a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  4. Neutralizar las muestras transfiriendo 50 μL de sobrenadante a un tubo que contiene 60 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8,8. Mezcla bien y transfiere 100 μL a una placa negra de 96 pozos. Mide la fluorescencia usando un lector de placas con excitación a 498 nm y emisión a 520 nm.

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Resultados

Para mejorar la sensibilidad del ensayo de degradación in vitro , el sustrato LpxC fue marcado con el colorante fluorescente Atto488. El grupo éster succinimidilo de Atto488 reacciona eficientemente con los grupos amino primarios de LpxC en condiciones ligeramente alcalinas. Debido a que el tampón Tris contiene aminas primarias que interfieren con esta reacción, el LpxC purificado en tampón Tris se intercambió por tampón de fosfato mediante filtración en gel antes de ser marcado...

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Discusión

El primer paso crítico de este protocolo es el etiquetado Atto488 de LpxC. Un marcado moderado es fundamental para medir con precisión la actividad de degradación in vitro . Según nuestros experimentos de optimización, una proporción molar de LpxC a Atto488 entre 9:1 y 3:1 es óptima. Un exceso de Atto488 provoca sobreetiquetado, lo que probablemente perturba el estado nativo de LpxC. Bajo estas condiciones, la diferencia en la degradación de LpxC–Atto488 solo por FtsH frente a F...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Toda la investigación se llevó a cabo en la Universidad de Yale. W.M. cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo los números de premio R01GM137068 y RM1GM149406, y de la Fundación Familiar Richard y Susan Smith a través del Premio Odyssey.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEHecho en casa
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Adsorbent de poliestireno no polar 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Rotor de ángulo fijo 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944Columna de filtración en gel de alta resolución 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Referencias

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Proteasa FtsHadaptador LapBreconstitución en proteoliposomasproteasa AAA+ensayo de fluorescenciahomeostasis proteicaanálisis cinético

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